Name: Bir Kemostat kullanarak Mikroorganizmaların Adaptif Laboratuvarı Evolution Prosedürü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 3 s
Description: Öğrenin, kemostat kullanarak mikroorganizmaların adaptif laboratuvar evrimi protokolünü. E. coli ile stres yanıtları ve metabolik mühendislik çalışmaları için uygulanabilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Kore Bilim, Bilgi ve İletişim Teknolojileri ve Gelecek Planlama Bakanlığı (Akıllı Sentetik Biyoloji Merkezi programı 2012M3A6A8054887) tarafından finansal olarak desteklenmiştir. P. Kim, Kore Katolik Üniversitesi'nden bir burs ile desteklendi (2015).

1. Ekipman Hazırlığı <ol><li> Bir kemostat küp (150-250 mi) ya da bir giriş noktası ihtiva eden bir bir Erlenmeyer şişesi (250 mi) ve bir çıkış portuna elde edin. silikon boru 10-100 ml / saat akış hızları için izin ile bağlantı noktalarını bağlayın. İsteğe bağlı olarak, bir hava deliği, bir hava çıkış ağzı, ve sıcaklık kontrollü su giriş ve çıkış bağlantı noktaları kullanımı. </li><li> ajitasyon ve ısı kontrolü sağlayan kemostat kavanoz için uygun olan bir cihaz elde edilir (veya bir döner çalkalama inkübatöründe kullanın). </li><li> kültür taze orta teslim ve toplamak için iki peristaltik pompa edinin. </li><li> orta çıkış deliği ve bir hava giriş ağzı ihtiva eden bir hazne kavanoz (10-20 L) elde edilir. </li><li> (L / S 13 boru Yani, ID, 0.8 mm, akış aralığı 0,06-36 ml / dak) seyrelme oranı için uygun silikon boru elde edilir. </li></ol> 2. Orta Hazırlama ve Sterilizasyon <ol><li> ilk Orta <ol><li> 0.3 gr glikoz, 0.08 g NH4 çözülürCI, 0.05 g NaCl, 0.75 g Na 2 HPO 4 · 2H 2, O, ve 0.3 g KH 2 PO 4 90 ml damıtılmış su, kemostat kavanoza (DW). </li><li> kelepçeler kullanılarak boru ile birlikte kemostat kavanoz mühür. havalandırma deliğini mühür yok. </li><li> 15 dakika boyunca 121 ° C&#39;de bir otoklav içinde kemostat kavanoz sterilize edin. Sterilizasyon sonrasında, oda sıcaklığında kemostat kavanoz saklayın. </li><li> Çözülür 0.02 gr MgSO 4 · 7H 2, O, 0.01 g CaCl2 ve 10 mi DW (A çözeltisi) içinde 0.1 mg tiamin. </li><li> bir şırınga ve bir önceden sterilize edilmiş şırınga filtresi (0.45 mikron gözenek filtresi) ile filtre solüsyonu için uygun değildir. </li><li> Bir kemostat kavanoza süzüntüler çözüm ekleyin. </li></ol></li><li> stres Orta <ol><li> 30 g glukoz, 8 g NH4CI, 5 g NaCl, 75 g 2 Na HPO 4 · çözülür 2H 2, O, 30 g KH 2 PO 4 ve 300 g disodyum süksinat heksahidrat (Na2 · süksinat · 6H &lt;sub&gt; 2 O; Bir rezervuar kavanoza 9.9 L DW bu deneyde kullanılan stres). </li><li> kelepçeler kullanılarak boru ile birlikte rezervuar kavanoz mühür. havalandırma deliğini mühür yok. </li><li> 15 dakika boyunca 121 ° C&#39;de bir otoklav içinde, rezervuar kavanoz sterilize edin. Sterilizasyon sonrasında, oda sıcaklığında kavanoz saklayın. </li><li> 2 g MgSO 4 · 7H 2, O, 1 g CaCl2, ve 100 ml DW (A çözeltisi) içinde 10 mg tiamin çözülür. </li><li> bir şırınga ve bir ön-sterilize edilmiş şırınga filtresinden (0.45 mikron gözenek filtresi) ile filtre solüsyonu için uygun değildir. </li><li> Bir rezervuar kavanoza süzüntüler solüsyonu