Name: Tüm Dağı ile Zebra balığı Embriyo örnekler Vitray gözlenmesi ve Analiz Daire Dağı Hazırlık In situ Melezleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-17T16:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 36 s
Description: Keşfedin zebra balığı embriyolarında düz montaj tekniği ile WISH boyama sonrası yapıların görselleştirilmesi. Sarı kesenin çıkarılması embriyonik gelişimi ve organogenez araştırmalarını kolaylaştırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma kısmen aşağıdaki her birinden RAW için fon tarafından desteklenmiştir: NIH hibe K01 DK083512, DP2&#39;deki OD008470 ve R01 DK100237; 5-FY12-75 Dimes Basil O&#39;Connor Başlatan Akademik hibe # Mart; Bilim ve Biyolojik Bilimler Bölümü Notre Dame College Üniversitesi&#39;nden fonları başlar. Biz özellikle kök hücre araştırmaları teşvik etmek Notre Dame Üniversitesi cömert bir hediye kazandırdığı tüm Gallagher Ailesi ile birlikte, Elizabeth ve Michael Gallagher teşekkür etmek istiyorum. Maliyeciler çalışma tasarımı, veri toplama ve analizi, yayınlamak kararı, ya da yazının hazırlanmasında herhangi bir rolü vardı. Biz onların destek için Biyolojik Bilimler Bölümü kurmayları teşekkür ederiz ve bizim Zebra balığı koloni bakımı ve refahı onların üstün özveri için Notre Dame Zebra Araştırma Merkezi. Son olarak, biz, onların yorumları, tartışmaları ve bu iş hakkında anlayışlar bizim araştırma laboratuvarında üyelerine teşekkürde doğal olarak araştırma için en mükemmel kirpik araçlar yapmak için kedi bıyık döken sağlamak için Marigold (Maripooka) ve Zinnia Wingert gibi.

