Kardiyojenik İndüksiyon Verimlilik miktarının için modifiye Fare Embriyonik Kök Hücre tabanlı Testi

Aşağıdaki deneyin genel amacı, fare embriyonik kök hücrelerinde kardiyomiyosit farklılaşması için gerekli olan kritik zamansal düzenlemeyi belirlemektir. Bu, öncelikle EB oluşumunu standardize etmek amacıyla 96 kuyucuklu yuvarlak tabanlı bir plakada embriyonik cisimlerin oluşturulmasıyla gerçekleştirilir; ikinci adımda ise, incelenen yolakların zamansal kontrolüne olanak tanımak için protein veya kimyasal modülatörler önceden belirlenmiş bir zaman çizelgesinde EB'lere eklenir.

Ardından, çeşitli sinyal modülasyon şemalarının indüksiyon verimliliğini belirlemek için atan EBS'ler manuel olarak sayılır. Oluşan atan EBS yüzdesi ve asılı damla yöntemi kullanılarak yapılan doğrulama temelinde, kardiyomiyosit farklılaşması için gerekli olan sinyal yollarının zamansal gereksinimlerini gösteren sonuçlar elde edilir. Bu tekniğin asılı damlalar gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, iş gücü yoğun bir prosedürü standartlaştırıp basitleştirmesi ve nicelleştirme için doğrudan bir okuma imkanı sağlamasıdır.

Bu yöntem, farklılaşmayı istenen hücre tipine yönlendiren temel sinyal koagülasyonlarının belirlenmesi gibi kök hücre biyolojisi alanındaki kritik soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu prosedüre başlamak için, fare embriyonik kök hücrelerini, lösemi inhibitör faktörü ile desteklenmiş fare ES hücresi besiyerinin bulunduğu 10 santimetrelik hücre kültürü plaklarında büyütün. ES hücreleri %50 ila %70 konfluense ulaştığında kullanıma hazırdır.

ES medyumunu uzaklaştırın ve hücreleri beş mililitre steril PBS ile bir kez durulayın. Her plakaya iki mililitre %0,05 tripsin EDTA ekleyin ve plakaları 37 °C'de üç ila beş dakika inkübe edin. Ardından, plak başına üç mililitre ES medyumu ile tripsin EDTA işlemini sonlandırın ve hücreleri 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın.

Dakikada 1000 devirde üç dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüj işleminden sonra süpernatantı uzaklaştırın ve hücre peletini istenen miktarda EB medyumu ile yeniden süspande edin. Hücre sayısını belirleyin ve ardından hücreleri mililitre başına 5 × 10³ hücre olacak şekilde dilüe edin.

Çok kanallı bir pipet kullanarak, hücre içeren 100 µL EB ortamını 96 kuyucuklu yuvarlak tabanlı bir mikrotitrasyon plağının her bir kuyucuğuna ekleyin. Gereken 96 kuyucuklu plak sayısı, deneyin koşul ve zaman noktası sayısına bağlı olarak değişecektir. Kardiyogenez için temel sinyal yolaklarının kritik zaman pencerelerini belirlemek amacıyla, 96 kuyucuklu yuvarlak tabanlı mikrotitrasyon plaklarını nemlendirilmiş 37 °C %5 CO2 inkübatöre yerleştirin.

ES hücrelerine spesifik sinyal yolaklarının modülatörleri eklenir. 96 kuyucuklu yuvarlak tabanlı plakalardaki her bir kuyucuğa, medyum içinde seyreltilmiş sinyal modülatörü çeşitli zaman noktalarında eklenir. Her bir 96 kuyucuklu plakadaki kuyucukların yarısı, her bir başlangıç tedavi zaman noktası için kullanılır.

Her zaman noktası için diğer 48 kuyucuğa bir araç kontrolü eklenir. Farklı durdurma noktalarında, besiyerini değiştirerek her kuyucuktaki sinyal modülatörlerini yıkayacağız; bu işlem sırasında embriyonik gövdelerin bozulmasını önlemek için büyük özen gösterilmelidir. Farklı durdurma zaman noktalarında, kuyucuklardaki EB besiyerini değiştirerek modülatörleri yıkayın. 96 kuyucuklu plakayı yaklaşık 10 derecelik bir açıyla eğin ve besiyerini çok kanallı bir pipetle kuyucuktan nazikçe uzaklaştırın.

