Name: Bir Gelişimi İn Vitro Deney Mezenkimal Hücreleri Uyguladığımız Epitel-Mezenkimal Geçiş kasılma Fonksiyonu değerlendirin (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 2 s
Description: Öğrenin, jel kasılma deneyi ile epitel-mezenkimal geçiş sonrası mezenkimal hücrelerin kasılma fonksiyonunu değerlendirin. Bu yöntem, iltihabi bağlamdaki hücre davranışlarını anlamak için yüksek içerikli ve tekrarlanabilir sonuçlar sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Teknik yardım için Dr. Tadashi Koyama'ya teşekkür ederiz. Bu çalışma kısmen JSPS KAKENHI Hibe Numaraları 23249045, 15K09211, 15K19172; Japonya Sağlık, Çalışma ve Refah Bakanlığı'ndan Solunum Yetmezliği Araştırma Grubu'na hibe; alerjik hastalık ve immünoloji araştırmaları için bir hibe, Japonya.

1. Hazırlıklar ve Kültür Akciğer Epitel Hücreleri <ol><li> Dulbecco Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı (DMEM) içinde kültür A549 insan akciğer epitel hücreleri (yapışık hücre çizgisi), 100 ug / ml streptomisin ve% 10 fetal sığır serumu (FBS), 100 lU / ml penisilin, ve. </li><li> Çıkarın ve Kültür bir tabaktan alınan hücre kültürü ortamı atmak ve 5 ile bir kez yıkayın - fosfat tamponlu tuzlu su, 10 ml (PBS). Yıkandıktan sonra, hemen PBS aspire. </li><li> 3 dakika boyunca CO2 2 ml tripsin / etilendiamintetraasetik asit (EDTA) (% 0.05) ilave edin ve 37 ° C&#39;de inkübe ve% 5. </li><li> Hücre kültürü ortamı, santrifüj 150 x g&#39;de 4 dakika boyunca oda sıcaklığında tüpler ihtiva eden santrifüj tüplerine müstakil hücreleri toplamak. </li><li> hücreler, hücre kültür ortamının 2 ml pelet ve hücre sayımı için bir örnek çıkarın. hücre canlılığı kontrol etmek için Tripan mavi leke hemasitometre kullanarak hücrelerin sayısını. </li><li> Tohum A549 hücreleri0.5 bir yoğunlukta en az 10 cm polistiren plakaları - jel daralma deneyi için ortam, 10 ml 1.0 x 10 6 hücre / çanak. 0.5 yoğunluğunda 6 oyuklu polistiren plâkalar üzerine hücreleri Tohum - 1.0 x 10 5 hücre / göz ile EMT onay orta 2 mi. 24 saat boyunca CO2 37 ° C&#39;de inkübe hücreleri ve% 5. </li></ol> 2. EMT Prosedürü <ol><li> Aşama 1.6 tohumlandı jel daralma deneyi için plakaya TGF-ß1 (5 ug / ml) 10 ul ve TNF-a, 10 ul (10 ug / ml) eklenir. Aşama 1.6 tohumlandı EMT onay plakasına TGF-ß1 (5 ug / ml) 2 ul ve TNF-a 2 ul (10 ug / ml) eklenir. 48 saat boyunca CO2 37 ° C&#39;de inkübe edilir ve% 5. </li></ol> PCR ve Western Blot ile EMT Usul 3. Onay <ol><li> Faz kontrast mikroskopi kullanılarak tedavi hücrelerin (şekil mili için çakıl taşı gibi itibaren) morfoloji değişikliği onaylayın. Not: Normark A549 hücreleri, epitel hücreleri bir özelliğidir çakıl taşı gibi ve üçgen şekilli bir görünüşe sahip, ancak, TGF-ß1 ve TNF-a ile uyarılmasından sonra hücreler uzun görünür ve mil bu mezenkimal hücreler 14,15 benzer şekilli. </li><li> Bu E-kadherin gibi bir epitel işaretleyici ekspresyonunu değerlendirmek ve PCR ve Batı lekeleme ile örneğin N-kaderin, vimentin ve α-düz kas aktin gibi mezenşimal belirteçleri. <ol><li> RNA özütleme kiti 16 ile hücrelerden toplam RNA ekstrakte edin ve üreticinin protokolüne uygun olarak, ters transkriptaz 17 kullanarak cDNA sentezlemek. </li><li> Gerçek zamanlı PCR sistemi 18 ve üreticilerin talimatlarına göre monomerik siyanin boyası PCR kiti kullanılarak mRNA seviyelerinin ifadesini ölçün. GAPDH için spesifik primerler (gliseraldehid 3-fosfat dehidrojenaz), ACTA2 (alfa-aktin-2), CDH1 (kaderin-1; E-kadherin) ve VIM (vimentin), Tablo 1 &#39;de gösterilmiştir </st&gt; Rong. </li><li> Lyse bir parçalama tamponu (Tablo 2)% 1 proteaz önleyici kokteyl içeren çözelti ile hücreleri. Bir protein tahlil kiti 19,20 kullanarak tüm numune protein konsantrasyonlarını ölçmek ve bir poliakrilamid jel protein aynı miktarda uygulanır. <ol><li> SDS jel-elektroforez ve PVDF membranı 21 proteinlerin yarı-kuru transferi gerçekleştirin. 2 saat 1 - blokaj tamponunda primer antikorlar ile membran inkübe edin. İnkübasyondan sonra yıkama tamponu ile iki defa zarın yıkanması ve ikinci antikor ile membran 1 saat inkübe edilir. Not: Bu çalışmalarda kullanılan antikorlar ve seyreltileri malzemeleri / donatım tabloya bakınız. Bloke edici tampon bileşenleri için Tablo 2&#39;ye bakınız. </li><li> iki kez yıkama tamponu ile membran yıkayın. Soğuk CCD kamera 11,23 kullanarak Western lekeleme tespit kiti 22 ile membran fotoğraf çekmek. </li></ol></li></ol></li></ol> 4. Değerlendirilmesi EMT için Jel Daralma Deneyi <ol><li> Hücre kültürü kabından koşullu ortam aspire ve 5 ile iyice yıkayın - ölü hücreleri çıkarmak için 10 ml PBS. Yıkandıktan sonra, hemen PBS aspire. </li><li> 3 dakika boyunca CO2,% 0.05 tripsin / EDTA 2 ml ilave edilir ve 37 ° C&#39;de inkübe ve% 5. </li><li> DMEM 150 x g&#39;de 4 dakika boyunca oda sıcaklığında tripsin inhibitörü (1 mg / ml), santrifüj tüpleri ile takviye içeren santrifüj tüplerine müstakil hücreleri toplamak. </li><li> damıtılmış su olan tip 1 kollajen jel karıştırın ve DMEM konsantre edildi 4 x 1.75 mg / ml&#39;lik bir konsantrasyon elde etmek için kolajen seviyesini ayarlamak için ve 1 x DMEM konsantrasyonu. Bu adımı sırasında buz üzerinde jel ortamı tutmak için emin olun. Not: Jel ortamı 6 mi yapmak için, iyi 3.5 mi tip 1 kollajen jel (3 mg / ml) 1.5 ila 4 x konsantre edildi mL DMEM ve 1 ml damıtılmış su karıştırılır. </li><li> 500 ul PBS hücre pelletini ve hücre sayımı