<ol><li>Laale, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+and+use+of+zebrafish%2C+Brachydanio+rerio+in+fisheries+research.+A+literature+review%5BTitle%5D)+AND+%22J+Fish+Biol%22%5BJournal%5D)">The biology and use of zebrafish, Brachydanio rerio in fisheries research. A literature review.</a> J Fish Biol. 10, 121-173 (1977).</li>
<li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+human+disease%3A+zebrafish+swim+into+view%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).</li>
<li>Goldsmith, J. R., Jobin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Think+small%3A+zebrafish+as+a+model+system+of+human+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Think small: zebrafish as a model system of human pathology.</a> J Biomed Biotechnol. 2012, (2012).</li>
<li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496, 498-503 (2013).</li>
<li>Drummond, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kidney+development+and+disease+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Kidney development and disease in the zebrafish.</a> J Am Soc Nephrol. 16, 299-304 (2005).</li>
<li>Wingert, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cdx+genes+and+retinoic+acid+control+the+positioning+and+segmentation+of+the+zebrafish+pronephros%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet+3%22%5BJournal%5D)">The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros.</a> PLoS Genet 3. , (1922).</li>
<li>Wingert, R. A., Davidson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+nephrogenesis+involves+dynamic+spatiotemporal+expression+changes+in+renal+progenitors+and+essential+signals+form+retinoic+acid+and+irx3b%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Zebrafish nephrogenesis involves dynamic spatiotemporal expression changes in renal progenitors and essential signals form retinoic acid and irx3b.</a> Dev Dyn. 240, 2011-2027 (2011).</li>
<li>Santoriello, C., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hooked%21+Modeling+human+disease+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Hooked! Modeling human disease in zebrafish.</a> J Clin Invest. 122, 2337-2343 (2012).</li>
<li>Tamplin, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+screening+in+zebrafish%3A+swimming+in+potential+drug+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22WIREs+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Small molecule screening in zebrafish: swimming in potential drug therapies.</a> WIREs Dev Biol. 1, 459-468 (2012).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book.+3rd+ed%22">The Zebrafish Book. 3rd ed</a>. , University of Oregon Press. Eugene. (2000).</li>
<li>Kimmel, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).</li>
<li>Thisse, C., Thisse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+in+situ+hybridization+to+whole-mount+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos.</a> Nat Protoc. 3, 59-69 (2008).</li>
<li>Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+mount+RNA+in+situ+hybridization+on+zebrafish+embryos%3A+probe+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc.+3%2C+DOI%3A+10.1101%2Fpdb.prot5036%22%5BJournal%5D)">Whole mount RNA in situ hybridization on zebrafish embryos: probe synthesis.</a> CSH Protoc. 3, DOI: 10.1101/pdb.prot5036. , (2008).</li>
<li>Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+mount+RNA+in+situ+hybridization+on+zebrafish+embryos%3A+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc.+3%2C+DOI%3A+10.1101%2Fpdb.prot5037%22%5BJournal%5D)">Whole mount RNA in situ hybridization on zebrafish embryos: hybridization.</a> CSH Protoc. 3, DOI: 10.1101/pdb.prot5037. , (2008).</li>
<li>Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+mount+RNA+in+situ+hybridization+on+zebrafish+embryos%3A+mounting%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc.+3%2C+DOI%3A+10.1101%2Fpdb.prot5038%22%5BJournal%5D)">Whole mount RNA in situ hybridization on zebrafish embryos: mounting.</a> CSH Protoc. 3, DOI: 10.1101/pdb.prot5038. , (2008).</li>
<li>Machluf, Y., Levkowitz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+mRNA+expression+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Visualization of mRNA expression in the zebrafish embryo.</a> Methods Mol Biol. 714, 83-102 (2011).</li>
<li>Brend, T., Holley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+whole+mount+high-resolution+double+fluorescent+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Zebrafish whole mount high-resolution double fluorescent in situ hybridization.</a> J Vis Exp. 25 (25), (2009).</li>
<li>Lauter, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-color+fluorescent+in+situ+hybridization+in+the+embryonic+zebrafish+brain+using+differential+detection+systems%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Two-color fluorescent in situ hybridization in the embryonic zebrafish brain using differential detection systems.</a> BMC Dev Biol. 11 (43), 1-11 (2011).</li>
<li>Lauter, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+fluorescent+in+situ+hybridization+to+define+abutting+and+overlapping+gene+expression+in+the+embryonic+zebrafish+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Multicolor fluorescent in situ hybridization to define abutting and overlapping gene expression in the embryonic zebrafish brain.</a> Neural Dev. 6 (10), 1-13 (2011).</li>
<li>Lagendijk, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revealing+details%3A+whole+mount+microRNA+in+situ+hybridization+protocol+for+zebrafish+embryos+and+adult+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Open%22%5BJournal%5D)">Revealing details: whole mount microRNA in situ hybridization protocol for zebrafish embryos and adult tissues.</a> Biol Open. 1, 566-569 (2012).</li>
<li>Haffter, P., Nüsslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+scale+genetics+in+a+small+vertebrate%2C+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Large scale genetics in a small vertebrate, the zebrafish.</a> Int J Dev Biol. 40, 221-227 (1996).</li>
<li>Galloway, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+Gata1+but+not+Gata2+converts+erythropoiesis+to+myelopoiesis+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Loss of Gata1 but not Gata2 converts erythropoiesis to myelopoiesis in zebrafish embryos.</a> Dev Cell. 8, 109-116 (2005).</li>
<li>Barrallo-Gimeno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+survival+and+differentiation+in+zebrafish+depends+on+mont+blanc%2Ftfap2a+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Neural crest survival and differentiation in zebrafish depends on mont blanc/tfap2a gene function.</a> Development. 131, 1463-1477 (2003).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Zebra balığı son yıllarda araştırma toplum genelinde son derece değerli bir model organizma olduğu kanıtlanmıştır. Zebra balığı yüksek omurgalıların bu genetik koruma önemli bir derecesi sergileyen ve onların anatomi, üreme ve yaşam döngüsü ile ilgili avantajları deneysel analizler, bu türün çok müsait olun. Ayrıca, Zebra balığı için geçerli moleküler tekniklerin ilerlemesi daha fazla bilimsel araştırma, bu model organizmaların kullanımını teşvik etmiştir. Örneğin, transgenik zebrafish hatları büyük bir çeşitlilik hastalığın ilerlemesini incelemek ve organogenezis dahil gelişim kilit mekanizmaları altında yatan birçok temel soruları cevaplamak için oluşturulan edilmiştir. Buna göre, hastalık ve gelişim araştırma hem de zebrafish dinamik kullanımına dayalı, hücre etiketleme yöntemleri ve sinyal ölçümü veri analizleri önemli bir yönü vardır. Da floresan kullanılması yöntemleriantikorlarının verilmesinin transgenik Zebrafish protein ekspresyonunu tespit etmek için kullanılabilir, araştırmacılar, tipik olarak bir sabit, transgenik olmayan zebra balığı örnekteki gen transkriptlerinin uzaysal lokalizasyonu incelemek isteyen 12-16 gibi standart prosedürlere dayanır. Aslında, dilek biyoloji 16 en yaygın olarak kullanılan tekniklerden biri olan ve genetik mutasyonların, kimyasal ve genetik pertürbasyonların fenotipinin karakterize etmek için kullanılan önemli bir araçtır. Bununla birlikte, DİLERİZ potansiyel tuzaklar ve zorluklar bir dizi ile ilişkilidir. Antisens ribroprobe özgüllüğünü teyit etmek için, sens riboprobları antisens riboprob boyanma özgünlüğünü değerlendirmek için bir kontrol olarak kullanılabilir. 4 ve 5 bölümleri Etiketleme ve fluoresan etiketli prob, ardından bir dioksijenin-etiketli prob tespiti amacıyla sunulmuştur, ancak bu düzen tersine çevrilebilir. Tipik haliyle, daha zayıf sinyaller (daha düşük sentezleme seviyelerine sahip genler) en dioksijenin-etiketli problar ve bu leke ile tespit ediliralgılama ve kırmızı alt-tabaka kullanılarak güçlü bir sinyal (daha bol eksprese edilmiş gen) lekelenmesi ardından mor bir alt-tabaka, ilk geliştirdi. Iki renkli reaksiyonlar gerçekleştirilir olacak Ancak, bu etiket ve yüzeylerde çeşitli kombinasyonları veri toplama ve analiz için en uygun olan prosedürü bulmak için test edilmesi tavsiye edilir. Buna ek olarak, zaman, 4-5 24 saat sonra döllenme daha erken embriyolar için tasarlandı bölümlerde verilmektedir antikor inkübasyon ve yıkama bloke edilmesi için Resim; büyük embriyolar ile bu aynı adımların uzun aralıklarla numune üzerinde tuz birikimine yol açabilir. Standart Zebra balığı embriyo DİLERİZ sorun giderme için kapsamlı ipuçları zaten literatürde 12-16 belgelenmiştir. Muhtemelen en sık ikilem yüksek arka plan. Biz gerekirse gecede MABT &#39;süper-yıkama&#39; eklenmesi, bizim deneyim olsa da, Adım 4.7 15-20 yıkar MABT yıkar sayısının artırılması tavsiye4.8 Adım devam etmeden önce, 10 ya da daha fazla kısa MABT yıkama ile bağlantılı olarak kullanıldığında çok iyi sonuçlar verir. Başka bir örnek ikilem uzun riboprobes ile oluşabilir kötü prob infiltrasyon vardır. Alkali hidroliz yoluyla aşama 3.6 aşağıdaki Riboprobe Kırkım bu karşı olabilir. Genç örnekleri ile bizim deneyim, sonda kesme genellikle gerekli değildir. Ancak, bir bu bir DİLERİZ deney sonucuna ilişkin faktörler olabilir gibi parametreleri göz önünde tutmalı ve biz gerektiği gibi kendi içinde VVISH için deneysel parametreleri geliştirmek için toplumda zaten kamuya açık bu yararlı sorun giderme talimatları incelenmesini öneririz araştırma 12. Geleneksel DİLERİZ teknikleri 12-16 ek olarak, DİLERİZ metodolojileri ve formüle edilmiş alternatif protokoller gelişmeler sürekli bir çıkışı olmuştur. Bunlar örneğin, floresan kullanımıyla olarak sinyal tespiti için yeni yollar arasında,Cence 17-19 microRNA 20 lokalizasyonunu sağlayacak yöntemler ile ilgilidir. Leke (ler) kolayca istenen bir zaman noktasında ilgi örnek içinde görüntülendi olamaz eğer öyle olsa bile, geçerli hücre etiketleme yöntemleri yapılmış birçok gelişmelere rağmen, bu prosedürlerin etkinliği etkisiz. Bu sınırlama, potansiyel olarak bu zamanlarda ortaya çıkan çeşitli gelişimsel süreçlerin anlayışımıza boşluklar yol açabilecek, bu zebrabalıkları ontogenezimizin erken embriyonik aşamalarında ilgilidir, özellikle araştırmacılar için sorunludur. Normal Zebra balığı gelişimi sırasında, yumurta sarısı kesesi giderek embriyo yaş 11 olarak boyutu azalacak. Embriyo onun bitişiğindeki sarısı kesesinde kıyasla daha büyük olduğu için, bu nedenle, bu sonraki gelişim evreleri (&gt; 24 saat sonra döllenme) de, DİLERİZ boyama analiz etmek oldukça basittir. Bununla birlikte, bu (erken somitogenesis için kuyruk tomurcuk aşamasından durum olmadığında embriyonikopak sarısı kese bazen lekenin görselleştirme karanlık bir yere kütlesi) sarısı etrafında konumlandırılmıştır. Sonuç olarak, düz bir montaj metodu (Şekil 1 ve Şekil 2&#39;de gösterilmektedir), erken embriyo zebra balığı numunelerin karakterizasyonu ile ilgili görüntü ve veri analizi sorunları hafifletmeye yardımcı olmak için geliştirilmiştir ve genel olarak izole edilmiş genetik mutasyon sistematik fenotipleme beri kullanılmaktadır Büyük ölçekli ilk genetik ekranlarında 21. Düz montaj tekniğinin gelişiyle bu yana, erken gelişim evrelerinin analizi önemli ölçüde geliştirilmiştir. Sarısı embriyo kaldırılır sonra, görüntüleme için istenen yönde bir cam slayt embriyo düz koymak mümkündür. Bu iki boyutlu pozisyon örnek döndürmek için olan ihtiyacı ortadan kaldırır, aynı anda tüm embriyo görüş sağlar. Çok sayıda doku gibi embriyo geniş etki alanları bulunurkan ve böbrek oluşturan ön-maddeleri. Ayrıca, tek tek seferde birkaç farklı gelişen dokuları karşılaştırmak gerekebilir. Düz montaj aynı anda böyle hücre gruplarının tüm etki alanı görüntülemek için, ve böylece büyük ölçüde böyle bir doku veya hücre sayımları için bir alan ölçümü olarak quantifications yardımcı olabilir araştırmacı sağlar. Bu teknik sonuçta Hematopöz, nöron ve organogenezi altında yatan önemli gelişim çeşitli mekanizmalar ile ilgili birçok keşifler için kurşun yardımcı olmuştur. Böylece, bir zamanlar hakim, araştırmacılar için bu basit tekniği için uygulamalar çok önemli. Örneğin, hematopoez sırasında soy seçim inceleyen bir çalışmada, yassı hücre gruplarının 14 ve 18 aşamaları (ss) at zebra balığı embriyoların preparatlar monte arasındaki pu.1 çinko parmak transkripsiyon faktörünün ifadesi desen meydana gelen değişiklikleri göstermek için kullanılmıştır vahşi tip ve GATA1 morfolino embriyolar 22 enjekte edilir.Bu yöntem, GATA1 büyük olasılıkla bu zaman noktasında yaklaşık ara hücre kütlesinin (ICM) içinde pu.1 ekspresyonunu düzenleyen olduğunu gösteren, 18 ss bir genişletilmiş pu.1 etki saptanmasını sağlamıştır. - / - Gtpbp1 ve epsin dahil olmak üzere farklı genlerin eritroid için boyandı ilave sabit monte edilmiş embriyolar GATA1 edildi vlt mutantlar bu genlerin ekspresyonunda bir kayıp gösterdi. Ileri analizler biklf ve gata faaliyet bağımsız olduğu bilinen testhymin gibi erythoid genlerin ifadesinde hiçbir değişiklik gösterdi. Bu nedenle, bunların diğer deney sonuçları ile birlikte, bu GATA1 miyelo-eritroid soyu içinde hücrelerinin farklılaşmasının düzenlenmesinde gerekli olduğu ortaya çıkmıştır. Nöral krest gelişim çalışmada, düz bağlar bir çalışmada (mob m610) mutantlar mont blanc Crestin ifadesini incelemek için kullanılmıştırMont Blanc ve tfap2a gen fonksiyonu 23 rollerini inceleyerek. 10 ve 20 ss de, Crestin ifadesi tamamen kafasına iptal edildi ve sonuçta Mont Blanc önemi ve tfap2a düzenleme üzerinde sonuçlandırmak için bu grubu yardım, normal yabani tip ifadesine göre çete m610 mutantların gövde bölgesinde azaldı sinir ucu oluşumu esnasında. Buna ek olarak, organogenez bakımından, düz bağlar pronephros olarak bilinen Zebrafish embriyonik böbrek gelişimi esnasında erken projenitör renal alanında belirgin etki varlığı keşif, sağlamıştır. Zebra balığı embriyosu böbrek atalarıdır pronephros oluşturan nefron işlevsel birimler yol vermek nasıl çalışma korunmuş ve henüz anatomik basit sistemi, nefrogenezisi 6,7 olarak bilinen bir işlem (Şekil 4) sağlar. Düz montaj analizi yeniden belge alanları için yararlı olmuşturnal atalarıdır ve daha önce bilinmeyen idi (Şekil 5), 6,7 desenlendirme pronephros sırasında RA sinyal değişikliklerin sonuçlarını incelemek. Birlikte ele alındığında, bu örnekler bu düz normal gelişimi ve hastalıklı halleri sırasında meydana gelen çeşitli süreçlerin çalışmaya bağlama protokolünü için çok geniş bir uygulama gerçekten var olduğunu göstermektedir. Kavramsal olarak, bu düz montaj prosedürü genel olarak oldukça basittir. Ancak, bu yöntemi ana için gerekli incelik manipülasyonlar ve derecesi görsel gösteri yokluğunda efendisine oldukça zor olabilir. Dolayısıyla, bu protokol araştırmacılar, daha iyi bu tekniği gerçekleştirmek ve doku kullanımı optimize edebilirsiniz reaktifler bizim tavsiye paylaşmak için nasıl anlamak için fırsat Zebrafish modeline yeni özellikle, etkinleştirmek için derlendi. Biz bu protokol sonuçta toplumda diğerleri u olmak için en ideal örnek koşulları rafine izin umuyoruzsed prim görüntüleme, veri analizi ve yayınlarda sonuçlarının iletişim için. Sonuçta, bu deney sonuçlarının sunumu belirsiz, hangi erken embriyonik dönemde zebrafish anatomik engelleri aşmak için araştırmacılar etkinleştirmek ve bu basit ama önemli teknik kullanımı ile bu çözmelidir.

