Kardiyojenik İndüksiyon Verimlilik miktarının için modifiye Fare Embriyonik Kök Hücre tabanlı Testi

Aşağıdaki deneyin genel amacı, fare embriyonik kök hücrelerinde kardiyomiyosit farklılaşması için gerekli olan önemli zamansal düzenlemeyi belirlemektir. Bu, ikinci adım olarak EB oluşumunu standartlaştırmak için önce 96 kuyucuklu yuvarlak bir alt plakada embriyonik cisimlerin oluşturulmasıyla elde edilir. Protein veya kimyasal modülatörler, önceden belirlenmiş bir zaman seyri boyunca EBS'ye eklenir ve bu da incelenen yolların zamansal kontrolüne izin verir.

Daha sonra, çeşitli sinyal modülasyon şemalarının indüksiyon verimliliğini belirlemek için yenen EBS'ler manuel olarak ölçülür. Kardiyomiyosit farklılaşması için temel sinyal yollarının zamansal gereksinimlerini gösteren sonuçlar, oluşan atım EBS yüzdesine ve asılı damla yöntemi kullanılarak doğrulanmaya dayalı olarak elde edilir. Bu tekniğin asılı damlalar gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, emek yoğun bir prosedürü standartlaştırması ve basitleştirmesi ve miktar tayini için basit bir okumaya izin vermesidir.

Bu yöntem, kök hücre biyolojisi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir, örneğin farklılaşmayı istenen hücre tipine yönlendiren temel sinyal pıhtılaşmasının tanımlanması Bu prosedüre başlamak için. Lösemi inhibitör faktörü ile desteklenmiş fare ES hücre ortamı ile 10 santimetre hücre kültürü plakalarında Gro fare embriyonik kök hücreleri. ES hücreleri %50 ila 70 oranında birleştiğinde kullanıma hazırdırlar.

ES ortamını çıkarın ve hücreleri beş mililitre steril PBS ile bir kez durulayın. Her plakaya iki mililitre% 0.05 tripsin EDTA ekleyin ve plakaları üç ila beş dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra, plaka başına üç mililitre ES ortamı ile EDTA'daki açmaları söndürün ve hücreleri 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın.

Üç dakika boyunca dakikada 1000 dönüşte döndürün. Santrifüjlemeden sonra, supinatı çıkarın ve hücre peletini istenen miktarda EB ortamı ile yeniden süspanse edin. Hücre sayısını sayın ve ardından hücreleri mililitre başına üç hücreye 10 kez beş kez seyreltin.

Çok kanallı bir pipet kullanarak EB ortamında, 96 yuvarlak tabanlı kuyucuklu mikrotitre plakasının her bir oyuğuna 100 mikrolitre EB ortamı içeren hücreler ekleyin. Gerekli olan 96 kuyu plakasının sayısı, deneyin koşul sayısına ve zaman noktalarına bağlı olacaktır. Kardiyo oluşumu için anahtar sinyal yollarının kritik zaman pencerelerini belirlemek için 96 yuvarlak tabanlı kuyu mikrotitre plakasını nemlendirilmiş 37 santigrat derece %5 karbondioksit inkübatörüne yerleştirin.

ES hücrelerine spesifik sinyal yollarının modülatörleri eklenir. 96 yuvarlak dip kuyu plakasında, çeşitli zaman noktalarında her bir oyuğa ortamda seyreltilmiş olan sinyalizasyon modülatörünü ekleyin. Her 96 oyuklu plakadaki kuyucukların yarısı, tedavinin her başlangıç zaman noktası için kullanılır.

Her bir zaman noktası için diğer 48 kuyuya bir araç kontrolü eklenir Farklı durma noktalarında, ortamı değiştirerek her kuyudan sinyalizasyon modülatörlerini yıkayacağız ve bunu yaparken embriyonik cisimlerin bozulmasını önlemek için büyük özen gösterilmelidir. Kuyular için EB ortamını değiştirerek modülatörleri yıkayın. 96 oyuklu plakayı yaklaşık 10 derecelik bir açıyla eğin ve ortamı çok kanallı bir pipetle kuyudan nazikçe çıkarın.

Ardından, 48 saatten daha uzun herhangi bir tedavi için her bir oyuğa modülatör olmadan EB ortamını geri ekleyin. İstenen durma süresine kadar her iki günde bir yeni modülatörlerle desteklenmiş EB ortamını değiştirin. EBS'nin indüklenmesinden yedi gün sonra, ES hücrelerinin 96 kuyucuklu plakalara aktarılmasıyla EB kasılmasını mikroskop altında inceleyin.

Her farklı tedavi süresi kursu için EBS sözleşmeli EBS'nin yüzdelerini elde etmek için sözleşmeli EBS'li kuyuları pozitif olarak puanlayın. 96 kuyulu plaka deneyleri ile tanımlanan kardiyo oluşumu için sinyalleşmenin zaman pencereleri, asılı EB damlacıkları yapmak için asılı damlacıklardan yapılan EBS'de doğrulanabilir. İlk olarak, daha sonra damlacıkların sapmasını önlemek için üç ila dört mililitre PBS ekleyerek Petri kapları hazırlayın.

Daha sonra, mililitrede 10 ila dört hücrenin 2.5 katı nihai yoğunlukta hazırlanan bir ES hücre süspansiyonu, kolay erişim için bir bakteri kabına dökülür. Çok kanallı bir pipet kullanarak, Petri kaplarının ters çevrilmiş kapaklarına 20 mikrolitrelik damla ES hücresi ekleyin. Tek tek damlacıkların birbirine temas etmesine izin vermeyin.

Genel olarak, bir kapak 80 damlaya kadar sığabilir. Ardından, EB oluşumuna izin vermek için kapağı PBS içeren Petri kabının üzerine geri çevirin ve 37 santigrat derece %5'lik bir karbondioksit inkübatörde 48 saat inkübe edin. 48 saat sonra, her kapaktan asılı damlacıklardan oluşan EBS'yi üç mililitre EB ortamı ile yıkayın.

EBS'nin iki kapağını yeni bir Petri kabına çekin. Petri kabını 37 santigrat derece %5 karbondioksit inkübatöründe dört gün boyunca inkübe edin, dördüncü günde EBS'yi süspansiyon halinde genel olarak %0.2 Jelatin kaplı altı kuyucuklu plakaya aktarın. 30 EBS, asılı damlacıkların yapılmasından yedi gün sonra 96 kuyu plakası deneyinden tanımlanan zaman periyodunda her bir kuyu inkübasyon sinyal modülatörüne aktarılır.

EB kasılması için mikroskop altında EBS'yi gözlemleyin: 96 oyuklu bir plakanın yuvarlak dipli kuyucuklarında büyüyen ES hücreleri, dördüncü günde oluşan bir EB'nin bu temsili görüntüsünde gösterildiği gibi EBS'yi oluşturacaktır. ES kardiyo oluşumu için kritik zaman noktaları, araç kontrolü ile karşılaştırıldığında, sinyal modülatörleri tarafından tedavi edilen EBS'nin en yüksek kasılma yüzdesini içeren zaman pencereleridir. Burada, 96 kuyulu bir mikrotitre plakası üzerinde farklılaşmanın 10. gününde dorsal morfin ile muamele edilmiş ES hücrelerinden oluşan kardiyomiyositlerin kendiliğinden kasılan bir odağı gösterilmektedir.

Bu videoyu izledikten sonra, kritik zamansal düzenlemeyi, ES kardiyo oluşumundaki temel sinyal yollarının pencerelerini nasıl verimli bir şekilde tanımlayacağınızı iyi anlamış olmalısınız.