için bir örnek çıkarın. OrtakTripan mavi boyası ile bir hemositometre kullanılarak hücre sayısı, hücre canlılığı ile kontrol edin. </li><li> Yavaşça, bir hücre 3.0 x 10 5 hücre yoğunluğu / oyuk (6.0 x 10 5 hücre / ml) ve elde ancak hızla jelleşme olmadan pipetleme ile karıştırarak seviyesini ayarlamak için jel orta ekleyin. </li><li> düzgün silindir biçiminde yapmak için hızlı ve dikkatli bir şekilde 24 oyuklu işlenmemiş plakanın her oyuğuna 0.5 ml koyun. Herhangi bir hava kabarcıkları jeller (Şekil 1A) kirletmesine izin vermemek için dikkatli olun. hücreleri içeren jel orta viskoz ve kolayca kuyuda jel ve form hilal şekli olabilir: Not. </li><li> 37 ° C&#39;de bir hücre kuluçka makinesi içinde, 15 dakika boyunca inkübasyona bırakılır,% 5 CO2 ve% 95 nem, tamamen jel. </li><li> Bir yönde bir çevresi çekmek için bir şekilde sterilize edilmiş bir spatula taşıyarak bozmadan plaka jeller ayırın. Bir spatula kullanarak, yavaşça 60 mm doku kültürü yemekleri jeller aktarmakya da TGF-ß1 (5 ng / ml) ve TNF-a (10 ng / ml) olmadan DMEM /% 1 FBS, 5 ml ihtiva etmektedir. </li><li> Yavaşça jeller ortamda yüzen sağlamak için yemekler sallayın. 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 ve% 95 nemde bir hücre kuluçka makinesi içinde inkübe edin. </li></ol> Jel Boyutu 5. Ölçüm <ol><li> bir görüntü analiz sistemi kullanılarak, 0, 24, 48, ve 72 saat sonra kolajen jel boyutu ölçülür. <ol><li> Jel dokümantasyon sistemi (Şekil 2A) açın ve ışık geçirmeyen bir kabinin içine yemekler koymak. Sonra kabine yemeklerin kapağını çıkarmak. </li><li> İlgili jel analiz yazılımı açın. kabine jellerin görüntü göstermek için menü çubuğunda &quot;görüntü elde etme lütfen&quot; tıklayın. Sonra, jeller (Şekil 2B) fotoğraf çekmek için menü çubuğunda &quot;acquire&quot; tıklayın. </li><li> Ölçüm bölgesini menü çubuğunda (Şekil 2C) &quot;algılama düğmesini&quot; tıklayın ve ayarlamak (sarı daire ifareyi sürükleyerek n Şekil 2C). Ardından, menü çubuğunda &quot;otomatik algılama düğmesi&quot; (Şekil 2B düğmesini bakınız). Yazılım otomatik olarak bir ısı haritası (Şekil 2B) gösteren jeller algılar. </li><li> Görüntü işleme ile jellerin taslağını çıkarmak ve anahat (Şekil 2E) ile çevrili alanlar hesaplamak için &quot;Tamam&quot; a tıklayın. Alan hesaplandıktan sonra, hesaplanan alan ayrı bir pop-up penceresi görüntülenir. Not: jeller görüntüleme sırasında birbirleriyle örtüşen, hafifçe steril bir pipet kullanarak jeller taşıyın. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+mechanisms+of+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular mechanisms of fibrosis.</a> The Journal of pathology. 214, 199-214 (2008).</li>
<li>Hardie, W. D., Glasser, S. W., Hagood, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+concepts+in+the+pathogenesis+of+lung+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Emerging concepts in the pathogenesis of lung fibrosis.</a> The American journal of pathology. 175, 3-16 (2009).</li>
<li>Kovacic, J. C., Mercader, N., Torres, M., Boehm, M., Fuster, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-to-mesenchymal+and+endothelial-to-mesenchymal+transition%3A+from+cardiovascular+development+to+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Epithelial-to-mesenchymal and endothelial-to-mesenchymal transition: from cardiovascular development to disease.</a> Circulation. 125, 1795-1808 (2012).</li>
<li>Thiery, J. P., Acloque, H., Huang, R. Y., Nieto, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-mesenchymal+transitions+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease.</a> Cell. 139, 871-890 (2009).</li>
<li>Kalluri, R., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+basics+of+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">The basics of epithelial-mesenchymal transition.</a> The Journal of clinical investigation. 119, 1420-1428 (2009).</li>
<li>Forino, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGFbeta1+induces+epithelial-mesenchymal+transition%2C+but+not+myofibroblast+transdifferentiation+of+human+kidney+tubular+epithelial+cells+in+primary+culture%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+experimental+pathology%22%5BJournal%5D)">TGFbeta1 induces epithelial-mesenchymal transition, but not myofibroblast transdifferentiation of human kidney tubular epithelial cells in primary culture.</a> International journal of experimental pathology. 87, 197-208 (2006).</li>
<li>Yang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Participation+of+miR-200+in+pulmonary+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Participation of miR-200 in pulmonary fibrosis.</a> The American journal of pathology. 180, 484-493 (2012).</li>
<li>Reynolds, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+inflammation+and+fibrosis%3A+an+alveolar+macrophage-centered+perspective+from+the+1970s+to+1980s%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+respiratory+and+critical+care+medicine%22%5BJournal%5D)">Lung inflammation and fibrosis: an alveolar macrophage-centered perspective from the 1970s to 1980s.</a> American journal of respiratory and critical care medicine. 171, 98-102 (2005).</li>