Zebra balığı, Br.rerio, gelişimsel biyoloji çalışmada yaygın olarak kullanılan bir organizma haline gelmiştir. Zebra balığı ailesine Cyprinidae ait bir tropikal tatlı su omurgalı türler vardır. Kolayca elde edilebilen ucuz ve 1 bakımı kolay olduğu gibi Zebra başlangıçta, potansiyel su kirleticilerin tehlikeleri hakkında bilgi elde etmek için çevresel araştırma için kullanıldı. Son otuz yılda, Zebra balığı nedenlerle bir dizi için bir genetik uysal omurgalı model sistem olarak kabul haline gelmiştir. Zebra balığı memeliler 2,3 gibi yüksek omurgalılar ile anatomik ve fizyolojik koruma yüksek düzeyde göstermektedir. Yeni genom dizisi açıklama insan genlerinin yaklaşık% 70&#39;inin en az bir Zebrafish muadili 4 sahip olduğunu ortaya koymuştur. Örneğin, böbrek gelişimi esnasında önemli bir rol oynayan birçok ortolog genler bu türlerin 5-7 arasında tespit edilmiştir. Bu drahücresel ve moleküler biyoloji açısından koruma matik derecesi zebrabalıkları 8 insan hastalıkları geniş bir yelpazede için modeller oluşturmak için araştırmacılar sağladı ve Zebrafish kimyasal genetik ekranlarını 9 kullanarak potansiyel ilaç tedavileri tanımlamak için değerli bir araç haline gelmiştir. Ayrıca, Zebra balığı bir model değil, sadece karmaşık bir gelişimsel süreç ve insanlarda görülen hastalık durumlarında çeşitli özetlemek, ama birkaç ek özellikler de embriyolojik çalışmalar için bir model organizma olarak itiraz yükseltmek mümkün. Zebra balığı yumurtlayarak çoğalan ve gübreleme 10 başlangıcından embriyoların kolay erişim sağlayan araştırmacılar yayın yumurtlaması ile ürerler. Diğer avantajlar embriyo boyutu, şeffaflık ve hızlı, dış gelişme 10 içerir. Ayrıca, Zebra balığı yetişkin yüksek doğurganlığını sahip ve tipik 200-500 arasında değişir nispeten büyük debriyaj boyutlarda üretimhaftada, sonuçta kolaylıkla 9 ile böyle bir fenotip bazlı kimyasal ekranlar gibi yüksek verim deneyleri, gerçekleştirmek sağlayan araştırmacıların. Hatta bu yüzden, Zebra balığı modeli tarafından sergilenmektedir avantajları bolluk rağmen, analiz ve erken gelişim evrelerinde elde edilen deneysel sonuçların iletişim ilgilendirmeyen zorluklar vardır. Bazı durumlarda, Zebra balığı embriyo doğasında anatomisi kişinin verilerinin görselleştirme belirsiz olabilir. Geliştirme 11 ilerledikçe Döllenme sonrasında ilk hücre bölünmesi olayları çok maruz kalır. Gastrulasyon sonra, embriyonik aks bu sarısı 11 etrafında sarılır ve bu şekilde, tailbud aşama (10 HPF) ortaya çıkmaktadır. Daha sonraki gelişme bölütleme dönem boyunca ilerledikçe, gövde kütle yetişen ve aynı zamanda eksenel uzama ile uzatacaktır sarısı bir kısmı ile birlikte bir kuyruk kendi merkezi sarısı kese kütlesinden dışarı uzanan şekilde11.. Tailbud ve 20 somite aşamasında (19 hpf) arasında, örneğin VVISH gibi çeşitli boyama protokollerinin kullanımı sonra belirli gelişim özelliklerini gözlemlemek çalışır, hem de borçların embriyo ve donukluk geometri görselleştirmek ve fotoğraf için zor olabilir yolk kesesi. Bu sorunları ortadan kaldırmak için bir yol sarısı kaldırmak ve daha sonra, daha basit bir şekilde analiz edilebilir iki boyutlu bir numune içine embriyo düzleştirmek etmektir. Aşağıdaki protokol ve video kaynakları başarıyla deyolk ve düz bir veya iki-renkli DİLERİZ boyanma örneği kullanılarak, tespit ve boyama aşağıdaki bir embriyo monte etmek nasıl bir kılavuz sağlar. , WISH korunmuş örneklerinde spesifik nükleik asitlerin saptanmasını mümkün kılan ve böylece dokularda tespit edilecek gen ekspresyonunun yer (ler) için izin veren yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. , WISH teknikler yaygın olarak tarif edilmiştir ve çeşitli renk alt-tabakalar aynı zamanda ile yapılabilir griporescent algılama sistemleri 12-20. Burada gelişme tailbud ve segmentasyon aşamaları arasında Zebra balığı embriyolarının için kullanılan bizim modifiye DİLERİZ protokol sağlar. Aşağıdaki protokol Başlangıçta belirtildiği gibi alternatif DİLERİZ protokolleri, ancak, burada anlatılan düz montaj prosedürü ile uyumludur. Buna ek olarak, düz bir montaj bu protokol açıklanmayan bütün montaj immünohistokimya veya hücre soyu izleme etiket gibi mevcut görselleştirme teknikleri, herhangi bir sayı ile bağlantılı olarak kullanılabilir. Genel olarak, düz montaj tekniği iyi zebrabalıkları embriyonik gelişimin erken safhalarında ile deneylerden elde edilen verilerin üstün analiz ve sunum etkinleştirebilirsiniz.

