Pasif kullanımı Netlik Fare Merkezi Sinir Sistemi Optik Takas

Bu protokolün genel amacı, orijinal CLARITY protokolünde daha tutarlı ve uygun maliyetli sonuçlar veren değişiklikleri göstermektir. Bu yöntem, 3D morfoloji ve merkezi sinir sistemindeki bağlantı gibi sinirbilimdeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, fare merkezi sinir sisteminde optik temizleme ve mikroskopi tutarlılığını arttırmasıdır.

Uygun maliyetli ve tekrarlanabilir bir şekilde. Bu yöntemin görsel gösterimi çok önemlidir. Görüntüleme odası yapısı karmaşık olduğundan ve yazılı açıklamadan kolayca anlaşılamadığından.

Floresan proteinleri eksprese eden farelerden paraformaldehit sabit beyin ve omurilik dokusu elde edin. Beyni plastik bir fare beyin matrisine yerleştirerek ve bir matris bıçağıyla orta hat boyunca keserek kesin. 50 mililitrelik santrifüj tüplerini ayırmak için her yarım küreyi ve omuriliği ekleyin.

Her biri 40 mililitre hidrojel çözeltisi içerir. Floroforları korumak için tüpleri alüminyum folyo ile örtün. Ve numuneler ve hidrojel içeren tüpleri yedi gün boyunca hafifçe çalkalayarak dört santigrat derecede inkübe edin.

Kuluçka süresinin ardından, numuneyi bırakan 25 mililitre hidrojeli ve santrifüj tüpünde yaklaşık 25 mililitre hidrojeli atın. Daha sonra, kapağı çıkararak, santrifüj tüpünü bir kurutucu kavanoza yerleştirerek ve kavanozu bir vakuma bağlayarak numunenin oksijenini giderin. Vakumu en az 10 dakika uygulayın.

Yayılan oksijen kabarcıklarını çıkarmak için hafifçe sallayın. 10 dakika sonra, kurutucu kavanozdaki vakumu iki ila üç dakika boyunca %100 nitrojen gazı ile değiştirin. Basınç eşitlendiğinde ve kurutucu kavanozunun üstü açılabildiğinde, oksijenin yeniden girmesini önlemek için tüpü hızla kapatın.

Daha sonra, numune içeren tüpü polimerizasyon tamamlanana kadar üç saat boyunca 37 santigrat derece su banyosuna yerleştirerek hidrojeli polimerize edin. Üç saat sonra polimerize hidrojel jel benzeri bir kıvam alacaktır. Polimerize numuneyi santrifüj tüpünden çıkarmak için bir spatula kullanın, ardından numunedeki fazla hidrojeli kesin.

Son olarak, numuneyi tüy bırakmayan bir mendil üzerine koyarak ve dokuyu üzerine hafifçe ovalayarak ve yuvarlayarak kalan hidrojeli çıkarın, böylece numune üzerinde sadece ince bir polimerize hidrojel tabakası bırakın. Lipid çıkarma işlemine başlamak için, polimerize numuneyi 45 mililitre temizleme tamponu ile temiz bir 50 mililitre santrifüj tüpüne aktarın ve yedi gün boyunca hafifçe çalkalayarak 45 santigrat derecede inkübe edin. Bu ilk yedi günlük süre boyunca, kullanılmış temizleme tamponunu bir kimyasal atık kabına dökerek tamponu günlük olarak değiştirin.

Ve 45 mililitre taze temizleme tamponu ekleyerek. Tüm lipitler çözündürüldükten ve doku şeffaflığa ulaştığında, numuneyi 45 mililitre PBST ile doldurulmuş yeni bir 50 mililitrelik santrifüj tüpüne aktarın ve kalan SDS'yi çıkarmak için sonraki 24 saat boyunca hafifçe çalkalayarak 40 santigrat derecede dört kez yıkayın. Son PBST yıkamasından sonra, numuneyi mililitre DAPI ve 1xPBST başına bir mikrogram ile doldurulmuş 15 mililitrelik temiz bir santrifüj tüpüne aktarın.

Folyo ile sarın ve oda sıcaklığında 24 saat inkübe edin. Ertesi gün, yıkama başına en az altı saat boyunca oda sıcaklığında PBST'de üç kez yıkayın. Ve sonra kırılma indisi eşleştirmesine devam edin.

Prosedürün bu bölümüne başlamak için, numuneyi PH 7.5'te 2-2 tiyodietanol ve 1xPBS ile doldurulmuş 15 mililitrelik temiz bir santrifüj tüpüne aktarın ve ekranda gösterildiği gibi inkübe edin. İkinci inkübasyonun sonuna doğru, bir parça yeniden kullanılabilir yapıştırıcıyı, numunenin kalınlığından biraz daha büyük olan tek tip çapa sahip bir silindire yuvarlayarak hazne oluşturun ve görüntüleyin. Silindiri 40 milimetrelik bir cam alt tabağın üzerine açık uçlu bir daire şeklinde yerleştirin.