<li>Camara, J., Jarai, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-mesenchymal+transition+in+primary+human+bronchial+epithelial+cells+is+Smad-dependent+and+enhanced+by+fibronectin+and+TNF-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Fibrogenesis+%26+tissue+repair%22%5BJournal%5D)">Epithelial-mesenchymal transition in primary human bronchial epithelial cells is Smad-dependent and enhanced by fibronectin and TNF-alpha.</a> Fibrogenesis & tissue repair. 3, 2(2010).</li>
<li>Kamitani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+stimulation+with+TGF-beta1+and+TNF-alpha+induces+epithelial+mesenchymal+transition+in+bronchial+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+archives+of+allergy+and+immunology%22%5BJournal%5D)">Simultaneous stimulation with TGF-beta1 and TNF-alpha induces epithelial mesenchymal transition in bronchial epithelial cells.</a> International archives of allergy and immunology. 155, 119-128 (2011).</li>
<li>Mikami, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphotoxin+beta+receptor+signaling+induces+IL-8+production+in+human+bronchial+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Lymphotoxin beta receptor signaling induces IL-8 production in human bronchial epithelial cells.</a> PloS one. 9, e114791(2014).</li>
<li>Yamauchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+necrosis+factor-alpha+enhances+both+epithelial-mesenchymal+transition+and+cell+contraction+induced+in+A549+human+alveolar+epithelial+cells+by+transforming+growth+factor-beta1%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+lung+research%22%5BJournal%5D)">Tumor necrosis factor-alpha enhances both epithelial-mesenchymal transition and cell contraction induced in A549 human alveolar epithelial cells by transforming growth factor-beta1.</a> Experimental lung research. 36, 12-24 (2010).</li>
<li>Grinnell, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts%2C+myofibroblasts%2C+and+wound+contraction%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts, myofibroblasts, and wound contraction.</a> The Journal of cell biology. 124, 401-404 (1994).</li>
<li>Ramos, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF-1+reverts+epithelial-mesenchymal+transition+induced+by+TGF-%7Bbeta%7D1+through+MAPK%2FERK+kinase+pathway+%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+physiology.+Lung+cellular+and+molecular+physiology%22%5BJournal%5D)">FGF-1 reverts epithelial-mesenchymal transition induced by TGF-{beta}1 through MAPK/ERK kinase pathway .</a> American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. 299, L222-L231 (2010).</li>
<li>Ren, Z. X., Yu, H. B., Li, J. S., Shen, J. L., Du, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suitable+parameter+choice+on+quantitative+morphology+of+A549+cell+in+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience+reports%22%5BJournal%5D)">Suitable parameter choice on quantitative morphology of A549 cell in epithelial-mesenchymal transition.</a> Bioscience reports. 35, (2015).</li>
<li>Brinkmann, V., Kinzel, B., Kristofic, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TCR-independent+activation+of+human+CD4%2B+45RO-+T+cells+by+anti-CD28+plus+IL-2%3A+Induction+of+clonal+expansion+and+priming+for+a+Th2+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">TCR-independent activation of human CD4+ 45RO- T cells by anti-CD28 plus IL-2: Induction of clonal expansion and priming for a Th2 phenotype.</a> Journal of immunology. 156, 4100-4106 (1996).</li>
<li>Krug, M. S., Berger, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First-strand+cDNA+synthesis+primed+with+oligo%28dT%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">First-strand cDNA synthesis primed with oligo(dT).</a> Methods in enzymology. 152, 316-325 (1987).</li>
<li>Morozumi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+detection+of+pathogens+in+clinical+samples+from+patients+with+community-acquired+pneumonia+by+real-time+PCR+with+pathogen-specific+molecular+beacon+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+clinical+microbiology%22%5BJournal%5D)">Simultaneous detection of pathogens in clinical samples from patients with community-acquired pneumonia by real-time PCR with pathogen-specific molecular beacon probes.</a> Journal of clinical microbiology. 44, 1440-1446 (2006).</li>
<li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical biochemistry. 150, 76-85 (1985).</li>
<li>Wiechelman, K. J., Braun, R. D., Fitzpatrick, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+the+bicinchoninic+acid+protein+assay%3A+identification+of+the+groups+responsible+for+color+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Investigation of the bicinchoninic acid protein assay: identification of the groups responsible for color formation.</a> Analytical biochemistry. 175, 231-237 (1988).</li>
<li>Ursitti, J. A., Mozdzanowski, J., Speicher, D. W., et al. Electroblotting from polyacrylamide gels. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aUrsitti%2C+JA+%22Current+protocols+in+protein+science%22">Current protocols in protein science</a>. Chapter 10, Unit 10.7(2001).</li>
<li>Kricka, L. J., Voyta, J. C., Bronstein, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemiluminescent+methods+for+detecting+and+quantitating+enzyme+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Chemiluminescent methods for detecting and quantitating enzyme activity.</a> Methods in enzymology. 305, 370-390 (2000).</li>