<table><tbody><tr><td>50 X E3</td><td></td><td></td><td>250 mM NaCl, 8.5 mM KCl, 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4 damıtılmış suda. Kontaminasyonu önlemek için metilen mavisi (1 x 10-5 M) (Sigma M9140) ile takviye edin.</td></tr><tr><td>1 X E3</td><td></td><td></td><td>50 X E3'ü damıtılmış suda seyreltin.</td></tr><tr><td>Örgü çay süzgeci</td><td>İngiliz Çay Dükkanı</td><td>SKU # ASTR_KEN, MPN # 1705</td><td></td></tr><tr><td>Embriyo kuluçka kabı</td><td>Falcon</td><td>35-1005</td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipeti</td><td>Samco</td><td>202, 204</td><td></td></tr><tr><td>Düz tabanlı mikrosantrifüj tüpü</td><td>VWR</td><td>87003-300; 87003-298</td><td></td></tr><tr><td>Cam şişe</td><td>Wheaton</td><td>225012</td><td></td></tr><tr><td>1x PBST</td><td></td><td></td><td>1x PBS'de% 0.1 Tween-20 deterjan, 10x PBS'nin damıtılmış suda seyreltilmesiyle yapılır.</td></tr><tr><td>Tween-20 stok</td><td>Amerikan Biyoanalitik</td><td>AB02038</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Amerikan Biyoanalitik</td><td>AB11072</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Elektron Mikroskobu Hizmetleri</td><td>19210</td><td></td></tr><tr><td>%4 PFA/1X PBS</td><td></td><td></td><td>%4 PFA'yı (a/h) 1x PBS'de çözün, çeker ocakta sıcak bir plaka üzerinde kaynatın. Kullanmadan hemen önce çözdürün ve stokları tekrar dondurmayın.</td></tr><tr><td>Filtre sterilizasyon ünitesi</td><td>Corning</td><td>430516</td><td>1 L filtre sistemi, 0.45 & mu; m CA</td></tr><tr><td>MeOH</td><td>Sigma</td><td>34860-4L</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaz K</td><td>Roche</td><td>03-115-879-001</td><td>Proteinaz K stoğu (10 mg / ml) yapmak için damıtılmış suda çözün ve alikotları -20 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>HYB+</td><td></td><td></td><td>%50 formamid, 5x SSC, %0.1 Tween-20, 5 mg/ml maya torula RNA, 50 &mu; g/&mu; l heparin</td></tr><tr><td>DIG / FLU etiketli riboprob in vitro transkripsiyon reaksiyonu reaktifleri</td><td>Roche</td><td>11175025910; 11685619910</td><td>Üretici talimatlarına bakın.</td></tr><tr><td>SP6 RNA polimeraz</td><td>Roche</td><td>11487671001</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA polimeraz</td><td>Roche</td><td>10881775001</td><td></td></tr><tr><td>T3 RNA polimeraz</td><td>Roche</td><td>11031171001</td><td></td></tr><tr><td>RNase 1 inhibitörü</td><td>Roche</td><td>3335399001</td><td></td></tr><tr><td>DNaz 1 inhibitörü, 10x DNaz 1 tamponu</td><td>Roche</td><td>4716728001</td><td></td></tr><tr><td>Glikojen</td><td>Roche 10901393001</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanol (EtOH)</td> <td>Sigma</td><td>E7023</td><td>Aliquot% 100 EtOH ve% 70 EtOH (moleküler dereceli su ile seyreltilmiş) içeren 50 ml alikotlar ve -20 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>Moleküler sınıf damıtılmış su</td><td>Mediatech</td><td>25-055-CM</td><td></td></tr><tr><td>Su Banyosu</td><td>Termo</td><td>51221073</td><td>Model 2831</td></tr><tr><td>Nanodrop Termo</td><td></td><td>ND-2000c</td><td></td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Amerikan Biyoanalitik</td><td>AB00600</td><td>-20 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>20x SSC</td><td>Amerikan Biyoanalitik</td><td>AB13156</td><td></td></tr><tr><td>MAB</td><td></td><td></td><td>2 L formülü: 1,5 L damıtılmış suya 23,2 g maleik asit, 17,5 g NaCl, 55,0 g Trisma bazı karıştırın, ardından 8 ml 1M Tris-HCl pH 9.5 ekleyin ve ardından 2 L'ye kadar doldurun.</td></tr><tr><td>MABT</td><td></td><td></td><td>MAB +% 0.1 (h / h) Tween-20</td></tr><tr><td>Blok çözeltisi</td><td></td><td></td><td>50 ml taze alikotlarda yapıyoruz: 10 ml BSA (% 10 laboratuvar stoğundan), 5 ml FCS (stoktan) ve 35 ml MABT. Kullanılmayan bloğu 4 > derecede kaydedin; Antikor çözeltisi için kullanmak üzere C. Not: BSA ve FCS hisselerini 37 > C&ndash; Daha yüksek bir sıcaklıkta çözerseniz, kalın bir jel haline gelirler (kullanmayın).</td></tr><tr><td>FCS (fetal buzağı serumu),</td><td>Invitrogen</td><td>16140089</td><td>Aliquot'u 5 veya 10 ml'lik porsiyonlarda stoklar ve -20 ° C'de saklar.</td></tr><tr><td>BSA (sığır serum albümini) stoğu</td><td>Amerikan Biyoanalitik</td><td>AB00448</td><td>BSA pullarını oda sıcaklığında hızlı karıştırarak çözerek MAB içinde seyreltilmiş% 10'luk bir stok yapın, ardından -20 ° C'de 10 ml alikot saklayın.</td></tr><tr><td>Anti-digoxigenin antikoru</td><td>Roche</td><td>11-093-274-910</td><td>4 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>Anti-floresein antikoru</td><td>Roche</td><td>11-426-338-910</td><td>4 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>12 kuyulu boyama kabı</td><td>BD-Falcon</td><td>35-3225</td><td></td></tr><tr><td>Ön boyama tamponu</td><td></td><td></td><td>100 mM Tris pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, %0.1 (h/h) Tween-20. Her zaman taze yapın: birkaç gün içinde çökelir.</td></tr><tr><td>Boyama solüsyonu-mor</td><td></td><td></td><td>İhtiyaç duyulan her 10 ml için: 45 & # 956 ekleyin; NBT'nin l'si ve 35 &#956; l BCIP'den taze ön boyama tamponuna (embriyo örneklerinde kullanılmaz).</td></tr><tr><td>Boyama solüsyonu-kırmızı</td><td></td><td></td><td>İhtiyaç duyulan her 10 ml için: 31.5 & # 956 ekleyin; l INT ve 35 &#956; l BCIP'den taze ön boyama tamponuna (embriyo örneklerinde kullanılmaz).</td></tr><tr><td>NBT hisse senedi</td><td>Sigma</td><td>N6876</td><td>-20 °C'de saklanır; C; % 70 DMF,% 30 su içinde 50 mg / ml seyreltilmiş toz.</td></tr><tr><td>INT stoğu</td><td>Sigma</td><td>I8377</td><td>-20 &°C'de saklanır; C; % 70 DMF,% 35 su içinde 55 mg / ml seyreltilmiş toz.</td></tr><tr><td>BCIP stoğu</td><td>Sigma</td><td>B8503</td><td>-20 &°C'de saklanır; C; % 100 DMF'de 50 mg / ml seyreltilmiş toz.</td></tr><tr><td>DMF (dimetilformaldehit)</td><td>Amerikan Biyoanalitik</td><td>AB00450</td><td></td></tr><tr><td>Glisin</td><td>Sigma</td><td>G8898</td><td>0.1 M glisin, pH 2.2</td></tr><tr><td>Küçük plastik Petri kabı</td><td>Corning</td><td>430589, 430588</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Sigma</td><td>G7893</td><td></td></tr><tr><td>İnce forseps</td><td>Roboz</td><td>RS-1050</td><td>Dumont Cımbız Desen #55</td></tr><tr><td>Kirpik aracı</td><td></td><td></td><td>Süper yapıştırıcı kullanılarak bir pipet ucuna (P10-P1000 arasında değişen boyutlar kullanılabilir) uygun bir kirpik yapıştırılarak yapılmıştır. Doğal olarak dökülen bir insan kirpiği, doğal olarak dökülen bir hayvan bıyığı veya sırım gibi kürk manto kılı veya bir ilaç veya perakende mağazasındaki güzellik bölümünden satın alınan doğal veya sentetik bir kirpik kullanıyoruz (ekstra uzun kirpikler, pipet ucuna sabit bir şekilde monte edilmeye en uygun olanlardır). Pipet ucu, kolay kullanım için iğne tutucu (örn., Fisher 08-965-A) gibi düz bir çubuğa (8-10 cm uzunluğunda) yapıştırılmıştır. Bu ev yapımı aletlerin görüntüleri için Figure 3 bölümüne bakın.</td></tr><tr><td>Cam kaydırak</td><td>Thermo-Fisher</td><td>4445</td><td>White Frost</td></tr><tr><td>Cam lamel</td><td>Thermo-Fisher</td><td>12-540A</td><td>18 x 18 mm</td></tr><tr><td>Modelleme kili</td><td>Hasbro</td><td>Playdoh</td><td>Diğer zanaat modelleme kil ürünleri ikame edilebilir.</td></tr><tr><td>Slayt tutucu</td><td>Thermo-Fisher</td><td>12-587-10</td><td>Slaytları düz saklamak için karton tepsi.</td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Nikon</td><td>SMZ645, SMZ1000</td><td></td></tr><tr><td>Bileşik mikroskop</td><td>Nikon</td><td>80i, 90i</td><td></td></tr></tbody></table>

