Bir Gelişimi İn Vitro Deney Mezenkimal Hücreleri Uyguladığımız Epitel-Mezenkimal Geçiş kasılma Fonksiyonu değerlendirin

Bu prosedürün genel amacı, in vitro inflamatuar sitokin kaynaklı epitelyal mezenkimal geçiş veya EMT geçiren mezenkimal hücrelerin kasılmasını değerlendirmektir. Bu mezenkimal EMT'den sonra, idiyopatik pulmoner fibroz veya şiddetli astımda hava yolunun yeniden şekillenmesi gibi inflamatuar immün yanıtların neden olduğu temel hücre fonksiyonunun bir varyasyonudur. Bu tekniğin temel avantajları, özel cihazlar gerektirmemesi ve yüksek bir içerik göstermesidir. İşlemin demonte edilmesi, laboratuvarımdan Hideyuki Takeshima ve Kosuke Makita yüksek lisans öğrencileri olacak.

A-549 insan akciğer epitel hücrelerinin bir kültürünü beş ila on mililitre PBS ile yıkayarak başlayın. Daha sonra, yapışan hücreleri 37 santigrat derece ve yüzde beş karbondioksitte iki milileter tripsin-EDTA ile ayırın. Üç dakika sonra, hücre süspansiyonunu hücre kültürü ortamı içeren konik tüplere aktarın ve hücreleri bir santrifüjde döndürün.

Peletleri iki mililitre hücre kültürü ortamında yeniden süspanse edin ve sayım için küçük bir belagat ayırın. Daha sonra, on santimetre polisteren kabı başına on milileter ortamda 0.5 ila 1 çarpı 10 ila 6. hücreleri tohumlayın ve hücre kültürlerini 24 saat inkübe edin. EMT indüksiyonu için, ertesi gün, hücrelere 10 mikrolitre TGF beta 1 ve TNF alfa uygulayın ve plakaları 48 saat daha inkübatöre geri koyun.

Dördüncü günde, emt ile indüklenen kültürleri beş ila on milileter pbs ile yıkayın, daha sonra gösterildiği gibi tripsin-EDTA ile hücreleri ayırın. Daha sonra, tripsin inhibitörü ile takviye edilmiş DMEM'deki hücre süspansiyonlarını döndürün ve peletleri 500 mikrolitre pbs'de yeniden süspanse edin. Daha sonra hücreleri sayın ve taze hazırlanmış jel ortamını oyuk başına 3 kez 10 ila 5. hücrelere ekleyin, jelleşmeden önce çözeltiyi pipetle nazikçe ama hızlı bir şekilde karıştırın.

Hemen, ancak dikkatli bir şekilde, işlenmemiş 24 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna düzgün, silindirik formlarda 0.5 milileter hücre dağıtın. Daha sonra plakayı 15 dakika boyunca bir hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. Jel tamamen katılaştığında, jelleri plakalardan kırılmadan ayırmak için sterilize edilmiş bir spatuala'yı her bir jelin dışında bir daire içinde bir yönde hareket ettirin.

Jeli çıkarırken, spatulayı kuyu içinde ileri geri hareket ettirmemeye dikkat edin. Daha sonra jelleri, TGF beta 1 ve TNF alfa olsun ya da olmasın, yüzde bir FBS ile takviye edilmiş beş milileter DMEM içeren 16 milimetrelik bireysel doku kültürü kaplarına nazikçe aktarmak için spatulayı kullanın. Son olarak, jellerin ortam üzerinde yüzdüğünden emin olmak için bulaşıkları hafifçe sallayın ve jelleri hücre kültürü inkübatörüne geri koyun.

Tedavi edilmemiş a541 hücreleri, epitel hücrelerinin karakteristiği olan parke taşı benzeri ve üçgen şeklinde bir görünüm sergiler. Bununla birlikte, TGF beta 1 ve TNF alfa ile stimülasyonlarından sonra, hücreler, mesenhemal hücreler için gözlemlenene benzer şekilde uzun bir iğ şekli gösterir. EMT öncesi ve sonrası epitelyal ve mesenhemal belirteç ekspresyonunun QRTCPR'si, 48 saat boyunca inflamatuar sitokinlerle tedavi edilen A541 hücrelerinin, CDH1'in önemli ölçüde azalmış ekspresyonunu ve VIAM ve ACTA2'nin ekspresyonlarını önemli ölçüde artırdığını ortaya koymaktadır.

Ayrıca, bu sitokinlerle stimülasyon, batı kan analizi ile belirlenen E-kaderin ekspresyonunu zayıflatırken, vimentin N-kaderin ve alfa düz kas aktini ekspresyonları indüklenir. Bir jel kasılma testinde, 48 saat sonra, TGF beta 1 ve TNF alfa ile muamele edilen hücreleri içeren jeller, PBS ile muamele edilen hücreleri içeren kontrollü jellerden daha küçüktür. Gerçekten de, 72 saat sonra, sitokin ile muamele edilmiş jelleri içeren jellerin boyutu, bir jel analizörü tarafından ölçülen kontrollü jellere kıyasla önemli ölçüde azalır.

Görüldüğü gibi, jel kasılma aşamaları, uygun şekilde yapılırsa üç saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü denerken, jel büzülme testini gerçekleştirmeden önce EMT'nin başarılı bir şekilde indüklendiğini doğrulamayı unutmamak önemlidir. Gözlemden sonra, bu teknik, fibroz veya akciğerin yeniden şekillenmesi gibi enflamatuar durum sırasında EMT sürecini değiştirmek için bir yol sağlar.

Bu videoyu izledikten sonra, EMT'ye sahip hücrelerin bir tür cuagenter'a nasıl yayılacağını ve bunları ortamda nasıl köpürteceğini iyi anlamış olmalısınız.