<li>Noguchi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrative+analysis+of+the+tumorigenic+role+of+TAZ+in+human+non-small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+cancer+research+%3A+an+official+journal+of+the+American+Association+for+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">An integrative analysis of the tumorigenic role of TAZ in human non-small cell lung cancer.</a> Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 20, 4660-4672 (2014).</li>
<li>Kasai, H., Allen, J. T., Mason, R. M., Kamimura, T., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta1+induces+human+alveolar+epithelial+to+mesenchymal+cell+transition+%28EMT%29%5BTitle%5D)+AND+%22Respiratory+research%22%5BJournal%5D)">TGF-beta1 induces human alveolar epithelial to mesenchymal cell transition (EMT).</a> Respiratory research. 6, 56(2005).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin-mediated+type+II+TGF-beta+receptor+tyrosine+dephosphorylation+controls+SMAD-dependent+profibrotic+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Integrin-mediated type II TGF-beta receptor tyrosine dephosphorylation controls SMAD-dependent profibrotic signaling.</a> The Journal of clinical investigation. 124, 3295-3310 (2014).</li>
<li>Saito, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+expression+profiling+reveals+target+genes+of+TGF-beta+and+TNF-alpha+possibly+mediated+by+microRNAs+in+lung+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">An integrated expression profiling reveals target genes of TGF-beta and TNF-alpha possibly mediated by microRNAs in lung cancer cells.</a> PloS one. 8, e56587(2013).</li>
<li>Dvashi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+phosphatase+magnesium+dependent+1A+governs+the+wound+healing-inflammation-angiogenesis+cross+talk+on+injury%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Protein phosphatase magnesium dependent 1A governs the wound healing-inflammation-angiogenesis cross talk on injury.</a> The American journal of pathology. 184, 2936-2950 (2014).</li>
<li>Hallgren, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+ROCK1+dependent+contractility+in+fibroblast+from+chronic+obstructive+pulmonary+disease+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+translational+medicine%22%5BJournal%5D)">Enhanced ROCK1 dependent contractility in fibroblast from chronic obstructive pulmonary disease patients.</a> Journal of translational medicine. 10, 171(2012).</li>
<li>Kobayashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinase-9+activates+TGF-beta+and+stimulates+fibroblast+contraction+of+collagen+gels%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+physiology.+Lung+cellular+and+molecular+physiology%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinase-9 activates TGF-beta and stimulates fibroblast contraction of collagen gels.</a> American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. 306, L1006-L1015 (2014).</li>
<li>Horie, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histamine+induces+human+lung+fibroblast-mediated+collagen+gel+contraction+via+histamine+H1+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+lung+research%22%5BJournal%5D)">Histamine induces human lung fibroblast-mediated collagen gel contraction via histamine H1 receptor.</a> Experimental lung research. 40, 222-236 (2014).</li>
<li>Kohyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PGD%282%29+modulates+fibroblast-mediated+native+collagen+gel+contraction%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+respiratory+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">PGD(2) modulates fibroblast-mediated native collagen gel contraction.</a> American journal of respiratory cell and molecular biology. 27, 375-381 (2002).</li>
<li>Muir, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Esophageal+epithelial+cells+acquire+functional+characteristics+of+activated+myofibroblasts+after+undergoing+an+epithelial+to+mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">Esophageal epithelial cells acquire functional characteristics of activated myofibroblasts after undergoing an epithelial to mesenchymal transition.</a> Experimental cell research. 330, 102-110 (2015).</li>
<li>Zhong, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+endoplasmic+reticulum+stress+in+epithelial-mesenchymal+transition+of+alveolar+epithelial+cells%3A+effects+of+misfolded+surfactant+protein%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+respiratory+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Role of endoplasmic reticulum stress in epithelial-mesenchymal transition of alveolar epithelial cells: effects of misfolded surfactant protein.</a> American journal of respiratory cell and molecular biology. 45, 498-509 (2011).</li>
<li>Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+cytokines+augments+TGF-beta1-induced+epithelial-mesenchymal+transition+in+A549+cells+by+up-regulating+TbetaR-I%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+motility+and+the+cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Inflammatory cytokines augments TGF-beta1-induced epithelial-mesenchymal transition in A549 cells by up-regulating TbetaR-I.</a> Cell motility and the cytoskeleton. 65, 935-944 (2008).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa etmek herhangi bir çıkar çatışmaları var.