tüm dağı ile zebra balığı embriyo örnekler vitray gözlenmesi ve analiz daire dağı hazırlık<em&gt; in situ</em&gt; melezleme

Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

Zebra balığı embriyosu şimdi yaygın gelişimsel süreçlerinin genetik kontrolünü araştırmak ve konjenital anomaliler modellemek için temel ve biyomedikal araştırmalar için kullanılır. Yaşamın ilk gününde, Zebra balığı embriyo döllenme, bölünme, gastrulasyon, segmentasyon, ve bu tür böbrek, kalp ve merkezi sinir sistemi gibi yapıların anjiogenezis gibi pek çok gelişimsel aşamaları ilerledikçe. Embriyo yuvarlak sarısı kütle ile birlikte gelişir, çünkü küçük, zebra balığı embriyonun anatomisi bu olayların çoğu dahil dokuların görüntülenmesi ve analiz için çeşitli sorunlar ortaya koymaktadır. Böylece, doğru analiz ve tailbud ve 20 somite aşamada böyle kullanılarak boyandı gibi (sırasıyla 10 ve 19 saat sonra döllenme (hpf)) arasındaki sabit embriyonik örneklerde deneysel fenotipleri görüntüleme için bütün o, in situ hibridizasyon (DİLERİZ) monte sarısı b embriyo çıkarmak genellikle arzu edilirbütün ve bir cam slayt üzerine düz konumlandırmak için. Ancak, düz bir montaj prosedürü yerine sıkıcı olabilir. Bu nedenle, düz başarılı ve etkili bir şekilde hazırlanması çok diseksiyon tekniğin görsel gösterimi ile sağlanır almaktadır, ve aynı zamanda en uygun doku işleme yardımcı reaktifler kullanılarak yardımcı oldu. Burada, biz zebrafish embriyo gen ifadesinin bir ya da iki renk algılama için bizim DİLERİZ protokol sağlamak ve düz montaj prosedürü lekeli sabit numunenin bu örnekte yapılabilir nasıl göstermektedir. Bu, düz bir montaj protokol, zebra balığı erken gelişimi sırasında ortaya çıkan çok embriyonik yapıların çalışma geniş çapta uygulanabilir, ve sabit embriyo numuneler üzerinde yapılan diğer boyama yöntemleri ile bağlantılı olarak uygulanabilir.