ekleyin. </li><li> Aseptik rezervuar kavanoza sterilize silikon tüp bağlamak ve peristaltik pompalar takın. </li></ol></li><li> Yüksek stres Orta <ol><li> Bölüm 2.2 gibi orta hazırlayın, ama stresörün büyük bir konsantrasyon ile (yani, süksinat adaptasyon 3-5 g / L daha yüksek). Not: Bu protokol bir stres inci adaptasyon içinde orta yoluyla teslim edilebilir. sıcaklık, ajitasyon ya da aydınlatma gibi fiziksel stres durumunda, kültür buna göre tasarlanmış olmalıdır. </li></ol></li></ol> 3. İlk Yetiştirme <ol><li> Yabani tip E. tek bir koloni İnokülasyon Başlangıç ​​ortamı 4 ml içeren 15 ml&#39;lik deney tüpünde coli. </li><li> 37 ° C&#39;de 12 saat ve 220 rpm&#39;de sallanan bir kuluçka makinesinde test tüpünü inkübe edin. </li><li> Aseptik olarak transferi kemostat kavanoza ön kültür 1 ml. </li><li> 6 saat boyunca 37 ° C &#39;de, havalandırma (hava 50 ml / dakika) ve karıştırılarak (200 rpm) sağlayan, kemostat kavanoz inkübe edin. </li></ol> 4. Stres Adaptasyon <ol><li> Aseptik kemostat kavanoza pompalardan silikon hortumun ucunu. </li><li> çıkış pompası (10 ml / saat veya daha yüksek) başlatın ve kültür toplamak. Not: Kültür tipik olarak 4-8 ​​saat, ilk yetiştirme sonrasında, üslü fazda olması gerekir. </li><li> Chçıkış borusundan kültürün optik yoğunluğu (600 nm) eck. </li><li> Giriş pompası (0.1 saat -1 sulandırma bir orana karşı gelen 10 ml / sa,) başlatın. </li><li> her 24 saatte tüp çıkışından 600 nm&#39;de kültür optik yoğunluk kontrol edin. </li><li> 96 saat (9.6 kat ciro) ya da daha fazla kemostat çalıştırın. optik yoğunluk stabil ise, yüksek stres ortamı içeren rezervuar alışverişi. Optik yoğunluk 0.2 düşükse, 6 saat boyunca besleme giriş pompayı durdurun. giriş pompasını yeniden başlatın ve optik yoğunluk 0.2 üzerinde olup olmadığını kontrol edin. </li><li> Yavaş yavaş daha yüksek stres konsantrasyonunu ihtiva eden bir rezervuara değiştirerek stres konsantrasyonunu artırır. </li><li> O bir dönüm noktası ulaştığında adapte kültür örnekleri almak (örneğin, 100 g / L süksinat strese adapte suş) ileri genomik analiz için, ve mağaza. </li><li> Örnek depolama için, steril bir% 80 gliserol soluti kültür numunesi (0.5 mL) karışımıilgili (0.5 mi) ve -80 ° C&#39;de saklayın. Not: Mikroorganizma ALE sürecinde stres aşağılamak için bir yeteneği edinirse, fermantasyon kavanoz stres konsantrasyonu taze haznesinde aynı değildir. </li></ol> Stres adapte Uzama 5. Tek koloni izolasyonu <ol><li> Agar plaka orta (% 1.6 ağar) aynı stres içeren ve ortamın aynı konsantrasyonda hazırlayın. </li><li> kemostat gelen çıkış kültür (0.1 mi) plaka ve 16 saat 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Steril kürdan ile plaka, tek koloniler aynı stres ihtiva eden 15 ml&#39;lik deney tüpleri ve kemostat aynı ortam konsantrasyonunda bunları inoküle ve 6 saat inkübe edilir. </li><li> Transfer ortamı 50 ml içeren 250 ml&#39;lik bir Erlenmeyer şişesi içinde bulundukları kültür çorbasından 1 mi. Hasat kültür sıvısının 0.5 ml her 1 saat ve 600 nm&#39;de OD&#39;yi ölçün. adapte strai büyüme hızını karşılaştırmakstres verilen yabani tip suşu edilene n. </li></ol>