Ardından, yeniden kullanılabilir yapıştırıcı ile cam arasında silindirin dış kenarı etrafında yuvarlayarak bir sızdırmazlık oluşturmak için bir P1000 pipet ucu kullanın. Cam tabağa yaklaşık 100 mikrolitre %63 TDE pipetleyin ve yeniden kullanılabilir yapıştırıcı çemberi içinde cam yüzeyi kaplayacak şekilde etrafına yayın. Ardından, kabarcık oluşturmamaya dikkat ederek numuneyi dairenin ortasına dikkatlice yerleştirmek için bir spatula kullanın.

Ardından, 100 mikrolitre %63 TDE'yi doğrudan numuneye pipetleyin ve hemen yeniden kullanılabilir yapıştırıcının üzerine 40 milimetrelik dairesel bir kapak camı yerleştirin. Kapak camı numune ile temas edene kadar dairenin çevresini dikkatlice bastırmak için her iki elinizin işaret parmağını, ortasını ve yüzük parmağını kullanın. Şimdi, cam alt tabağı bir yüzeye yaslanarak yavaşça dik konuma getirin, ardından çözelti üstteki küçük açıklığa ulaşana kadar bir pipetle %63 TDE ekleyin.

Solüsyonun cama damlamaması için pipet ucunu kurutmak için tüy bırakmayan bir mendil kullanın. Son olarak, daireyi çevrelemek ve kapalı bir oda oluşturmak için küçük açıklığa silikon elastomer ekleyin. Kuruması için beş dakika bekleyin ve ardından görüntülemeye devam edin.

Numune içinde bulunan görüntüleme odasını bir lazer taramalı konfokal mikroskop tablasına yerleştirin. Argon uyarma lazerini açmak için görüntüleme yazılımını açın, programın üst kısmındaki yapılandırma sekmesine ve ardından lazer simgesine tıklayın. Lazere güç sağlamak için argonun yanındaki kutuyu işaretleyin ve kaydırma ölçeğini %30'a getirin Üst kısımdaki edinme sekmesine dönün.

Işın yolu ayarları kutusunda, yük tasarrufu ayar kutusuna gidin ve YFP yaymak için uygun dalga boyu kanalını seçmek için açılır menüyü seçin. Kanal ayarları kutusunda, hedef mevcut nesne etiketli kırmızı köprüye tıklayarak görüntüleme için uygun hedefleri seçin. Dokunun kalınlığından daha büyük bir çalışma mesafesine sahip hedefler kullanın.

Ve düzlem içi görüntü çözünürlüğünü en üst düzeye çıkarmak ve optik kesit kalınlığını en aza indirmek için geniş bir sayısal diyafram açıklığı. Açılır menülerin sol sütununda, format adı verilen edinim matrisini 1024x1024 veya hedefin yanal çözünürlük sınırına uygun bir değer olarak ayarlamak için XY çözünürlük penceresini açın. Yakınlaştırma faktörünü mümkün olduğunca düşük ayarlayın.

Burada 1.7 kullanılır. Aynı pencerede, ayrı ayrı etiketlenmiş menüleri uygun şekilde aşağı bırakarak sekizinci satır ortalaması ve bir kare ortalaması parametrelerini ayarlayın. Sahne alanı kontrollerini kullanarak örneği bulun.

Temsili bir alan göründüğünde, kazancı 760 ile 780 arasında ve YFP için uzaklığı 1,0 ile 1,5 arasında ayarlayın. Döşeme taraması'nı seçin. Ardından, elde edilecek Z yığınının üst ve alt sınırlarını ayarlayın.

Optik bölümün kalınlığını, objektif optik bölüm çözünürlük sınırına göre ayarlayın ve ardından alıma başlayın. Bu görüntü, serebral korteks ve hipokampustaki YFP pozitif nöronları 5x büyütme olarak görüntülenmiş ve 3D olarak yeniden yapılandırılmış olarak göstermektedir. Ölçek çubuğu bir milimetreyi temsil eder.

Serebral korteksin 10x'lik bir görüntü yığınının bu maksimum yoğunluk projeksiyonu, kortikal tabaka beş piramidal nöronların dendritik abortizasyonunu gösterir. Burada ölçek çubuğu 100 mikronu temsil eder. Burada THY-1YFP ekspresyonu sağlam bir servikal ve torasik omurilikte gösteriliyor, 5x büyütmede görüntüleniyor ve 3D olarak yeniden yapılandırılıyor.

Ölçek çubuğu iki milimetreyi temsil eder. Son olarak, omuriliğin 10x görüntülü yığınının bu maksimum yoğunluk projeksiyonu, tek tek aksonları gösterir, ölçek çubukları 100 mikronu temsil eder. Düzgün bir şekilde hazırlanırsa, bu teknik tüm omurilikler için iki ila dört hafta içinde ve hemiseksiyonlu beyinler için dört ila altı hafta içinde yapılabilir.

Bu prosedürü takiben, daha karmaşık biyokimyasal fenotipleme gerektiren soruları yanıtlamak için immünohistik kimya gibi diğer yöntemler de oluşturulabilir. Bu videoyu izledikten sonra, bir fare merkezi sinir sistemini optik olarak nasıl temizleyeceğinizi ve görüntüleyeceğinizi iyi anlamış olmalısınız. Pasif netlik ve lazer konfokal mikroskopi kullanma.