Düz bir montaj protokol prosedür vücut ekseni iki boyutlu bir preparat (Şekil 1A) içine, merkezi bir yumurta sarısı oyunu sarılı olduğu normal anatomik gelen Zebrafish embriyonun dönüşümü içerir. Genç Zebrafish embriyo Tüm montaj görüntüleme embriyonik ekseni sarısı sarılı olduğu kadar doğası ile sınırlıdır. Bunun bir sonucu olarak, tam bir lateral ya da dorsal incelemeler lekeli embriyo numuneler yalnızca eksen veya belirsiz belirli dokular (Şekil 1 B) bir kısmını yakalayabilir monte edin. Buna karşılık, embriyo deyolking ve düzleşme bir kez (Şekil 1 B) görünür hale için tüm embriyonik eksen sağlar. Bu sınırlamalar bir etiket, WISH lekeli ile 13 arasındaki Somitlerin 7 bitişiğinde bulunan renal soylarının bir alt işaretleri (Mor) irx3b tespit etmek için antisens riboprobları ile etiketlenmiştir embriyo, ve myod1 (kırmızı) incelenerek gösterilmektedirSomitlerin (Şekil 1 B). Irx3b + renal progenitörlerinin alan irx3b transkriptleri yan açı ile kamera görselleştirmek için renal alan bir pratik olarak imkansız hale, merkezi sinir sistemi içinde bol olduğu için yan görünümü monte bütün olarak engellenmektedir; alan sarısı (Şekil 1 B) sarılı olduğu için embriyo bir dorsal kamera görüntüsü döndürüldüğü zaman, ayrıca irx3b + renal progenitörlerin alan sadece kısmen görülebilir. Bununla birlikte, düz bir montaj sonra aynı embriyo bir dorsal görünüşüdür irx3b + gövde ve diğer embriyonik yapılar (Şekil 1 B) boyunca Somitlerin bağlı olarak basit bir şekilde analiz edilmesi için renal progenitörlerin tüm alan sağlar. Böylece, ayrıntılı mekansal etki ideal bu yöntem ile belgelenmiş olabilir. Birkaç büyük adımlar düz montaj işleminin başarılı bir şekilde yürütülmesi olarak katılıyor. Bu techniqu gerçekleştirmek içine, sarısı topu ilk embriyo stereomikroskopta görüntülenmiştir ise böyle ince forseps bir çift ince aletler ile yapılabilir uygun embriyo (Şekil 2A), çıkartılması gerekmektedir. Sarısı topun ham ayrılmasından sonra, ince bir kirpik araç embriyo (Şekil 2B) bağlı kalmıştır sarısı granüller kazınması için kullanılmaktadır. Kalan yumurta sarısı granüllerin çıkarılması embriyonik dokuların görüntülenmesine kolaylaştırmak için yardımcı olur. Son olarak, deyolked embriyo gözlem ve yardımcıları görüntüleme yazılımı kullanılarak örnek belgeleri ve mikroskoba bağlı bir kamera sağlayan bir cam slayt (Şekil 2C), üzerinde stabil konumlandırmak için manipüle edilir. Kirpik araçları bir kolu istenirse (Şekil 3A, Malzeme masa) üzerine monte edilebilir superglue kullanarak bir pipet uygun bir kirpik birleştirilmek suretiyle inşa edilebilir ev yapımı cihazlar vardır. Farklı kirpik örnekleri üretmek için temin edilebiliruzunluğunda ve her kullanıcı düz montaj prosedürü ile deneme başlar kez farklı tercihlerini olabilir konik (Şekil 3B), açısından biraz farklı özelliklere sahip araçlar saldırmak. Kirpik numunelerinin örnekleri doğal olarak, insan kirpik döken doğal hayvan sırım gibi saç veya bıyık döken, ve nihayet piyasada mevcut kirpikler sentetik çeşitleri perakende kozmetik bölümlerinde bulunan içerir. Çevre ve bir cam slayt (Şekil 4A) üzerine yerleştirilmiş olan örnek (ler) ihtiva eden bir yerel yüksek çözünürlüklü analizi için görüntülenebilir. Prob bir arada iki renkli arzu ile erken gelişim aşamalarında yabani tip embriyo böbrek doğuran gelişmekte olan renal progenitörlerin etiket ve daha sonra düz preparasyonlar örnekleri (Şekil 4B, 4C görüntülemek üzere yapılmıştır monte etmek için kullanıldı .) Erken hücre gruplarının aşamalarında, renal progenitorlar th ile U-şeklindeki model içinde birbirinden ayrılıreşzamanlı delta C (dlc) (kırmızı) (sol sütun, Şekil 4B) 6,7 ifade paraksiyel mezoderm çevreleyen (mor) pax2a transkript eir ifadesi. DLC transkript mor bir alt-tabaka ile tespit edildi, ve arka beyin işaretleyici krox20 (kırmızı) ile bir arada etiketli zaman, daha önce de belirtildiği gibi karşılaştırıldığında, renal progenitörlerin bir rostral alt etki alanı, DLC (sağ sütun, Şekil 4B) ifade eden görselleştirilmiştir 6,7. Düz monte preparasyonlar daha sonra somitogenesis aşamaları incelemek için benzer şekilde kullanılabilir. 14 hücre gruplarının aşamada, renal belirteçler pax2a, slc4a4 ve Somitlerin (Şekil 4C) işaretleri smyhc1 (kırmızı) ile birlikte, (Mor) SLC12A3 ekspresyonunu analiz ettik. Açığa çıkarırken, bu kombinasyonlar, pax2a ile tüm renal progenitör etki eşleme sağlayacak bir alt etki alanı rostral İfade içindeki hücrelerinin bir altslc4a4a Essed ve SLC12A3 ifade böbrek atalarıdır örtüşmeyen kaudal subdomain tarafından ayırt edildi. Iki renkli DİLERİZ ve düz monte hazırlık da küçük moleküllerin 6,7 için çevresel maruziyet (Şekil 5), genetik mutasyonlar veya diğer tedirginlikler ile zebrabalıkları organogenezis sırasında hücresel etki çalışma için değerlidir. Zebra balığı NLS ve lib mutantlar aldehit dehidrojenaz 1a2 retinoik asit (RA) biyosentezi için gerekli olan bir enzimi kodlayan (eski raldh2 olarak da bilinir aldh1a2), mutasyonlar liman. RA glomerulus 6,7 olarak bilinen embriyonik böbrek kan filtre yapmak için katkı podosit hücrelerinin oluşumu da dahil olmak üzere pek çok renal hücre türlerine uygun gelişimi için gereklidir. DİLERİZ eşzamanlı t çizilmesi ile wt1a ile Podosit atalarıdır etiket yapıldıO vahşi tip embriyolarda krox20 ile smyhc1 ve arka beyin ile somitler geliştirme, mutant embriyolar, lib mutant embriyolar, ve ALDH enzim kimyasal inhibitörü, DEAB (Şekil 5) ile muamele embriyolar NLS. DEAB ile tedavi edilen embriyolar wt1a transkriptlerin bir ortadan kaldırma (Şekil 5, sağ kolon) gösterdi eksikliği aldh1a2 ifade ile Embriyolar, vahşi tip embriyolara kıyasla azaltılmış wt1a ekspresyonu gösterdi. Birlikte ele alındığında, bu temsili sonuçlar düz montaj tekniği analiz ve belge erken embriyo hassas anatomik farklılıklar, ve böylece değerli gelişim çalışmaları için uygulanacak nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51604/51604fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51604/51604fig1.jpg" /> Düz monte Prepa Şekil 1.. BakışZebra balığı embriyolarının için rasyon. Merkezi sarısı kütle düz bir yüzey üzerinde uzaklaştırıldı ve embriyo stabil bir şekilde yerleştirilmiş olduğu için A) düz bir montaj prosedür embriyonik ekseni boyunca dokuların eşzamanlı görünüm sağlar. Bir bütün montaj B) Görüntüler, lateral ve dorsal görünümlerinde lekeli embriyo WISH ve daha sonra düz bir montaj hazırlık yapıldı sonra. Embriyo irx3b (mor) ve myod1 (kırmızı) kodlayan gen transkript tespit etmek için antisens prob ile boyandı. <img alt="Şekil 2," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51604/51604fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51604/51604fig2.jpg" /> Şekil 2.. Zebra balığı embriyolarının için düz montaj prosedürünün şematik. A) ilk olarak embriyo makroskopik olarak yumurta sarısı kütlesinin bir kısmı bertaraf deyolked, daha sonra (B) ventral yüzeyi ince kalan yumurta sarısı granüller kaldırmak deyolked, veembriyo yıkadıktan sonra (C) görsel analizi ve / veya fotoğraf görüntüleme için bir cam slayt dorsal yüzü yukarı monte edilir. <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51604/51604fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51604/51604fig3.jpg" /> Şekil 3. Örnek kirpik araçları fotoğrafları ince forseps göre. A) Ev yapımı kirpik araçları görünümünün üstündeki sağlanan milimetre referans ile, bir referans. B) ince forseps yanında kirpik araçları Büyütülmüş görünüm sağlamak için bir metrik cetvel bitişik yerleştirilmiş, ince forseps bir standart çift birlikte görüntülendi . İki farklı kirpik araçları elde kirpiklerinizin işaretlemek için kullanılan yıldız (*) ile gösterilir doğal insan kirpik döken, ve çift yıldız (**) doğal döken kedi bıyık elde edilen ve kesilmiş bir kirpiği işaretlemek için kullanılan biraz kör uç olun. Her case, kirpik pipet ucu ile dişli ve kademeli bir işleme cihazına bağlı pipet için kirpik çapa / stabilize etmek için güçlü bir mühür oluşturmak için superglue birkaç kat ile tutturulmuştur. <img alt="Şekil 4," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51604/51604fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51604/51604fig4.jpg" /> Yabani tip zebrafish embriyo böbrek progenitör alanında gelişimsel değişiklikleri Şekil 4.. Karakterizasyonu. A) (B, C). B) Vahşi tip 1 embriyo, 3, 5 ve hücre gruplarının aşama verir renal progenitör alanının bileşiminin değerlendirmek için iki renkli WISH boyanarak analiz için görüntülenmiş bölgeyi gösteren şematik Slide embriyonik böbrek veya pronephros yükselir. (Mor boyanmış) transkripsiyon faktörü kodlayan pax2a (Sol sütun) Tutanaklar renal p dahil embriyo birkaç nüfusları, işaretlemekara mezodermden ortaya rogenitor alan. Çentik ligand DLC kodlayan transkript (kırmızı lekeli) paraksiyel mezodermden formu somitler işaretleyin. (Mor lekeli) dlc transkript ifadesi ve Beyin rhombomere işaretleyici krox20 (kırmızı lekeli) aynı embriyo incelendiğinde (Sağ sütun), dlc ifade Somitlerin bitişiğinde bulunan böbrek atalarıdır bir rostral alt etki görülebilir 14 hücre gruplarının aşamasında pax2a. C) Yabani tip embriyolar ile DLC birlikte boyanması sırasında obscured 1-5) ya da çift (mor bir renal işaretleyici bir kombinasyonu ile üçlü-lekeli, hücre gruplarının işaretleyici smyhc1 (kırmızı) ve Beyin rhombomere işaretleyici krox20 (ayrıca kırmızı). Bu aşamada (Üst panel), pax2a transkript böbrek atalarıdır ayırmak devam ediyor. (Orta, Alt paneller) böbrek progenitör topraklar içinde, bir rostral subdomain işaretlenmişslc4a4 ve SLC12A3 kodlayan transkript tarafından bir kuyruk alt etki alanı işaretleyin. <img alt="Şekil 5," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51604/51604fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51604/51604fig5.jpg" /> (Mor) wt1a ait 15 somite aşamada Şekil 5.. Genetik mutasyonlar veya retinoik asit sentezini modüle kimyasal genetik tedirginlikler nedeniyle fenotipleri karakterize düz monte preparatların kullanımı. DİLERİZ ifade desen ve smyhc1/krox20 (kırmızı) karşılaştırıldı retinoik asit (RA) üretim eksiklikleri ile yabani türleri ve embriyo arasındaki nedeniyle aldehit dehidrogenaz 1a2 (NLS ve lib mutasyonlar) veya dietilaminobenzaldehit (DEAB) ile retinaldehidin dehidrogenaz aktivitesinin kimyasal inhibe kusurlarından. Lib RA üretiminin azalması gibi, NLS biraz daha şiddetlidirlib embriyolar yabani türleri DEAB tedavi wt1a ifade komple kaldırılması ile ilişkili iken benzer şekilde, NLS mutant embriyolar sahnelenen daha wt1a transkript biraz azaltılmış boyanmasını ifade söyledi.

