Bir Kemostat kullanarak Mikroorganizmaların Adaptif Laboratuvarı Evolution Prosedürü

Bu prosedürün genel amacı, bir mikroorganizmanın laboratuvar koşullarında evrimleşmesini sağlamaktır. Bu yöntem, adrenal fonksiyon ilişkileri, stres tepkileri, metabolik mühendislik ve tabii ki evrim gibi mikrobiyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, belirli laboratuvar koşulları altında en çok kabul edilen soyundan gelenin sürekli seçimidir.

Bu prosedüre, metin protokolünde açıklandığı gibi, ekipmanın yanı sıra başlangıç ortamı, stres ortamı ve yüksek stres ortamının hazırlanmasıyla başlayın. Dört mililitre başlangıç ortamı içeren 15 mililitrelik bir test tüpünde tek bir koloni veya vahşi tip E.coli'yi aşılayın. Test tüpünü çalkalanan bir inkübatörde 37 santigrat derece ve 220 rpm'de 12 saat inkübe edin.

Altı saat boyunca 37 santigrat derecede havalandırma ve çalkalama sağlayan kemostat kavanozunu inkübe edin. İnkübasyonun ardından, silikon borunun ucunu pompalardan gelen kemostat kavanozuna aseptik olarak bağlayın. Aseptik olarak bir mililitre ön kültürü kemostat kavanozuna aktarın.

Çıkış pompasını çalıştırın ve kültürü üstel fazda toplayın. Çıkış borusundan kültürün 600 nanometresindeki optik yoğunluğu kontrol edin. Ardından giriş pompasını çalıştırın.

Kültürün optik yoğunluğunu her 24 saatte bir çıkış borusundan 600 nanometrede kontrol edin. Kemostatı 9.6 tam ciro olan 96 saat boyunca çalıştırdıktan sonra, rezervuarı en düşük yüksek stres ortamı konsantrasyonuna değiştirin. Rezervuarı daha yüksek bir stres ortamıyla değiştirdiğinizde, hücreler şoklanabilir.

Hücre yoğunluğu çok düşükse, hücre yoğunluğunu eski haline getirmek için bir süre daha yüksek stres ortamını beslemeyi bırakın. Optik yoğunluk 0,2'den düşükse, besleme giriş pompasını altı saat durdurun. Giriş pompasını yeniden başlatın ve optik yoğunluğun 0,2'nin üzerinde olduğunu kontrol edin.

Daha yüksek bir stres faktörü konsantrasyonu içeren bir rezervuara kademeli olarak değiştirerek stres etkeninin konsantrasyonunu kademeli olarak artırın. Bir stresör adaptasyon kilometre taşına ulaştığında uyarlanmış kültürün örneklerini alın ve daha fazla genomik analiz için saklayın. Numune saklama için, 0.5 mililitre kültür numunesini 0.5 mililitre sterilize edilmiş %80 gliserol çözeltisi ile karıştırın ve 80 santigrat derecede saklayın.

Ortamdakiyle aynı konsantrasyonda aynı stres etkenini içeren %1.6 ager plaka ortamını hazırlayın. Kemostattan 0.1 mililitre çıkış kültürünü plakalayın ve 16 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. İnkübasyonun ardından, steril bir kürdan kullanarak plakadan tek koloniler toplayın ve bunları kemostatta olduğu gibi aynı stres etkenini içeren ve aynı orta konsantrasyonda 15 mililitrelik test tüplerine aşılayın.

Altı saat kuluçkaya yatırın. Bir mililitre kültür suyunu 50 mililitre ortam içeren 250 mililitrelik bir erlenmeyer şişesine aktarın. Her saat 0,5 mililitre kültür suyu hasat edin ve optik yoğunluğu 600 nanometrede ölçün.

Uyarlanmış suşun büyüme hızını, stres etkeni verilen vahşi tip suşun büyüme hızıyla karşılaştırın. Yabani tip E.coli suşu, yaklaşık 930 nesle karşılık gelen 270 gün boyunca yüksek süksinat stresli bir durumda evrimleşmiştir. Daha yüksek süksinat stresi eklendiğinde, biyokütle konsantrasyonu hemen düşürüldü ve daha sonra eski haline getirildi.

Burada, yüksek süksinat stresine karşı toleranslı bir mutant ile kemostatın şematik bir diyagramı gösterilmektedir. Yabani tip hücrelerin çoğu stres koşulları altında yıkanır ve mutant daha fazla büyür. Sonunda, mutant soyundan gelenlerin nüfusu artar.

İkinci ve üçüncü mutasyonlar sürekli olarak kemostat için seçilir ve sonunda kemostat için baskın hale gelir. Bu şekil, uyarlanmış suşun yüksek süksinat stresli koşullar altında gecikmeden büyüdüğünü, vahşi tip suşun ise büyümediğini göstermektedir. Benzer bir strateji, çeşitli stresörlere sahip bir kemostat kullanılarak uyarlanabilir laboratuvar evrimine uygulanabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, mikroorganizmanın belirli bir koşul altında nasıl elde edileceğini ve geliştirileceğini iyi anlamış olmalısınız. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik birkaç ay içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, kemostat hücrelerini bir kerede çok fazla stres ekleyerek yıkamamayı unutmamak ve optik yoğunluğu her gün kontrol etmeyi unutmamak önemlidir.

Bu prosedürü takiben, strese dayanıklı evrime hangi mutasyonun katkıda bulunduğu gibi ek soruları yanıtlamak için genom analizi ve transkriptom analizi gibi yöntemler gerçekleştirilebilir mi?