<ol><li>Rando, O. J., Verstrepen, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timescales+of+genetic+and+epigenetic+inheritance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Timescales of genetic and epigenetic inheritance.</a> Cell. 128, 655-668 (2007).</li>
<li>Kim, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-term+differential+adaptation+to+anaerobic+stress+via+genomic+mutations+by+Escherichia+coli+strains+K-12+and+B+lacking+alcohol+dehydrogenase%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Short-term differential adaptation to anaerobic stress via genomic mutations by Escherichia coli strains K-12 and B lacking alcohol dehydrogenase.</a> Front Microbiol. 5, 476(2014).</li>
<li>Mendizabal, I., Keller, T. E., Zeng, J., Yi, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics+and+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Comp+Biol%22%5BJournal%5D)">Epigenetics and evolution.</a> Integr Comp Biol. 54, 31-42 (2014).</li>
<li>Lee, J. Y., Seo, J., Kim, E. S., Lee, H. S., Kim, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+evolution+of+Corynebacterium+glutamicum+resistant+to+oxidative+stress+and+its+global+gene+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Lett%22%5BJournal%5D)">Adaptive evolution of Corynebacterium glutamicum resistant to oxidative stress and its global gene expression profiling.</a> Biotechnol Lett. 35, 709-717 (2013).</li>
<li>Lee, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+oxidative+stress-tolerant+Corynebacterium+glutamicum%5BTitle%5D)+AND+%22AMB+Express%22%5BJournal%5D)">Artificial oxidative stress-tolerant Corynebacterium glutamicum.</a> AMB Express. 4, 15(2014).</li>
<li>Narang, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+steady+states+of+microbial+growth+on+mixtures+of+substitutable+substrates+in+a+chemostat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Theor+Biol%22%5BJournal%5D)">The steady states of microbial growth on mixtures of substitutable substrates in a chemostat.</a> J Theor Biol. 190, 241-261 (1998).</li>
<li>Kwon, Y. D., Kim, S., Lee, S. Y., Kim, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+continuous+adaptation+of+Escherichia+coli+to+high+succinate+stress+and+transcriptome+analysis+of+the+tolerant+strain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biosci+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Long-term continuous adaptation of Escherichia coli to high succinate stress and transcriptome analysis of the tolerant strain.</a> J Biosci Bioeng. 111, 26-30 (2011).</li>
<li>Barrick, J. E., Lenski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+dynamics+during+experimental+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Genome dynamics during experimental evolution.</a> Nat Rev Genet. 14, 827-839 (2013).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sequence+Alignment%2FMap+format+and+SAMtools%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25, 2078-2079 (2009).</li>
<li>McKenna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Genome+Analysis+Toolkit%3A+a+MapReduce+framework+for+analyzing+next-generation+DNA+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">The Genome Analysis Toolkit: a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data.</a> Genome Res. 20, 1297-1303 (2010).</li>
<li>Deatherage, D. E., Barrick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+mutations+in+laboratory-evolved+microbes+from+next-generation+sequencing+data+using+breseq%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of mutations in laboratory-evolved microbes from next-generation sequencing data using breseq.</a> Methods Mol Biol. 1151, 165-188 (2014).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Mikroorganizmalar nedeniyle hızlı büyüme oranı ve genetik çeşitliliğin hemen hemen tüm ortamlarda uyum yeteneğine sahiptirler. Adaptif laboratuvar evrim verilen koşullar altında yararlıdır spontan mutasyon barındıran bireysel organizmaların seçerek bir yol sağlar tasarlanmış koşullar altında gelişmeye mikroorganizmaları sağlar. kemostat tekniği aşağıdaki nedenlerle transfer teknikleri daha yapay tahrik evrimi elde etmek için daha sağlamdır, (a) sürekli bir ortam - transfer teknikleri, katı y...