Bu çalışmada geliştirilen protokol iki adımları içerir. İlk adım, ikinci bir basamaklı bir jel tahlili daralma ise, EMT indüklemek için gerçekleştirilir. hücrelerin EMT uygulanan onaylamak için önemli olduğundan, adım 2 morfolojik ve gen ekspresyon değişiklikleri için mükemmel bir tamamlayıcı sağlar. Daha önceki çalışmalar, A549 hücrelerinin EMT, TGF-ß1 sadece 24 tarafından indüklendiğini göstermiştir; Daha önce 10 rapor ettiği gibi, ancak, TNF-α tedavisi EMT ve mezenkimal hücre belirteçleri kazanı...

Fibroz, interstisyel akciğer hastalığı, kardiyak fibroz, karaciğer sirozu, böbrek yetmezliği, terminal, sistemik skleroz, otoimmün hastalık 1 gibi çeşitli kronik progresif hastalıkların patogenezinde rol oynamaktadır. interstisyel akciğer hastalıkları arasında, idiyopatik pulmoner fibrozis (IPF) kronik ilerleyici bir hastalıktır ve kötü prognozu gösterir. IPF patolojik bulgusudur prognoz ile ilişkili olduğu aktive fibroblast ve miyofibroblastlar oluşan fibroblastik odaklar geliştirilmesidir. Bu tür akciğer fibroblast kökenleri aslen ikamet akciğer fibroblastlar dahil olmak üzere ve kemik iliği fibrositlerden dolaşan birkaç mezenkimal hücrelerden, elde edilecek önerilmektedir. Son zamanlarda, epitelyal mezenkimal geçişi (EMT) mezenkimal hücreler 2 oluşumu ile ilişkili olduğu öne sürülmüştür ve fibrotik hastalıkların patogenezine katkıda bulunmak. Bu düşünülmektedir EMT tümör invazyonu ve metastaz 3 olmak üzere fetal gelişim sürecinde önemli roller, yara iyileşmesi ve kanserin ilerlemesini, oynar. EMT süreci takiben, epitel hücreler, E-kadherin gibi epitelyal belirteçleri kaybıyla mezenkimal hücrelerin yeteneği elde etmek ve örneğin vimentin gibi mezenşimal belirteçleri ve α-düz kas aktini (SMA) 4,5 ekspresyonuyla. Önceki çalışmalar EMT süreç böbrek 6 ve akciğer 7 doku fibrozis gelişimi ile ilişkili olduğunu kanıt gösterdi. Ayrıca, kronik inflamasyon fibrotik hastalığı 8 teşvik; Bundan başka, tümör nekroz faktörü üst aile üyesini 14 (TNFSF14; LIGHT) gibi enflamatuar sitokinler, tümör nekroz faktörü (TNF) -a ve interlökin-1, EMT 9-12 geliştirmek için gösterilmiştir. Kollajen jel daralma tahlili, fibroblastlar tip I gömülü olduğu bir kollajen bazlı hücre kasılması deneyikolajen jeli üç boyutlu, kontraktilite değerlendirilmesi için in vitro model bir idealdir. Kontraktilite fibroblast karakteristik işlevlerinden biridir ve normal yara onarımı ve fibrozis 13 katkıda bulunur. Bu deneyde, fibroblast ek bazı koşullar altında, mekanik gerilim üretilmesi için gereken I integrin bağlantılı mekanizmalar vasıtasıyla kolajen tip, ve bunun sonucu olarak doku daralmaya yol düşünülmektedir. Burada, jel daralma deneyinin geliştirilmesi EMT yapılan hücrelerde kontraktil fonksiyonun satın değerlendirmek üzere uyarlanmış olduğu bildirilmektedir. Bu raporda, bu modifiye edilmiş deney EMT uygulanan mezenkimal hücreler kontraktiliteııin değerlendirilmesi için uygun olduğunu göstermektedir.