Pasif kullanımı Netlik Fare Merkezi Sinir Sistemi Optik Takas

Bu protokolün genel amacı, orijinal CLARITY protokolünde daha tutarlı ve maliyet etkin sonuçlar veren modifikasyonları göstermektir. Bu yöntem; merkezi sinir sistemindeki 3B morfoloji ve bağlantısallık gibi nörobilimdeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, fare merkezi sinir sistemindeki optik şeffaflaştırma ve mikroskobinin tutarlılığını artırmasıdır.

Maliyet etkin ve tekrarlanabilir bir şekilde. Görüntüleme odasının kurulumu karmaşık olduğundan ve yazılı açıklamadan kolayca anlaşılamadığından, bu yöntemin görsel gösterimi kritik önem taşımaktadır.

Floresan proteinler eksprese eden farelerden paraformaldehit ile fikse edilmiş beyin ve omurilik dokusu temin edin. Beyni plastik bir fare beyni matrisine yerleştirerek ve orta hat boyunca bir matris bıçağıyla keserek hemisekte edin. Her bir hemisferi ve omuriliği ayrı 50 mililitrelik santrifüj tüplerine ekleyin.

Her biri 40 mililitre hidrojel çözeltisi içeren tüpler. Floroforları korumak için tüpleri alüminyum folyo ile kapatın. Örnekleri ve hidrojeli içeren tüpleri, hafifçe çalkalayarak yedi gün boyunca dört derece santigrat sıcaklıkta inkübe edin.

İnkübasyon süresinin ardından, santrifüj tüpünde numune ve yaklaşık 25 mililitre hidrojel kalacak şekilde 25 mililitre hidrojeli atın. Ardından, kapağı çıkarıp santrifüj tüpünü bir desikatör kavanozuna yerleştirerek ve kavanozu vakuma bağlayarak numuneden oksijeni uzaklaştırın. Vakumu en az 10 dakika boyunca uygulayın.

Yayılan oksijen kabarcıklarını uzaklaştırmak için nazikçe çalkalayın. 10 dakika sonra, desikatör kavanozundaki vakumu iki ila üç dakika içinde %100 azot gazı ile değiştirin. Basınç dengelendiğinde ve desikatör kavanozunun üst kısmı açılabildiğinde, oksijenin yeniden girmesini önlemek için tüpü hızla kapatın.

Ardından, polimerizasyon tamamlanana kadar, numunenin bulunduğu tüpü üç saat boyunca 37 °C'lik bir su banyosuna yerleştirerek hidrojeli polimerize edin. Üç saat sonra polimerize olan hidrojel, jel benzeri bir kıvam alacaktır. Polimerize numuneyi santrifüj tüpünden çıkarmak için bir spatula kullanın ve ardından numunedeki fazla hidrojeli kesin.

Son olarak, örneği tüy bırakmayan bir mendilin üzerine yerleştirip dokuyu üzerinde nazikçe ovalayıp yuvarlayarak kalan hidrojeli temizleyin; böylece örnek üzerinde yalnızca ince bir polimerize hidrojel tabakası kalsın. Lipid uzaklaştırma işlemine başlamak için, polimerize örneği 45 mL şeffaflaştırma tamponu içeren temiz bir 50 mL santrifüj tüpüne aktarın ve hafif çalkalama ile 45 °C'de yedi gün boyunca inkübe edin. Bu ilk yedi günlük süre boyunca, kullanılan şeffaflaştırma tamponunu bir kimyasal atık konteynerine dökerek tamponu her gün değiştirin.

Ardından 45 mililitre taze berraklaştırma tamponu ekleyin. Tüm lipidler çözüldüğünde ve doku şeffaflığa ulaştığında, örneği 45 mililitre PBST ile doldurulmuş yeni bir 50 mililitre santrifüj tüpüne aktarın ve kalıntı SDS'yi uzaklaştırmak için sonraki 24 saat boyunca 40 °C'de hafifçe çalkalayarak dört kez yıkayın. Son PBST yıkamasından sonra, örneği 1 µg/mL DAPI ve 1xPBST ile doldurulmuş temiz bir 15 mililitre santrifüj tüpüne aktarın.

Folyo ile sarın ve oda sıcaklığında 24 saat inkübe edin. Ertesi gün, oda sıcaklığında, yıkama başına en az altı saat olacak şekilde PBST ile üç kez yıkayın. Ardından kırma indisi eşleme işlemine geçin.

Prosedürün bu bölümüne başlamak için, örneği 2-2 thiodiethanol ve pH 7,5'te 1xPBS ile doldurulmuş temiz bir 15 mililitrelik santrifüj tüpüne aktarın ve ekranda gösterildiği şekilde inkübe edin. İkinci inkübasyonun sonuna doğru, yeniden kullanılabilir bir yapışkan parçasını örneğin kalınlığından sadece biraz daha geniş, tek tip bir çapta silindir haline getirerek bir görüntüleme odası oluşturun. Silindiri, 40 milimetrelik cam tabanlı bir kabın içinde uçları açık bir daire şeklinde yerleştirin.