Mikroorganizmalar hayatta ve çeşitli ortamlara uyum sağlayabilir. Ağır stres altında, adaptasyon rastgele genomik mutasyonların ve sonraki pozitif seleksiyon 1-3 yararlı fenotip kazanması ile ortaya çıkabilir. Bu nedenle, mikrobiyal hücreler &quot;adaptif evrim&quot; olarak adlandırılır optimum büyüme için metabolik veya düzenleyici ağları değiştirerek uyum sağlayabilir. Bu tür süpermikroplar salgınları ve sağlam mikrobiyal suşların ortaya çıkması gibi yeni önemli mikrobiyal eğilimler, çok yakından stresli koşullar altında evrimi uyarlamalı ilişkilidir. tanımlanan laboratuvar koşullarında, moleküler evrim mekanizmaları incelemek ve hatta çeşitli uygulamalar için mikrobik evrimin yönünü kontrol edebiliyoruz. onlar büyük nüfusları korumak, hızlı bir şekilde yeniden ve oluşturmak ve Hom bakımı kolaydır: Çok hücreli organizmalardan farklı, tek hücreli canlılar aşağıdaki nedenlerden ötürü adaptif laboratuvar evrim (ALE) için uygundurogeneous ortamlar. DNA dizileme teknikleri ve yüksek verimli teknolojilerindeki son gelişmeler ile birlikte, ALE sistemik düzenleyici değişikliklere yol genomik değişikliklerin doğrudan gözlem sağlar. Mutasyon dinamikleri ve nüfus çeşitliliği de gözlemlenebilir. Genetik mühendisliği yöntemi ALE suşlarının 4,5 analizinden belirlenebilir. Kemostat kültür kararlı durum hücreleri elde etmek ve fermantasyon süreçleri 6 verimliliği artırmak için kullanılan bir yöntemdir. Taze ortam ilave edilir ve kültür sıvısı işlemi (ikinci orta ve biyokütle içerir) içinde toplanır. Uzun vadeli kemostat kültürü Bununla birlikte, kültürün kararlı durum verimliliği değiştirir ve kültür (Şekil 1a) sırasında spontan mutasyon ve seleksiyon birikimi getiriyor. Çeşitli seçim basınçlarında (stres) altında, mutasyonların birikimi artar. Uzun vadede stres kademeli bir artış<html> kemostat tekrarlanan sıvı bir ortamda bir katı ortam ve seri transferi (arasında, sıcaklık, pH, ozmotik basıncı, besin açlık, oksidasyon, toksik son ürün, vb Koloni transferi verilen stres karşı çalışma mutasyonlar, sürekli bir seçim sağlar küme kültür), araştırmacılara gelişti mikroorganizmaları (Şekil 1B ve 1C) elde edilmesine olanak sağlamaktadır. kemostat kültür karmaşık yöntemler gerektirmesine rağmen, çeşitlilik havuzu (tekrarlamalı ve nüfus büyüklüğü sayısı) koloni transfer ve seri transfer teknikleri ile elde edilenden daha yüksektir. tek tek hücrelerin kararlı stres maruziyeti ve kemostat kültürü (sabit durum) toplu kültür temelli tekniklerle karşılaştırıldığında ALE diğer faydaları şunlardır sırasında hücresel devlet varyasyon azalmıştır. Yüksek süksinat koşullara tabi Escherichia coli strese bağlı ALE Bu makalede tanıtıldı. iles / ftp_upload / 54446 / 54446fig1.jpg &quot;/&gt; Şekil 1: adaptif laboratuvar evrim Yöntemleri (A) Kemostat;. (B) Seri transferi; (C) koloni transferi. Üst rakamlar ALE yöntemleri kavramını göstermek ve alt rakamlar ALE sırasında büyüyen hücrelerin sayısını göstermektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54446/54446fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