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>sigma aldrich</td><td>11965-092</td><td>A549 ortamı için</td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO</td><td>10437</td><td></td></tr><tr><td>Dönüştürücü Büyüme Faktörü-&beta; 1, İnsan, rekombinant</td><td>Wako Laboratuvar kimyasalları</td><td>209-16544</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant İnsan TNF -&alfa;</td><td>Ar-Ge D sistemleri</td><td>210-TA / CF</td><td></td></tr><tr><td>E-Cadherin (24E10) Tavşan mAb</td><td>Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi</td> <td># 3195</td><td>1: 3.000 seyreltme</td></tr><tr><td>Vimentin (D21H3) Tavşan mAb</td><td>Hücre Sinyal Teknolojisi</td> <td># 5741</td><td>1: 3.000 seyreltme</td></tr><tr><td>Anti-&alfa; -Tubulin antikoru</td><td>sigma aldrich</td><td>T9026</td><td>1: 10.000 seyreltme</td></tr><tr><td>Monoklonal Anti-Aktin, &alfa;-Düz Kas antikoru & nbsp;</td><td>sigma aldrich</td><td>A5228</td><td>1:10.000 seyreltme</td></tr><tr><td>Anti-N-kaderin antikoru</td><td>BD İletim Laboratuvarları</td> <td># 610920</td><td>1: 1.000 seyreltme</td></tr><tr><td>Anti-Fare IgG, HRP'ye Bağlı Bütün Ab Koyunu (ikincil antikor)</td> <td>GE Healthcare</td><td>NA931-100UL</td><td>1: 20.000 seyreltme</td></tr><tr><td>Anti-Tavşan IgG, HRP'ye Bağlı Bütün Ab Eşek (ikincil antikor)</td> <td>GE Healthcare</td><td>NA934-100UL</td><td>1: 20.000 seyreltme</td></tr><tr><td>Engelleme reaktifi</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN418</td><td>TBS-T'de %2</td></tr><tr><td>6 Kuyu Temizle Düz Tabanlı TC ile Muamele Edilmiş Çok Kuyulu Hücre Kültürü Plakası, Kapaklı</td><td>corning</td> <td># 353046</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Hücre kültürü kabı</td><td>TPP</td> <td># 93100</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, toz</td><td>yaşam teknolojileri</td><td>12100-046</td><td>4 kez; DMEM</td></tr><tr><td>Tip 1 kollajen jel</td><td>Nitta jelatin</td><td>Cellmatrix tip IA</td><td></td></tr><tr><td>24 Kuyu hücre kültürü plakası</td><td>AGC TECHNO GLASS</td><td>1820-024</td><td></td></tr><tr><td>Jel Dokümantasyon Sistemi&nbsp;</td><td>ATTO</td><td>AE-6911FXN</td><td>Jel görüntüleyici</td></tr><tr><td>Jel analiz yazılımı</td><td>ATTO</td><td>Densitograph, ver.</td><td>AE-6911FXN</td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA (%0,05), fenol kırmızı</td><td>yaşam teknolojileri</td><td>ile</td> birlikte verilen analiz yazılımı 25300054 <td></td></tr><tr><td>24 Kuyulu Plaka, İşlem Görmemiş</td><td>IWAKI</td><td>1820-024</td><td></td></tr><tr><td>Tripan Mavisi Çözeltisi, %0,4Yaşam Teknolojileri</td><td></td> <td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>RNA ekstraksiyon kiti</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>Ters transkriptaz</td><td>yaşam teknolojileri</td><td>18080044</td><td></td></tr><tr><td>Gerçek zamanlı PCR sistemi</td><td>Stratagene</td><td>Mx-3000P</td><td></td></tr><tr><td>SYBR yeşil PCR kiti</td><td>Qiagen</td><td>204145</td><td></td></tr><tr><td>Proteaz İnhibitörü Kokteyli (100x)</td> <td>yaşam teknolojileri</td><td>78429</td><td></td></tr><tr><td>PVDF membranı</td><td>ATTO</td><td>2392390</td><td></td></tr><tr><td>Protein tahlil kiti</td><td>bio-rad</td><td>5000006JA&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Poliakrilamid jel</td><td>ATTO</td><td>2331810</td><td></td></tr><tr><td>Batı lekeleme tespit reaktifi</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN2232</td><td></td></tr><tr><td>Soğuk CCD kamera</td><td>ATTO</td><td>Ez-Capture MG / ST</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin inhibitörü</td><td>sigma aldrich</td><td>T9003-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Polioksietilen (20) Sorbitan Monolaurat</td><td>Wako Laboratuvar kimyasalları</td><td>163-11512</td><td></td></tr><tr><td>Polioksietilen (9) oktifenil eter</td><td>Wako Laboratuvar kimyasalları</td><td>141-08321</td><td></td></tr></tbody></table>