Ardından, P1000 pipet ucunu silindirin dış kenarı boyunca döndürerek yeniden kullanılabilir yapışkan ile cam arasında bir sızdırmazlık oluşturun. Cam petri kabının üzerine yaklaşık 100 µL %63 TDE pipetleyin ve yeniden kullanılabilir yapışkanın oluşturduğu daire içindeki cam yüzeyi kaplayacak şekilde yayın. Daha sonra, hava kabarcığı oluşmamasına dikkat ederek örneği bir spatula yardımıyla dikkatlice dairenin ortasına yerleştirin.

Ardından, örneğin üzerine doğrudan 100 µL %63 TDE pipetleyin ve hemen yeniden kullanılabilir yapışkanın üzerine 40 mm çapında dairesel bir lam kapatın. Lam örnekle temas edene kadar, her iki elinizin işaret, orta ve yüzük parmaklarını kullanarak dairenin çevresine dikkatlice bastırın. Şimdi, cam tabanlı kabı yavaşça bir yüzeye yaslayarak dik konuma getirin ve ardından çözelti üstteki küçük açıklığa ulaşana kadar bir pipetle %63 TDE ekleyin.

Çözeltinin cama damlamasını önlemek için pipet ucunu tüy bırakmayan bir bezle kurulayın. Son olarak, daireyi kapatmak ve kapalı bir bölme oluşturmak için küçük açıklığa silikon elastomer ekleyin. Kuruması için beş dakika bekleyin ve ardından görüntülemeye geçin.

İçinde örneğin bulunduğu görüntüleme haznesini bir lazer taramalı konfokal mikroskobun tablasına yerleştirin. Görüntüleme yazılımını açın; argon eksitasyon lazerini çalıştırmak için programın üst kısmındaki konfigürasyon sekmesine, ardından lazer simgesine tıklayın. Lazeri açmak için argon seçeneğinin yanındaki kutucuğu işaretleyin ve sürgü ölçeğini %30'a getirin. Üst kısımdaki görüntüleme sekmesine geri dönün.

Işın yolu ayarları kutusunda, yükle-kaydet ayarları kutusuna gidin ve YFP yaymak için uygun dalga boyu kanalını seçmek üzere açılır menüyü kullanın. Kanal ayarları kutusunda, "objective current object" etiketli kırmızı hiperliğe tıklayarak görüntüleme için uygun objektifleri seçin. Çalışma mesafesi doku kalınlığından daha büyük olan objektifleri kullanın.

Düzlem içi görüntü çözünürlüğünü maksimize etmek ve optik kesit kalınlığını minimize etmek için geniş bir sayısal açıklık kullanılır. Sol sütundaki açılır menülerden, format olarak adlandırılan görüntüleme matrisini 1024x1024'e veya objektifin lateral çözünürlük sınırına uygun bir değere ayarlamak için XY çözünürlük penceresini açın. Zoom faktörünü mümkün olduğunca düşük ayarlayın.

Burada 1.7 kullanılmıştır. Aynı pencerede, ilgili etiketli menüleri açarak sekizinci satır ortalaması ve tek kare ortalaması parametrelerini ayarlayın. Sahne kontrollerini kullanarak örneği bulun.

Temsili bir alan görünür olduğunda, YFP için kazancı (gain) 760 ile 780 arasına, kaydırmayı (offset) ise 1.0 ile 1.5 arasına ayarlayın. Karo tarama (tile scan) seçeneğini seçin. Ardından, elde edilecek Z-yığını (Z stack) için üst ve alt sınırları belirleyin.

Optik kesit kalınlığını, objektifin optik kesit çözünürlük sınırına göre ayarlayın ve ardından veri toplama işlemini başlatın. Bu görüntü, serebral korteks ve hipokampustaki YFP pozitif nöronların 5x büyütme ile görüntülenmiş ve 3D olarak yeniden yapılandırılmış halini göstermektedir. Ölçek çubuğu bir milimetreyi temsil etmektedir.

Serebral korteksin 10x görüntü yığınından elde edilen bu maksimum yoğunluk projeksiyonu, kortikal beşinci tabaka piramidal nöronlarının dendritik dallanmasını göstermektedir. Buradaki ölçek çubuğu 100 mikronu temsil eder. Burada, 5x büyütme ile görüntülenen ve 3D olarak yeniden yapılandırılan, sağlam bir servikal ve torasik omurilikte THY-1YFP ekspresyonu gösterilmektedir.

Ölçek çubuğu iki milimetreyi temsil etmektedir. Son olarak, omuriliğin 10x görüntüleme yığınına ait bu maksimum yoğunluk projeksiyonu, tekil aksonları göstermektedir; ölçek çubukları 100 mikronu temsil etmektedir. Doğru şekilde gerçekleştirildiğinde, bu teknik tüm omurilikler için iki ila dört hafta, hemisekt edilmiş beyinler için ise dört ila altı hafta içinde tamamlanabilir.

Bu prosedürün ardından, daha karmaşık biyokimyasal fenotipleme gerektiren soruları yanıtlamak için immünohistokimya gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, pasif berraklaştırma ve lazer konfokal mikroskopi kullanarak, bir fare merkezi sinir sisteminin optik olarak nasıl berraklaştırılacağı ve görüntüleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.