IgG ve IgM Antikorlarının Eşzamanlı Algılama için İki Renkli Antijen Mikroarray'ler Üretimi

Bu tekniğin genel amacı, otoantikorların çoklu bir biçimde hızlıca taranmasıdır. Bu yöntem, hangi otoantikorların farklı hastalık durumlarıyla ilişkili olduğu gibi otoimmünite alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajları; otoantikorların paralel bir şekilde taranabilmesi, yalnızca mikrolitre düzeyinde serum gerektirmesi ve yalnızca mikrogram düzeyinde antijen gerektirmesidir.

Antijen mikro dizileri oluşturmak için, öncelikle antijenleri PBS içinde 2 mg/mL nihai konsantrasyona gelecek şekilde seyrelterek başlayın. 162'ye kadar benzersiz antijeni çiftle basmak için dokuz pimli bir mikro dizici konfigürasyonu kurun. Pozitif kontroller olarak antijen kütüphanesine IgG ve IgM antijenlerini ekleyin.

Negatif kontrol olarak sadece PBS ekleyin. Her bir antijenden 20 µL'yi, baskı kafasının kurulumunu yansıtan gruplar halinde 384 kuyucuklu kaynak plakasına ekleyin. Kaynak plağını folyo ile kapatın ve diziler basılmaya hazır olana kadar plakayı -80 °C'de dondurun.

Katı mikro-dizi pinlerini, her biri bir dakika sürecek şekilde üç kez deiyonize su içeren sonikasyon banyosunda inkübe ederek temizleyin. Pinleri kurumaları için bir rafa yerleştirin. Ardından pinleri mikro-dizi baskı kafasına yerleştirin.

Dokuz pin için, üç çarpı üç konfigürasyon kullanın. Ardından, baskı kafasındaki pin sayısını, basılacak lam sayısını, her lamdaki ped sayısını ve her antijen için tekrarlanan spot sayısını ayarlayarak mikro-dizilim cihazını baskı işlemi için programlayın. Ek olarak, mikro-dizilim cihazını farklı antijen grupları arasında pinleri suda sonike edecek şekilde programlayın.

Ardından, kaynak plakayı çözdürdükten sonra 100 ×g'de bir dakika boyunca santrifüjleyin. Kaynak plakayı mikro-dizilim cihazındaki belirlenmiş noktaya yerleştirin, ardından basılacak ilk antijen grubunu örten folyo bölümünü çıkarın. Basılmamış lamları dizilim cihazının yüzeyine yerleştirin ve basım programını çalıştırın. Lamları, cihazdaki nem oranı %55 ile %60 arasında ayarlanmışken oda sıcaklığında basın. Her antijen grubu tüm lamlara basıldıktan sonra mikro-dizilim cihazını duraklatın.

Buharlaşmayı önlemek için yeni basılan antijenlerin üzerini folyo ile kapatın ve basılacak bir sonraki antijen grubunun üzerini açın. Ardından, basma programına devam edin. Tüm antijenler basıldıktan sonra, kaynak plakanın üzerini yeni bir folyo parçasıyla kapatın ve eksi 80 degrees Celsius'ta dondurun.

Basılı lamları bir lam kutusuna yerleştirin ve vakumla mühürleyin. Lamlar ertesi gün veya bir aya kadar sonra kullanılabilir. Seyreltilmiş serumlar ile inkübasyon odaları kullanarak mikro-dizileri analiz etmek için lamları çerçevelere yerleştirin.

Ardından, her dizi yüzeyine 700 µL bloklama tamponu ekleyin. Yapışkan filmi çerçevenin üzerine yerleştirin ve ıslak bir mendil ile birlikte sızdırmaz bir kaba aktarın. Daha sonra, lamları bir rocker üzerinde dört °C'de gece boyunca inkübe edin.

Ertesi gün, serum örneklerini bloklama tamponunda 1:100 oranında seyreltin. Ardından, dizilerdeki bloklama solüsyonunu aspire edin ve her bir dizi yüzeyine 500 µL seyreltilmiş örnek ekleyin. Daha sonra, dizileri yapışkan filmle kapatın ve bir saat boyunca, sallayarak 4 °C'de inkübe edin.

Ardından, serum örneklerini dizilerle aspirat edin ve tamponu lamların üzerine döküp hızla silkeleyerek dizey yüzeylerini dört kez durulama tamponu ile yıkayın. Her bir dizi yüzeyini yıkamak için 700 microliters bloklama tamponu kullanın ve oda sıcaklığında, sallayarak 10 dakika inkübe edin. Daha sonra, her bir lam yüzeyine 500 microliters seyreltilmiş sekonder antikor ekleyin ve üzerini yapışkan filmle kapatın.

Lamları dört derece Celsius'ta, sallayarak 45 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından, ikincil antikor karışımını lamlardan aspire edin ve az önce gösterildiği gibi dört kez durulayın. Ardından, lamları 700 microliter bloklama dilüsyon tamponu ile her biri 10 dakika sürecek şekilde üç kez yıkayın.