Zebra balığı embriyo gelişim biyoloji araştırma için mükemmel bir model. Embriyogenez sırasında, zebra balığı örnek gözlem ve analiz için üç-boyutlu zorluklar sunuyor, bir yumurta sarısı kitle ile gelişir. Bu protokol situ (DİLERİZ) lekeli Zebra balığı embriyo örnekleri içinde bütün montaj iki-boyutlu düz monte hazırlıkları nasıl oluşturulacağı açıklanır.

Tüm Dağı ile Zebra balığı Embriyo örnekler Vitray gözlenmesi ve Analiz Daire Dağı Hazırlık<em&gt; In situ</em&gt; Melezleme

The zebrafish embryo is now commonly used for basic and biomedical research to investigate the genetic control of developmental processes and to model ...

Bu prosedürün genel amacı, erken gelişim evrelerindeki boyanmış sabitlenmiş zebra balığı embriyolarının daha iyi görselleştirilmesidir. Bu işlem, öncelikle zebra balığı embriyosunun C two hybridization home mount kullanılarak boyanmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, düz montaj (flat mount) için bir embriyo seçilir ve ince bir pens yardımıyla vitellusa merkezi bir insizyon yapılır; daha sonra kalan vitellus granülleri, lash araçları kullanılarak nazikçe kazınarak uzaklaştırılır.Son olarak, örneğin uygun şekilde görüntülenmesini sağlamak için embriyo, bir lam üzerine gliserol ile monte edilir. Nihayetinde, düzleştirme (flat mounting) işlemi, vitellüs kesesinin çıkarılması ve embriyonun iki boyutlu bir preparat haline getirilmesiyle, boyanmış embriyoların dorsal görünümden daha iyi görselleştirilmesine olanak tanır. Bu tekniğin, erken gelişim aşamalarındaki sağlam embriyoların görüntülenmesi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, düzleştirme işleminin vitellüs kesesini uzaklaştırarak tüm embriyonun görülmesini sağlamasıdır.Bu yöntem, bir embriyodaki renal pre-cinsiyet alanı kapsamının karakterize edilmesi gibi gelişimsel alandaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler, tekniğin embriyonun hassas bir şekilde işlenmesini gerektirmesi ve vitellüs kesesini çıkarmak için gereken uygun basınç miktarını öğrenmenin zaman alabilmesi nedeniyle zorluk yaşarlar. Bu prosedürü, Winger laboratuvarında lisansüstü öğrenciler olan ben, Zoe ve Amanda gerçekleştireceğiz.Metin protokolüne uygun olarak embriyolar toplandıktan, fikse edildikten ve boyandıktan sonra, düz montaj (flat mounting) işlemi için bir X-P-B-S-T ile bir embriyo seçin. Embriyoyu plastik veya cam bir petri kabına aktarın. Ardından, kap stereo mikroskop altındayken, baş ve kuyruk uçları görünecek şekilde yan görünüm elde etmek için ince pens yardımıyla embriyoyu döndürün.Ardından, embriyoyu sabit tutmak için ince pensler kullanın ve embriyonun başı ile kuyruğu arasında merkezi bir konumda bulunan yumurtaya bir insizyon yapmak için ikinci bir pens seti kullanın. Daha sonra ince penslerle yumurtayı yumurta hücresi boşluğundan çıkarın. Bir ila iki damla XPBS kullanarak embriyo üzerindeki kalıntı yumurtaları durulamak için bir X-P-B-S-T kullanın.Embriyoyu düz bir lam üzerine aktarın. Embriyoyu, cam lam üzerinde düz bir konumda kalacak şekilde tampon çözeltinin kenarına sürükleyin. Embriyoyu sabitledikten sonra, vitellus granüllerini temizlemek için bir lash aracı kullanarak ventral yüzeyi nazikçe kazıyın.PBST çözeltisi fazla vitellüs ile kirlenirse veya buharlaşmaya başlarsa, bir ila iki taze damla ekleyin ve embriyoyu bu taze tampon çözeltiye sürükleyin. Vitellüs yeterince temizlendikten sonra, son durulama için embriyoyu nazikçe PBST içeren bir Petri kabına geri aktarın. Ardından embriyoyu %100 gliserol içeren bir Petri kabına aktarın ve beş dakika inkübe edin.Embriyoyu bir cam lam üzerine yerleştirmek için, onu bir veya iki damla %100 gliserol içeren temiz bir cam lama aktarın ve ventral vitellüs tarafı cam lama bakacak şekilde konumlandırın. Bir kirpik aleti kullanarak, embriyoyu gliserol damlasının kenarına doğru çekerek lam üzerinde düz bir konumda kalmasını sağlayın.Embriyonik eksen kıvrımlıysa, gerilimi azaltmak ve düz bir şekilde lam üzerine yerleştirebilmek için ince pensle kalan vitellusa nazikçe küçük kesikler atın. 18 by 18 cam lamelin dört köşesine küçük modelleme kili parçaları yerleştirin.Kapak camını, gliserol içindeki hava kabarcıklarını en aza indirecek şekilde eğimli olarak embriyonun üzerine yavaşça yerleştirin. Son olarak, cam ile yüzey arasındaki boşluğu doldurmak ve kaymayı önlemek için kapak camının kenarına ek bir damla %100 gliserol ekleyin; burada gösterilen görüntüleme için stereo veya ışık mikroskobu kullanın. Böbreği oluşturan gelişmekte olan renal progenitörleri işaretlemek için iki renkli boyama ile birlikte bir prob kombinasyonu kullanılmıştır ve embriyolar erken evrede düz monte edilmiştir.14 somit evresinde, renal progenitörler, kırmızıyla gösterilen ve eş zamanlı olarak delta C eksprese eden paraksiyel mezodermi çevreleyen PAX2a transkriptlerinin ekspresyonu ile U şeklinde bir paternle belirlenir. Delta C, Ccrox20 ile birlikte işaretlendiğinde, renal progenitörlerin delta C eksprese eden rostral bir alt alanı ortaya çıkmıştır. 14 somit evresinde PAX2a, SLC4a4, SLC12a3 ve SMYHC1 ekspresyonunun analiz edilmesi, tüm renal progenitör alanının PAX2a ile haritalanmasını sağlamış ve rostral alt alandaki bir hücre alt grubunun SLC4a4 eksprese ettiğini ortaya koymuştur.Bu durum, SLC 12 A 3 eksprese eden renal progenitörlerin coddle alt alanı ile örtüşmedi. Bu şekilde, retinoik asit biyosentezi için gerekli olan Retinaldehit dehidrogenaz iki geninde mutasyonlar bulunan embriyolar veya DEAB ve ALD H inhibitörü ile işleme tabi tutulan embriyolar, sırasıyla WT 1 A'nın azalmış veya tamamen ortadan kalkmış ekspresyonu ile gelişmiş olup; bu da düz montaj hazırlığı ile iki renkli FISH yönteminin organogenez sırasındaki hücresel alanların incelenmesinde değerli olduğunu göstermektedir. Genetik mutasyonlara sahip veya küçük moleküllere kimyasal olarak maruz kalmış zebrafishlerde, bu teknik bir kez kavrandığında, doğru şekilde uygulandığı takdirde 10 ila 15 dakika sürebilmektedir.Bu prosedürün ardından, böbrek segmentlerinin sınırlarının nerede olduğuna dair ek soruları yanıtlamak için görüntüleme gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Videoyu izledikten sonra, istenen yapıları daha iyi görselleştirmek amacıyla vitellusun uzaklaştırılmasıyla boyanmış bir zebrafish embriyosuna nasıl flat mount yapılacağı konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.