<table><tbody><tr><td>Mini kemostat fermentörü</td><td>Biotron Inc.</td><td>-</td><td>Özel sipariş</td></tr><tr><td>silikon boru</td> ile üretilmiştir <td>Cole-Parmer</td><td>Masterflex L / S 13</td><td>boru boyutu, seyreltme hızına ve fermentör kavanozunun boyutuna bağlı olarak değiştirilebilir.</td></tr><tr><td>rezervuar kavanozu</td><td>Bellco</td><td>Media saklama şişesi</td><td>20 L</td></tr><tr><td>kimyasallar</td><td>Sigma-Aldrich-reaktif</td><td></td> <td>sınıfı</td></tr><tr><td>glikoz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td>ACS reaktifi</td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9434</td><td>moleküler biyoloji için, hücre kültürü için uygun, vb; % 99.5</td></tr> <tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746398</td><td>ACS reaktifi, &ge; % 99</td></tr> <tr><td>Na < alt > 2 < / alt >HPO< alt >4 < / alt > ve orta nokta; 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>4272</td><td>%98.5-101</td></tr> <tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>795488</td><td>ACS reaktifi, & ge; % 99</td></tr> <tr><td>MgSO<alt > 4 < / alt > ve orta nokta; 7H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td>ACS reaktifi, & ge; % 98</td></tr> <tr><td>CaCl < alt > 2 </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>793639</td><td>ACS reaktifi, & ge; % 96</td></tr> <tr><td>tiamin ve orta nokta; HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4625</td><td>reaktif sınıfı, > % 99</td></tr> <tr><td>Na < alt > 2 < / alt > ve orta nokta; süksinat ve orta nokta; 6H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2378</td><td>ReagentPlus, & ge; %99</td></tr></tbody></table>

bir kemostat kullanarak mikroorganizmaların adaptif laboratuvarı evolution prosedürü

Procedure for Adaptive Laboratory Evolution of Microorganisms Using a Chemostat

Doğal evrim, çevresel değişim ve küçük popülasyonlar arasındaki bir seçim gibi genetik çeşitliliği içerir. Uyarlanabilir laboratuvar evrimi (ALE), kontrollü koşullar ve stres faktörleri altında canlı organizmalar kullanılarak evrimin gözlemlendiği deneysel durumu ifade eder; Organizmalar böylece yapay olarak evrimsel değişiklikler yapmaya zorlanır. Mikroorganizmalar çevrede çeşitli stres faktörlerine maruz kalırlar ve hayatta kalma şanslarını artırmak için strese bağlı belirli proteinleri düzenleyebilirler. Doğal olarak meydana gelen spontan mutasyonlar, bir mikroorganizmanın genomunda hayatta kalma şansını etkileyen değişikliklere neden olur. Kemostat kültürüne uzun süreli maruz kalma, spontan mutasyonların birikmesine neden olur ve en uyarlanabilir suşu baskın hale getirir. Koloni transferi ve seri transfer yöntemleriyle karşılaştırıldığında, kemostat kültürü en yüksek sayıda hücre bölünmesini ve dolayısıyla en yüksek sayıda farklı popülasyonu gerektirir. ALE için kemostat kültürü daha karmaşık kültür cihazları gerektirse de, işlem başladıktan sonra daha az emek yoğundur. Uyarlanmış suşun karşılaştırmalı genomik ve transkriptom analizleri, stresörlerin stresin üstesinden gelen mutasyonlara nasıl katkıda bulunduğuna dair evrimsel ipuçları sağlar. Bu makalenin amacı, kontrollü laboratuvar koşulları altında mikroorganizmaların hızlandırılmış evrimini sağlamaktır.

Yüksek süksinat stres adaptasyonu için, vahşi tip E. coli W3110 suşu D bir kemostat kültürlenmiştir = 0.1 saat -1 270 gün (Şekil 2). <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54446/54446fig2.jpg" /> Şekil 2: E. Yüksek süksinat stres adaptasyonu E. coli kemostat kültür kullanarak W3110. İnce oklar stresörün konsantrasyonu artmış edildiği kez gösterir ve kalın oklar kültürleri muhafaza...

Burada, biz kemostat kültür kullanarak koşullar altında mikroorganizmaların adaptif laboratuvar evrimini elde etmek için bir protokol mevcut. Ayrıca, gelişmiş soyunun genomik analiz tartışılmıştır.

Bir Kemostat kullanarak Mikroorganizmaların Adaptif Laboratuvarı Evolution Prosedürü

Natural evolution involves genetic diversity such as environmental change and a selection between small populations. Adaptive laboratory evolution (ALE) ...