bir gelişimi<em&gt; İn vitro</em&gt; deney mezenkimal hücreleri uyguladığımız epitel-mezenkimal geçiş kasılma fonksiyonu değerlendirin

Development of an In Vitro Assay to Evaluate Contractile Function of Mesenchymal Cells that Underwent Epithelial-Mesenchymal Transition

Fibrozis sıklıkla interstisyel akciğer hastalığı gibi çeşitli kronik ilerleyici hastalıkların patogenezinde rol oynar. Patolojik ayırt edici özellik, hastalık şiddeti ile ilişkili olan fibroblastik odakların oluşumudur. Fibroblastik odaklardan oluşan mezenkimal hücrelerin, başlangıçta yerleşik intrapulmoner fibroblastlar ve kemik iliğinden dolaşımdaki fibrositler dahil olmak üzere çeşitli hücre kaynaklarından türetildiği öne sürülmektedir. Son zamanlarda, epitelyal-mezenkimal geçiş (EMT) geçiren mezenkimal hücrelerin de fibrozis patogenezine katkıda bulunduğu düşünülmektedir. Ek olarak, EMT, büyüme faktörü β dönüştürülerek indüklenebilir ve EMT, tümör nekroz faktörü α gibi pro-inflamatuar sitokinler tarafından arttırılabilir. Jel kasılma testi, fibroblastların karakteristik fonksiyonlarından biri olan ve yara onarımı ve fibrozise katkıda bulunan kontraktilitenin değerlendirilmesi için ideal bir in vitro modeldir. Burada, EMT uygulanan mezenkimal hücrelerin kasılma yeteneğini değerlendirmek için bir jel kasılma testinin geliştirilmesi gösterilmiştir.

EMT sırasında, epitel hücreleri E-kaderin gibi epitel belirteçleri, kaybetmek ve bu vimentin ve α-düz kas 4,5 aktin olarak mezenkimal belirteçler, ifadesini kazanır. TGF-ß1 ve TNF-a ile A549 insan akciğer epitel hücrelerine inkübasyonu EMT indükler. Normal A549 hücrelerinin görünümü epitel hücreleri (Şekil 3A) bir özelliğidir şekil ve üçgen şekli gibi çakıl taşı, ancak, TGF-ß1 ve TNF-a ile uyarılmış sonra görünümü mezenşimal benzer uzun bir mil bir biçime hücr...

Burada, epitelyal-mezenkimal geçiş geçiren mezenkimal hücrelerde kasılma fonksiyonunu değerlendirmek için bir jel kasılma testinin geliştirilmesini ve uygulanmasını açıklıyoruz.

Bir Gelişimi<em&gt; İn Vitro</em&gt; Deney Mezenkimal Hücreleri Uyguladığımız Epitel-Mezenkimal Geçiş kasılma Fonksiyonu değerlendirin

Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is ...

Bu prosedürün genel amacı, in vitro inflamatuar sitokin kaynaklı epitelyal mezenkimal geçiş veya EMT geçiren mezenkimal hücrelerin kasılmasını değerlendirmektir. Bu mezenkimal EMT'den sonra, idiyopatik pulmoner fibroz veya şiddetli astımda hava yolunun yeniden şekillenmesi gibi inflamatuar immün yanıtların neden olduğu temel hücre fonksiyonunun bir varyasyonudur. Bu tekniğin temel avantajları, özel cihazlar gerektirmemesi ve yüksek bir içerik göstermesidir. İşlemin demonte edilmesi, laboratuvarımdan Hideyuki Takeshima ve Kosuke Makita yüksek lisans öğrencileri olacak.A-549 insan akciğer epitel hücrelerinin bir kültürünü beş ila on mililitre PBS ile yıkayarak başlayın. Daha sonra, yapışan hücreleri 37 santigrat derece ve yüzde beş karbondioksitte iki milileter tripsin-EDTA ile ayırın. Üç dakika sonra, hücre süspansiyonunu hücre kültürü ortamı içeren konik tüplere aktarın ve hücreleri bir santrifüjde döndürün.Peletleri iki mililitre hücre kültürü ortamında yeniden süspanse edin ve sayım için küçük bir belagat ayırın. Daha sonra, on santimetre polisteren kabı başına on milileter ortamda 0.5 ila 1 çarpı 10 ila 6. hücreleri tohumlayın ve hücre kültürlerini 24 saat inkübe edin. EMT indük

development-an-vitro-assay-to-evaluate-contractile-function

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Biz bir fare ES hücre tabanlı testin Wnt / β-katenin ve kardiyojenik indüksiyon sırasında BMP sinyal aktivasyonu için kritik zaman pencere tanımlamak için kullandıklarını açıklarlar. Bu yöntem, güvenilir bir kardiyojenik verimliliği rakamlarla standart bir platform sağlar ve diğer hücre soylarının çalışma için geçerlidir.

Kardiyojenik İndüksiyon Verimlilik miktarının için modifiye Fare Embriyonik Kök Hücre tabanlı Testi

Kranial mezenşimi muhtemel nöral kıvrımların yükselmesi için bir itici güç sağlar dramatik morfojenik hareketleri...