Slaytları çerçevelerden çıkarın, ardından onları metal bir slayt rafına yerleştirin ve PBS içine daldırın. Oda sıcaklığında, orbital çalkalamalı olarak 20 dakika inkübe edin. Bir slayt rafını 15 saniye boyunca deiyonize su içeren bir kaba yerleştirin.

Ardından rafı yeni bir su kabına yerleştirin ve 15 saniye daha inkübe edin. Lamları kurutmak için, lam rafını santrifüjdeki bir ELISA plak adaptörüne yerleştirin ve oda sıcaklığında, 220 ×g hızında beş dakika boyunca döndürün. Tarama aşamasına kadar lamları ışık geçirmeyen bir kutuda saklayın.

Slaytları taramak için SI three ve SI five floresan sinyallerini tespit edebilen bir mikroarray tarayıcı kullanın. Yalnızca sekonder antikorlarla problanmış tam bir antijen kütüphanesi slaytını ön tarama yaparak optimal çoğaltıcı tüp veya PMT ayarlarını belirleyin. SI three kanalındaki insan IgG özelliklerinin ve SI five kanalındaki insan IGM özelliklerinin, genellikle 40.000 olan benzer bir medyan floresan yoğunluğu eksi arka plan (MFIB) değerine sahip olması için donanım düğmesine basarak kullanılan PMT değerlerini ayarlayın.

Ardından, tarama düğmesine basarak deneysel lamları iki kanalda tarayın. Her taramadan sonra her iki kanaldaki lam görüntülerini kaydedin. Dosya düğmesini kullanarak, analiz edilecek lamı mikro array yazılımına yükleyin.

Ardından, dizi düzenini ve dizi özelliklerinin kimliklerini içeren gen dizisi listesini veya GAL dosyasını yüklemek için dosya düğmesini kullanın. Dizinin özelliklerinin şablonla mümkün olduğunca yakın şekilde eşleşmesi için dizi şablonunu taranmış görüntünün üzerine yerleştirin. Tüm bloklardaki özellikleri şablonla hizalamak için hizala düğmesine basın.

Yazılım daha sonra her bir antijen için arka plan çıkarılmış bir MFI değeri hesaplayacaktır. Son olarak, sonuçları bir metin dosyası olarak dışa aktarmak için dosya düğmesini kullanın ve verileri metin protokolüne göre analiz edin. Pozitif ve negatif kontrol lamlarını gösteren bu şekilde, negatif lam sadece sekonder antikorlarla probe edilmiş, pozitif kontrol lamı ise sistemik lupus eritematozus hastası bir kişiden alınan serumla probe edilmiştir.

Burada belirtildiği gibi, riboP'ye karşı bilinen reaktiviteye sahip pozitif kontrol serumunun, tek zincirli DNA'ya karşı IgM antikorları ve riboP'ye karşı IgG antikorları içerdiği gösterilmiştir. Tüm serum dilüsyonlarında IgM ile lineer yanıtlar, IgG ile ise yaklaşık 30.000'lik bir arka plan çıkarılmış MFI değerine kadar lineer yanıtlar gözlemlenmiştir. Bu deneyde dizi, IgG'ye karşı bir IgM antikoru olan romatoid faktörü belgelenmiş, kriyoglobulinemik vaskülit hastasından alınan insan serumu ile sondalanmaktadır.

Dizideki immobilize IgG'ye hastanın serumundaki IgM'nin bağlanması nedeniyle IgG özelliği sarı-yeşil renktedir. Yalnızca ikincil antikorlar kullanıldığında, dizi üzerine damlatılmış IgG'ye karşı herhangi bir IgM reaktivitesi görülmez. Burada gösterildiği üzere, dizi üzerine damlatılan fare IgM ve IgG'leri, sırasıyla yalnızca IgM ve IgG'ye yönelik anti-fare ikincil antikorlar ile tespit edilmektedir.

Bu şekil, mikroarray analiz yazılımı kullanılarak taranmış bir dizi görüntüsü üzerine şablon ızgaranın hizalanmasını göstermektedir. Hizalama işlemi tamamlandıktan sonra, her bir özellik için arka plan çıkarılmış medyan floresans yoğunluğunu elde etmek amacıyla dizi özellikleri analiz edilebilir. İşleme hakim olunduğunda, antijen mikroarraylerinin problanması uygun şekilde yapıldığı takdirde dört saat içinde tamamlanabilir.

Bu prosedürün ardından, antijen mikro dizileriyle elde edilen sonuçları doğrulamak için ELISA gibi diğer teknikler uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra; antijen mikro dizilerinin nasıl basılacağı, serum ile nasıl problanacağı ve bir tarayıcı ile nasıl taranacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. İnsan serumu ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken evrensel önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.