Bu prosedürün genel amacı, bir mikroorganizmanın laboratuvar koşullarında evrilmesini sağlamaktır. Bu yöntem; adrenal fonksiyon ilişkileri, stres tepkileri, metabolik mühendislik ve elbette evrim gibi mikrobiyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, belirli laboratuvar koşulları altında en uygun soyun sürekli olarak seçilmesidir.Bu prosedüre, metin protokolünde açıklandığı şekilde ekipmanların yanı sıra başlangıç besiyeri, stres besiyeri ve yüksek stres besiyerinin hazırlanmasıyla başlayın. Tek bir koloni veya vahşi tip E.coli'yi, dört mililitre başlangıç besiyeri içeren 15 mililitrelik bir deney tüpüne ekleyin. Deney tüpünü çalkalamalı inkübatörde 12 saat boyunca 37 °C ve 220 rpm'de inkübe edin.Havalandırma ve karıştırma sağlayarak kemostat kavanozunu 37 °C'de altı saat boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından, pompalardan gelen silikon borunun ucunu aseptik olarak kemostat kavanozuna bağlayın. Bir mililitre ön kültürü aseptik olarak kemostat kavanozuna aktarın.Çıkış pompasını çalıştırın ve eksponansiyel fazdaki kültürü toplayın. Çıkış borusundan gelen kültürün 600 nanometredeki optik yoğunluğunu kontrol edin. Ardından, giriş pompasını çalıştırın.Kültürün optik yoğunluğunu her 24 saatte bir çıkış borusundan 600 nanometrede kontrol edin. Kemostatı, 9,6 tam döngüye karşılık gelen 96 saat boyunca çalıştırdıktan sonra, rezervuarı en düşük konsantrasyonlu yüksek stresli besiyeri ile değiştirin. Rezervuarı daha yüksek stresli bir besiyeriyle değiştirdiğinizde hücreler şok geçirebilir.Hücre yoğunluğu çok düşükse, hücre yoğunluğunu geri kazanmak için yüksek stresli besiyeri beslemesini bir süre durdurun. Optik yoğunluk 0.2'den düşükse, giriş pompasını altı saat boyunca durdurun. Giriş pompasını yeniden başlatın ve optik yoğunluğun 0.2'nin üzerinde olduğunu kontrol edin.Daha yüksek stresör konsantrasyonu içeren bir rezervuara kademeli olarak geçiş yaparak stresör konsantrasyonunu yavaşça artırın. Adaptasyon sürecindeki kültür, bir stresör adaptasyon aşamasına ulaştığında örnekler alın ve daha sonraki genomik analizler için saklayın. Örneklerin saklanması için, 0,5 milliliter kültür örneğini 0,5 milliliters steril %80 gliserol çözeltisi ile karıştırın ve 80 degrees celsius'de saklayın.Besiyerindekiyle aynı konsantrasyonda aynı stresör maddesini içeren %1,6'lık agar plak besiyeri hazırlayın. Kemostat çıkış kültüründen 0,1 mililitreyi plaka ekleyn ve 37 derece santigrat sıcaklıkta 16 saat boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından, plakadaki tekil kolonileri steril bir kürdan kullanarak seçin ve kemostattakilerle aynı stresör maddesini ve aynı besiyeri konsantrasyonunu içeren 15 mililitrelik test tüplerine inoküle edin.Altı saat boyunca inkübe edin. Kültür suyundan 1 mL'sini, 50 mL besiyeri içeren 250 mL'lik bir erlenmeyer flaska aktarın. Her saatte bir 0,5 mL kültür suyu hasat edin ve 600 nanometrede optik yoğunluğu ölçün.Adaptasyon geçirmiş suşun büyüme hızını, stresör verildiğindeki yabani tip suşunki ile karşılaştırın. Yabani tip E.coli suşu, yaklaşık 930 nesle tekabül eden 270 gün boyunca yüksek süksinat stresli bir koşulda evrilmiştir. Daha yüksek süksinat stresi eklendiğinde, biyokütle konsantrasyonu anında düşmüş ve ardından yeniden eski haline dönmüştür.Burada, yüksek süksinat stresine karşı toleranslı bir mutanta sahip kemostatın şematik diyagramı gösterilmektedir. Stres koşulları altında çoğu yabani tip hücre yıkanarak ortamdan uzaklaşırken, mutant daha fazla büyür. Nihayetinde, mutant soyundan gelenlerin popülasyonu artar.İkinci ve üçüncü mutasyonlar sürekli olarak seçilir ve sonunda kemostata hakim olur. Bu şekil, adapte olmuş suşun yüksek süksinat stres koşulları altında gecikme olmaksızın büyüdüğünü, vahşi tip suşun ise büyümediğini göstermektedir. Benzer bir strateji, farklı stresörlerin kullanıldığı bir kemostat ile adaptif laboratuvar evrimi için uygulanabilir.Bu videoyu izledikten sonra, belirli bir koşul altında mikroorganizmanın nasıl elde edileceği ve geliştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Uzmanlaşıldığında, bu teknik birkaç ay içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü uygularken, bir kerede çok fazla stres ekleyerek kemostat hücrelerinin yıkanıp gitmediğinden emin olmak ve optik yoğunluğu her gün kontrol etmeyi hatırlamak önemlidir.Bu prosedürün ardından, stres toleranslı evrime hangi mutasyonun katkıda bulunduğu gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla genom analizi ve transkriptom analizi gibi yöntemler uygulanabilir.