flat-mount-preparation-for-observation-analysis-zebrafish-embryo

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

In situ hibridizasyon Tüm montaj, gelişim biyolojisi en yaygın olarak kullanılan teknikleri biridir. Burada, tek bir genin kesin ifadelerde desen analiz ve iki genin ifadesi etki çakışma belirlenmesi için çift floresan in situ hibridizasyon protokol yüksek çözünürlüklü sunuyoruz. Biz bir doku organizasyon vurgulamak için propidium iyodür nükleer karşı leke içerir.

Zebra balığı Tüm Dağı Yüksek Çözünürlüklü Çift Floresan Yerinde Hibridizasyon

Bu makalede, uzun süreli görüntüleme için canlı zebra balığı embriyolarını monte etmenin bir yöntemi açıklanmaktadır. Bu yöntem uygun maliyetlidir ve Ters Mikroskopta görüntüleme için normal cam tabanlı mikroskopi kapları kullanılarak gerçekleştirilmesi kolaydır. Montaj, farklı konsantrasyonlarda agaroz katmanları halinde gerçekleştirilir.

Katmanlı Agar Montajı: Canlı Zebra Balığı Embriyolarının Ters Mikroskop ile Uzun Süreli Görüntüleme İçin Hazırlanması

Bu videoda, canlı zebra balığı embriyolarının düşük eriyik agaroz kullanılarak 6 oyuklu plakaya monte edilmesine ilişkin adım adım talimatlar açıklanmaktadır. Ayrıca canlı embriyoların görüntülerini elde etme ve yazılım kullanarak analiz etme sürecini de sağlar.

Agar Montajı: Uzun Süreli Görüntüleme için Canlı Zebra Balığı Embriyolarını Monte Etmenin Temel Bir Yöntemi

Zebra balığı, küçük tropikal balık, omurgalı geliştirme ve hastalık sırasında gen fonksiyonu çalışmak için popüler bir model haline gelmiştir. Hedef genlerin uzaysal ve zamansal ifade ile tespit...

Yüksek Çözünürlüklü Tüm Dağı<em&gt; Yerinde</emGen İfade ve Fonksiyon Eğitim için Zebra balığı Embriyolar içinde&gt; Hibridizasyon

Çoğalma, desenleme, farklılaşma ve akson rehberlik gibi gelişimsel süreçleri kolaylıkla Zebrafish omurilikte örnek alınabilir. Bu yazıda, bu olayların görselleştirme optimize eden, zebra balığı embriyolarının için bir montaj prosedürü açıklar.

Diseksiyon ve Zebra balığı Embriyolar Yanal Montaj: Omurilik Kalkınma Analizi

Zebrabalıkları gelişimi embriyo düşük konsantrasyonlu agaroz ile optik bakımdan saydam bir plastik hortumlar gömülür ışık mikroskobu ile levha gün boyunca takip edilebilir.

Çok katmanlı Zebra balığı uzun vadeli Işık Sayfalık Mikroskopi için Montaj

Burada, normal gelişimi bozmadan canlı zebra balığı embriyolarının arka vücut gelişiminin uzun süreli hızlandırılmış görüntülemesine izin veren çok yönlü bir montaj yöntemi sunuyoruz.

Zebra balığı Kalkınma Uzun Süreli Görüntüleme için A yönlü Montaj Yöntemi

Kirpikler geliştirme için uygun organogenesis hayati önem taşımaktadır. Bu iletişim kuralı etiket ve Zebra balığı siliyer hücreleri görselleştirmek için en iyi duruma getirilmiş bir yöntemini açıklar.

Zebra balığı bütün Dağı Floresan Situ hibridizasyon ve ayirt kombine bir protokol aracılığıyla Multiciliated hücrelerde görüntülenmesi

Bu makalede, uzun zaman atlamalı konfokal mikroskopi için kırılgan zebra balığı embriyoları monte etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu düşük maliyetli yöntem herhangi bir ters mikroskop görüntüleme için düzenli cam alt mikroskopi yemekleri kullanarak gerçekleştirmek kolaydır. Montaj farklı konsantrasyonlarda agarose katmanları yapılır.

Tüm Zebrabalığı Embriyolarının Uzun Zaman Atlamalı Konfokal Mikroskobu için Katmanlı Montaj Yöntemi

Burada, zebra balığı embriyoları ve larvalarının tüm preparatlarında floresan antikor aracılı proteinlerin tespiti için bir protokol salıyoruz.

Zebrabalığı Embriyoları ve Larvalarında Tüm Mount Immunohistochemistry

Erken zebra balığı embriyolarının bir ışık tabakası mikroskobu kullanılarak bozulmamış bir koryon içinde görüntülenmesi için bir örnek hazırlama stratejisi açıklanmaktadır. Embriyoların %70 epiboli ve tomurcuk aşamalarında koryon içinde edindiği farklı yönelimleri analiz eder ve ışık tabakası sistemini kullanarak embriyo boyunca hücresel ölçekte çözünürlük elde etmek için görüntüleme stratejilerini detaylandırır.

Erken Zebra Balığı Embriyoları için Işık Levha Mikroskobu Görüntüleme ve Montaj Stratejileri

Keşfedin zebra balığı embriyolarında düz montaj tekniği ile WISH boyama sonrası yapıların görselleştirilmesi. Sarı kesenin çıkarılması embriyonik gelişimi ve organogenez araştırmalarını kolaylaştırır.

Tüm Dağı ile Zebra balığı Embriyo örnekler Vitray gözlenmesi ve Analiz Daire Dağı Hazırlık

Daha fazla video keşfet