Tüm Dağı ile Zebra balığı Embriyo örnekler Vitray gözlenmesi ve Analiz Daire Dağı Hazırlık In situ Melezleme

Bu prosedürün genel amacı, lekeli sabit zebra balığı embriyolarını erken gelişimsel zaman noktalarında daha iyi görselleştirmektir. Bu, ilk olarak zebra balığı embriyosunun C iki hibridizasyonunda ev montajı kullanılarak boyanmasıyla gerçekleştirilir. Daha sonra, düz montaj için bir embriyo seçilir ve bir çift ince forseps ile yumurta sarısına merkezi bir kesi yapılır, daha sonra kalan yumurta sarısı granüllerini nazikçe kazımak ve çıkarmak için kirpik aletleri kullanılır.

Son olarak, numunenin uygun şekilde görüntülenmesini sağlamak için embriyo bir slayt üzerine gliserol içine monte edilir. Sonuç olarak, düz montaj, yumurta sarısını çıkararak ve embriyoyu iki boyutlu bir preparasyonda konumlandırarak lekeli embriyoların dorsal görünümden daha iyi görselleştirilmesini sağlar. Bu tekniğin, daha genç gelişim aşamalarında sağlam embriyoların görüntülenmesi gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, düz montajın yumurta sarısı torbasını çıkararak tüm embriyonun görüntülenmesine izin vermesidir.

Bu yöntem, bir embriyodaki renal cinsiyet öncesi alanın alanını karakterize etmek gibi gelişimsel alandaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler, bu teknik embriyonun hassas bir şekilde ele alınmasını gerektirdiğinden ve ayrıca yumurta sarısı torbasını çıkarmak için gereken uygun basınç miktarını öğrenmek zaman alabildiğinden, mücadele eder. Bu prosedürü gösteren, kanat laboratuvarında yüksek lisans öğrencisi olan ben, Zoe ve Amanda olacak.

Embriyoları topladıktan, sabitledikten ve boyadıktan sonra, metin protokolüne göre, bir X-P-B-S-T ile düz montaj için bir embriyo seçin. Embriyoyu plastik veya cam bir petri kabına aktarın. Daha sonra çanak bir stereo mikroskop altındayken, embriyoyu yuvarlamak için ince forseps kullanın, böylece baş ve kuyruk uçları görünecek şekilde yanal bir görünüm elde edilir.

Daha sonra, embriyoyu sabit tutmak için ince forseps kullanın ve embriyonun başı ile kuyruğu arasında merkezi olarak bulunan bir konumda yumurta sarısında bir kesi yapmak için ikinci bir set kullanın. Daha sonra ince forsepslerle meşe hücre boşluğundan yumurta sarısını çıkarın. Bir ila iki damla XPBS kullanarak embriyodan başıboş yumurta sarısını durulamak için bir X-P-B-S-T kullanın.

Embriyoyu düz bir cam slayta aktarın. Embriyoyu, cam slayta karşı düz bir konumda kalacak şekilde tamponun kenarına sürükleyin. Embriyoyu sabitlerken, yumurta sarısı granüllerini çıkarmak için ventral yüzeyi nazikçe kazımak için bir kirpik aleti kullanın.

PBST çözeltisi fazla yumurta sarısı ile darmadağın olursa veya buharlaşmaya başlarsa, bir ila iki taze damla ekleyin ve embriyoyu bu taze tampona sürükleyin. Yumurta sarısı tatmin edici bir şekilde çıkarıldıktan sonra, son bir durulama için embriyoyu nazikçe bir PBST Petri kabına geri aktarın. Daha sonra embriyoyu %100 gliserol içeren bir Petri kabına aktarın ve beş dakika inkübe edin.

Embriyoyu bir cam lam üzerine monte etmek için temiz bir cama aktarın. Bir ila iki damla %100 gliserol ekleyin ve ventral yumurta sarısı tarafı cam slayta bakacak şekilde konumlandırın. Bir kirpik aleti kullanarak, embriyoyu gliserol damlasının kenarına sürükleyin, böylece kaymaya karşı düz bir konumda kalır.

Embriyonik eksen kavisliyse, düz bir şekilde konumlandırılabilmesi için gerginliği azaltmak için kalan yumurta sarısında nazikçe küçük kesikler yapmak için ince forsepsleri kullanın. Slaytta. 18'e 18'lik bir cam kapak kaymasının dört köşesine küçük modelleme killeri yerleştirin.

Gliseroldeki hava kabarcıklarını en aza indirmek için kapak fişini açılandırarak kapak fişini yavaşça embriyonun üzerine yerleştirin. Son olarak, cam arasındaki boşluğu doldurmak ve sürüklenmeyi ortadan kaldırmak için kapak kaymasının yan tarafına ek bir %100 gliserol damlası ekleyin, burada gösterilen görüntü için bir stereo veya bileşik mikroskop kullanın. Böbreğe yol açan gelişmekte olan böbrek progenitörlerini etiketlemek için iki renk dileği ile birlikte bir prob kombinasyonu kullanıldı ve embriyolar erken dönemde düz bir şekilde monte edildi.

Bu nedenle, akar aşamaları, böbrek progenitörleri, kırmızı ile gösterilen delta C'yi eşzamanlı olarak ifade eden parial mezodermi çevreleyen PAX iki A transkriptinin ekspresyonu ile U şeklinde bir modelde sınırlandırılır. Delta C, C crox 20 ile birlikte etiketlendiğinde, böbrek progenitörlerinin bir rostral alt alanı, PAX iki a, SLC dört A dört, SLC 12 A üç ve S-M-Y-H-C bir'in delta C analiz ekspresyonunu ifade eden ortaya çıktı. Böylece akar evresi, tüm renal progenitör alanın PAX iki A ile haritalanmasını sağlar ve rostral alt alandaki bir hücre alt kümesinin SLC dört A dört eksprese ettiğini ortaya çıkardı.

Bu, SLC 12 A üçünü ifade eden renal progenitörlerin coddle alt alanı ile örtüşmedi. Bu şekilde, retinoik asidin biyosentezi için gerekli olan Retin Retinaldehit dehidrojenaz iki geninde mutasyonlara sahip embriyolar veya DEAB ve ALD H inhibitörü ile tedavi edilen embriyolar, sırasıyla WT bir A'nın azaltılmış veya iptal edilmiş ekspresyonu ile gelişmiştir, bu da düz montaj preparatı ile iki renkli dileğin organogenez sırasında hücresel alanların incelenmesi için değerli olduğunu göstermektedir. Genetik mutasyonlara sahip zebra balıklarında veya kimyasal olarak küçük moleküllere maruz kaldıklarında Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde uygulanırsa 10 ila 15 dakika sürebilir.

Bu prosedürü takiben, böbrek segmentlerinin sınırlarının nerede olduğu gibi ek soruları yanıtlamak için görüntüleme gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir. Videoyu izledikten sonra, yumurta sarısının çıkarılmasıyla istenen yapıları daha iyi görselleştirmek için lekeli bir zebra balığı embriyosunun nasıl düz bir şekilde monte edileceğini iyi anlamış olmalısınız.