procedure-for-adaptive-laboratory-evolution-microorganisms-using

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Kaynak: Jian, X., ve diğerleri, Mikrobiyal Mikrodamlacık Kültür Sistemi (MMC) Kullanılarak Otomatik Mikrobiyal Yetiştirme ve Uyarlanabilir Evrim. J. Vis. Uzm. (2022).Bu video, bakterilerin metanol toleransına doğru adaptif evrimini yönlendirmek için mikrobiyal bir mikro damlacık kültür sisteminin kullanımını göstermektedir. Sistem, tasarlanmış bakteri kültürlerini yüksek metanol stres ortamıyla karıştırarak ve bunları mikro damlacıklara bölerek, metanol stresi altında gelişmiş büyüme sergileyen...

Mikrobiyal Mikrodamlacık Kültür Sistemi Kullanılarak Bakterilerin Adaptif Evrimi

Kaynak: Jeong, H. ve diğerleri. Kemostat kullanarak mikroorganizmaların uyarlanabilir laboratuvar evrimi prosedürü. J. Vis. Exp. (2016).Bu video, uzun süreli stres koşullarına maruz kalan bir kültürden strese uyum sağlamış bakterilerin seçici izolasyonu ve büyümesini göstermektedir. Kültür, stresör içeren agar üzerine örtülenir ve strestör ile sıvı ortamı aşılamak için tek bir koloni seçilir. Soğukkanlılık, büyümeyi izlemek ve strese uyum sağlamış bakterilerin başarılı izolasyonu doğrulamak...

Strese Uyum Sağlamış Bakterilerin Tek Koloni Seçimi Yoluyla İzolasyonu

Hücre büyüme oranı düzenlenmiş bir süreç ve hücre fizyolojisi temel belirleyicisidir. Chemostats kullanılarak sürekli kültürü, hücre büyümesini ve ne kadar bu ağlar hücre büyümesini optimize etmek için moleküler evrim kontrol ağların çalışma kolaylaştırmak besin kısıtlaması hücre büyüme hızının dışsal kontrol edilmesini sağlar.

Mikrobiyal Systems Biyoloji Chemostats Kullanımı

Biz geliştirdi ve düşük maliyet için hazır parçalardan inşa minyatür chemostats küçük bir yer kaplayan dizi doğrulanmış. Fizyolojik ve deneysel evrim sonuçları büyük hacimli chemostats benzerdi. Ministat dizi geleneksel kemostat deneyler, fonksiyonel genomik ve kimyasal tarama uygulamaları için, kompakt, ucuz ve erişilebilir bir platform sağlar.