Kranial mesenchyme Hücresel Davranış Değerlendirme için bir Eksplantasyon Assay

Doğrudan bir yöntem, hücre tiplerinde çeşitli mezenkimal geçiş (EMT) epitel indüklenmesi için tarif edilmektedir. Immünositokimya EMT eyalette hücrelerin analiz yöntemleri dahildir.

Mezenkimal Geçiş indüksiyon ve Epitel Analizi

Alternatif ekleme düzenlemesinin, çeşitli fizyolojik ve patolojik süreçlerde önemli bir hücresel program olan epitelyal-mezenkimal geçişe (EMT) katkıda bulunduğu gösterilmiştir. Burada, EMT sırasında alternatif eklemenin tespiti için indüklenebilir bir EMT modeli kullanan bir yöntemi açıklıyoruz.

Epitel-Mezenkimal Geçiş sırasında alternatif birleştirme Algılama

Burada, birincil fare epikardiyal hücrelerini bir büyüme kültürü testi ile izole etme ve bir ex vivo kalp kültürü sistemi kullanarak epikardiyal türevli hücrelerin (EPDC) fonksiyonel göçünü değerlendirme yöntemlerini açıklıyoruz. Bu protokoller, epikardiyal epitelyal-mezenkimal geçiş (EMT) ve motilitenin genetik ve kimyasal modülatörlerini tanımlamak için uygundur.

Epikardiyal dışsal gelişimi Kültürü Deneyi ve<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Epikardiyal türetilmiş Hücre Göç Değerlendirilmesi

Epitelden mezenkimal geçişe (EMT) kanserlerin invaziv hale gelmesine izin verir. EMT'yi araştırmak için, serum ve enzimlerden yoksun bir nöral kök hücre (NSC) tabanlı in vitro model tanımlanmıştır. Bu standartlaştırılmış sistem, hücre göçünün, gen ve protein ekspresyonunun kantitatif ve kalitatif değerlendirmesine izin verir. Model, ilaç keşfi için uygundur.

Ilaç keşfi için uygundur EMT araştırma için enzim ve serum içermeyen nöral kök hücre kültürü modeli

sığır endotel hücrelerinin ana bir kültürü kornea endotelial-mezenkimal geçiş mekanizmasını araştırmak için kullanıldı. Ayrıca, bir fare endotel cryoinjury modeli in vivo olarak endotel-mezenkimal geçiş göstermek için kullanılmıştır.

Vitro ve in vivo Modelleri Kornea Endotel-mezenkimal Geçiş Çalışması için

Epicardium hücreleri ve büyüme faktörleri miyokardiyal duvara sağlayarak geliştirme ve onarım kalp önemli bir rol oynar. Burada, çalışma ve gelişimsel ve yetişkin özellikleri karşılaştırma sağlar kültür insan birincil epicardial hücreleri yöntemine açıklayın.

Yalıtım ve kültür insan yetişkin ve Fetal kalp örnekler elde edilen birincil Epicardial hücre

Biz silikon kauçuk (PDMS) ile imal yüksek verim çekiş kuvveti tahlil sunuyoruz. Bu roman tahlil çeşitli biyolojik ve Biyomedikal süreçler ve hastalıklar sırasında hücre kontrazlığı fiziksel değişiklikler okumak için uygundur. Bu yöntemin yardımcı programını, epitelyal-mesenkimal geçiş sırasında bir TGF-β bağımlılık artışına göre ölçerek gösteriyoruz.

PDMS kullanarak yüksek verim çekiş kuvveti mikroskobu dönüşüm büyüme faktörü-β epitelyal-mezenkimal geçiş üzerinde doz bağımlı etkileri ortaya çıkarır

Bu çalışma, floresan olarak etiketlenmiş elastomerik büzülebilir yüzeyler (FLECS) Teknolojisini, floresan protein mikrodesenlerinin görselleştirilmiş yer değiştirmelerine dayanan tek hücreli kontraktil kuvvetlerin basitleştirilmiş, eller kapalı nicelleştirilmesi için mikrowell formatında kullanmak için esnek bir protokol sunmaktadır.

Mikrodesenli Elastomerler Kullanarak Tek Hücreli Kasılmanın Basitleştirilmiş, Yüksek Verimli Analizi

Bu protokol, 3D mühendislik ürünü kalp ve iskelet kası dokularının oluşturulması için yöntemler sağlar ve klinik öncesi ilaç tarama modalitelerinde kullanımlarını açıklar. Açıklanan yöntemler, 24 dokunun paralel olarak eşzamanlı olarak değerlendirilmesini kolaylaştırmak için manyetik bir algılama sistemi kullanır.

Ölçeklenebilir 3D Mühendislik Kas Dokularında Preklinik İlaç Testi

Öğrenin, jel kasılma deneyi ile epitel-mezenkimal geçiş sonrası mezenkimal hücrelerin kasılma fonksiyonunu değerlendirin. Bu yöntem, iltihabi bağlamdaki hücre davranışlarını anlamak için yüksek içerikli ve tekrarlanabilir sonuçlar sunar.

Bir Gelişimi

Daha fazla video keşfet