Ardından, 48 saatten daha uzun süren tüm işlemler için her kuyucuğa modülatör içermeyen EB medyumunu geri ekleyin. İstenilen durdurma zamanına kadar her iki günde bir, taze modülatörlerle desteklenmiş EB medyumunu değiştirin. ES hücrelerinin 96 kuyucuklu plakalara aktarılmasıyla EBS'lerin indüklendiği tarihten yedi gün sonra, EB kontraksiyonunu mikroskop altında inceleyin.

Her bir farklı işlem zaman seyri için kasılan EBS yüzdelerini elde etmek amacıyla, kasılan EBS içeren kuyucukları pozitif olarak skorlayın. 96 kuyucuklu plaka deneyleriyle belirlenen kardiyogenez sinyalizasyon zaman pencereleri, asılı damla yönteminden oluşturulan EBS'lerde doğrulanabilir; bunun için asılı EB damlacıkları hazırlayın. İlk olarak, damlacıkların daha sonra sapmasını önlemek için Petri kaplarına üç ila dört mililitre PBS ekleyerek hazırlayın.

Ardından, final yoğunluğu 2,5 × 10⁴ hücre/mL olacak şekilde hazırlanan bir ES hücre süspansiyonu, kolay erişim için bir bakteri kabına boşaltılır. Çok kanallı bir pipet kullanarak, Petri kaplarının ters çevrilmiş kapaklarına 20 µL'lik ES hücresi damlaları ekleyin. Münferit damlacıkların birbirine temas etmesine izin vermeyin.

Genellikle, bir kapak 80 damlaya kadar alabilir. Ardından, kapağı PBS içeren Petri kabının üzerine tekrar kapatın ve EB oluşumuna izin vermek için 37 °C ve %5 karbon dioksit içeren bir inkübatörde 48 saat boyunca inkübe edin. 48 saat sonra, her kapağın asılı damlalarından oluşan EB'leri üç mililitre EB medyumu ile yıkayarak aşağı indirin.

İki EBS kapağını yeni bir Petri kabına alın. Petri kabını 37 °C'de, %5 karbondioksit içeren bir inkübatörde dört gün boyunca inkübe edin. Dördüncü günde, süspansiyon halindeki EBS'leri genel olarak %0,2 Jelatin kaplı altı kuyucuklu plakalara aktarın. Her kuyucuğa 30 EBS aktarılır; sinyal modülatörlerini, 96 kuyucuklu plaka deneylerinde belirlenen zaman diliminde inkübe edin; bu işlem asılı damlacıklar oluşturulduktan yedi gün sonra gerçekleştirilir.

EB kontraksiyonu için EBS'leri mikroskop altında gözlemleyin; 96 kuyucuklu bir plakanın yuvarlak tabanlı kuyucuklarında büyütülen ES hücreleri, dördüncü günde oluşmuş bir EB'yi gösteren bu temsilci görüntüde olduğu gibi EBS oluşturacaktır. ES kardiyogenezi için kritik zaman noktaları, sinyal modülatörleri ile işlem görmüş gruplarda, taşıyıcı kontrolle karşılaştırıldığında kontraksiyon gösteren EBS'lerin en yüksek yüzdeye sahip olduğu zaman pencereleridir. Burada, 96 kuyucuklu bir mikrotitrasyon plakasında, diferansiyasyonun 10. gününde dorsal morfin ile işlem görmüş ES hücrelerinden oluşmuş, kendiliğinden kontraksiyon yapan bir kardiyomiyosit odağı gösterilmektedir.

Bu videoyu izledikten sonra, ES kardiyojenezi sırasında temel sinyal yollarının kritik zamansal düzenleme pencerelerinin nasıl verimli bir şekilde tanımlanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.