Multiplexed kemostat Diziler Tasarımı ve Kullanımı

İlaç konsantrasyonunu dinamik olarak ayarlayarak antibiyotik ilaç direncinin karakterizasyonunu sağlayan düşük maliyetli, yapılandırılabilir bir morbidostat tarif ediyoruz. Cihaz, çoğullanmış bir mikroakışkan platform ile entegre edilebilir. Yaklaşım, laboratuvar antibiyotik ilaç direnci çalışmaları için ölçeklendirilebilir.

Tasarım ve Düşük Maliyetli kullanımı, Otomatik Morbidostat Bakterilerin Adaptif Evolution için antibiyotik ilaç Seçimi Altında

EVOLVER çerçevesi yüksek çözünürlüklü ve deneysel parametreler üzerinde dinamik kontrol ile yüksek verimlilik sürekli mikrobiyal kültür sağlar. Bu protokol, kullanıcıların birçok bireysel kültürde otomatik kontrolü programlama, ölçme, toplama ve deneysel verilerle gerçek zamanlı etkileşime girme konusunda rehberlik ederek karmaşık bir fitness deneyi yapmak için sistemin nasıl uygulanacağını gösterir.

EVOLVER kullanarak otomatik, yüksek verimlilik, sürekli hücre büyüme denemeleri tasarlama

Bu protokol, otomatik mikrobiyal yetiştirme ve uyarlanabilir evrim yürütmek için Mikrobiyal Mikrodamlacık Kültürü sisteminin (MMC) nasıl kullanılacağını açıklamaktadır. MMC, mikroorganizmaları otomatik ve sürekli olarak yetiştirebilir ve alt yetiştirebilir ve nispeten yüksek verim ve iyi paralelleştirme ile büyümelerini çevrimiçi olarak izleyebilir, işçiliği ve reaktif tüketimini azaltabilir.

Mikrobiyal Mikrodamlacık Kültür Sistemi (MMC) kullanılarak Otomatik Mikrobiyal Yetiştirme ve Uyarlanabilir Evrim

Bu protokol, Escherichia coli Uzun Vadeli Evrim Deneyi'nin (LTEE) günlük transferlerini ve periyodik donmalarını gerçekleştirerek nasıl sürdürüleceğini ve evrimleşmiş bakterilerdeki uygunluk iyileştirmelerini ölçmek için rekabet testlerinin nasıl yapılacağını açıklamaktadır. Bu prosedürler, kendi mikrobiyal evrim deneylerine başlayan araştırmacılar için bir şablon görevi görebilir.

Günlük Transferler, Popülasyonların Arşivlenmesi ve Escherichia coli ile Uzun Vadeli Evrim Deneyinde Uygunluğun Ölçülmesi

Burada, inkübatör olarak düşük maliyetli, enerji verimli tezgah üstü termomikserler kullanan termofillerde adaptasyon için deneysel bir evrim protokolü sunuyoruz. Teknik, 75 °C'lik optimum büyüme sıcaklığına sahip bir arkeon olan Sulfolobus acidocaldarius'ta sıcaklık adaptasyonunun karakterizasyonu yoluyla gösterilmiştir.

Yaşamın Uç Noktalarında Adaptasyon: Ekstremofil Archaeon Sulfolobus acidocaldarius ile Deneysel Evrim

Bakteri popülasyonlarının sürekli düşük besinli koşullarda (yüzlerce nanomolar konsantrasyona kadar) veya geçici besin dalgalanmaları altında küçük bir zaman ölçeğinde yetiştirilmesini sağlayan milifluidik sürekli kültür cihazı (MCCD) için bir protokol sunuyoruz.

Düşük ve Dalgalanan Besin Koşullarında Escherichia coli'nin Incelenmesi için Sürekli Kültür Milifluidik Cihaz

Öğrenin, kemostat kullanarak mikroorganizmaların adaptif laboratuvar evrimi protokolünü. E. coli ile stres yanıtları ve metabolik mühendislik çalışmaları için uygulanabilir.

Bir Kemostat kullanarak Mikroorganizmaların Adaptif Laboratuvarı Evolution Prosedürü

Daha fazla video keşfet