IgG ve IgM Antikorlarının Eşzamanlı Algılama için İki Renkli Antijen Mikroarray'ler Üretimi

Bu tekniğin genel amacı, otoantikorları multipleks bir şekilde hızlı bir şekilde taramaktır. Bu yöntem, hangi otoantikorların farklı hastalık durumlarıyla ilişkili olduğu gibi otoimmünite alanındaki temel soruların belirlenmesine yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajları, otoantikorların paralel bir şekilde taranabilmesi, sadece mikrolitre seruma ihtiyaç duyulması ve sadece mikrogram antijene ihtiyaç duyulmasıdır.

Antijen mikrodizileri oluşturmak için, PBS'deki antijenleri mililitre başına 2 miligramlık bir nihai konsantrasyona seyrelterek başlayın. 162 adede kadar benzersiz antijeni çift olarak yazdırmak için dokuz pimli bir mikro dizileyici konfigürasyonu ayarlayın. IgG ve IgM antijenlerini antijen kütüphanesine pozitif kontroller olarak dahil edin.

PBS'yi yalnızca negatif kontrol olarak dahil edin. Her bir antijenden 20 mikrolitreyi, baskı kafasının kurulumunu yansıtan gruplar halinde 384 kuyulu kaynak plakasına ekleyin. Kaynak plakasını kaplamak için folyo kullanın ve dizileri yazdırmaya hazır olana kadar plakayı eksi 80 santigrat derecede dondurun.

Katı mikrodizi pimlerini, her biri bir dakika boyunca üç kez deiyonize su ile sonikasyon banyosunda inkübe ederek temizleyin. Pimleri kuruması için bir rafa yerleştirin. Ardından pimleri mikrodizi yazıcı kafasına yerleştirin.

Dokuz pin için üçe üç konfigürasyon kullanın. Ardından, yazıcı kafasındaki pin sayısını, yazdırılacak slayt sayısını, her slayttaki ped sayısını ve her antijen için çoğaltma noktalarının sayısını ayarlayarak baskı çalışması için mikroarrayer'ı programlayın. Ek olarak, mikroarrayer'ı farklı antijen grupları arasındaki pimleri suda sonikasyon yapacak şekilde programlayın.

Daha sonra, kaynak plakasını çözdürdükten sonra, 100 kez G'de bir dakika santrifüjleyin. Kaynak plakasını mikroarrayer'da belirlenen yere yerleştirin, ardından basılacak ilk antijen grubunu kaplayan folyo bölümünü çıkarın. Yazdırılmamış slaytları arrayer yüzeyine yerleştirin ve yazdırma programını çalıştırın. Slaytları, dizileyicide nem oranı %55 ila %60 arasında ayarlanmış olacak şekilde oda sıcaklığında yazdırın Her bir antijen grubu tüm slaytlara yazdırıldıktan sonra, mikro dizileyiciyi duraklatın.

Buharlaşmayı önlemek için yeni basılmış olan antijenleri folyo ile örtün ve basılacak bir sonraki antijen grubunu ortaya çıkarın. Ardından, yazdırma programına devam edin. Tüm antijenler basıldıktan sonra, kaynak plakasını yeni bir folyo parçasıyla örtün ve eksi 80 santigrat derecede dondurun.

Yazdırılan slaytları bir slayt kutusuna yerleştirin ve vakumla kapatın. Slaytlar ertesi gün veya bir ay sonrasına kadar kullanılabilir. İnkübasyon odaları kullanarak seyreltilmiş serumlarla mikrodizileri araştırmak için, slaytları çerçevelere yerleştirin.

Daha sonra her dizi yüzeyine 700 mikrolitre engelleme tamponu ekleyin. Yapışkan filmi çerçevenin üzerine yerleştirin ve bir parça ıslak mendille birlikte kapalı bir kaba aktarın. Ardından, slaytları gece boyunca bir külbütör üzerinde dört santigrat derecede inkübe edin.

Ertesi gün, serum örneklerini bloke edici tamponda bir ila 100 oranında seyreltin. Daha sonra blokaj çözeltisini dizilerden aspire edin ve her dizi yüzeyine 500 mikrolitre seyreltilmiş numune ekleyin. Daha sonra, dizileri yapışkan film ile örtün ve bir saat boyunca sallanarak dört santigrat derecede inkübe edin.

Ardından, serum örneklerini dizilerden aspire edin ve tamponu slaytların üzerine dökerek ve hızlı bir şekilde hafifçe vurarak dizi yüzeylerini dört kez durulamak için durulama tamponu kullanın. Her dizi yüzeyini yıkamak için 700 mikrolitre engelleme tamponu kullanın ve oda sıcaklığında sallanarak 10 dakika inkübe edin. Daha sonra, her bir slayt yüzeyine 500 mikrolitre seyreltilmiş ikincil antikor ekleyin ve kaplamak için yapışkan film kullanın.

Slaytları 45 dakika sallayarak dört santigrat derecede inkübe edin. İnkübasyondan sonra, ikincil antikor karışımını slaytlardan aspire edin ve az önce gösterildiği gibi dört kez durulayın. Ardından, slaytları 700 mikrolitre bloke edici seyreltme tamponu ile her biri 10 dakika boyunca üç kez yıkayın.

Slaytları çerçevelerden çıkarın, ardından metal bir kaydırma rafına yerleştirin ve PBS'ye daldırın. 20 dakika orbital çalkalayarak oda sıcaklığında inkübe edin. 15 saniye boyunca deiyonize su dolu bir kaba bir sürgülü raf yerleştirin.

Ardından rafı yeni bir su kabına yerleştirin ve 15 saniye daha inkübe edin. Slaytları kurutmak için, sürgülü rafı santrifüjdeki bir ELISA plaka adaptörüne yerleştirin ve 220 kez G ve oda sıcaklığında beş dakika döndürün. Slaytları taramaya hazır olana kadar ışık geçirmez bir kutuya yerleştirin.

Slaytları taramak için, SI üç ve SI beş floresan sinyallerini algılayabilen bir mikrodizi tarayıcı kullanın. Yalnızca ikincil antikorlarla problanan tam bir antijen kütüphanesi slaytını önceden tarayarak optimal çarpan tüpünü veya PMT ayarlarını belirleyin. Donanım düğmesine basarak kullanılan PMT değerlerini, SI üç kanalındaki insan IgG özellikleri ve SI beş kanalındaki insan IGM özellikleri, benzer bir medyan floresan yoğunluğu eksi arka plana veya tipik olarak 40.000 olan MFIB'ye sahip olacak şekilde ayarlayın.

Ardından, tarama düğmesine basarak iki kanaldaki deneysel slaytları tarayın. Her taramadan sonra slayt görüntülerini her iki kanalda da kaydedin. Dosya düğmesini kullanarak, analiz edilecek slaydı mikrodizi yazılımına yükleyin.

Ardından, gen dizisi listesini veya dizi özelliklerinin kimlikleriyle birlikte dizinin düzenine sahip GAL dosyasını yüklemek için dosya düğmesini kullanın. Dizi şablonunu taranan görüntünün üzerine yerleştirin, böylece dizi özellikleri şablona mümkün olduğunca yakın bir şekilde eşleşir. Tüm bloklardaki unsurları şablonla hizalamak için hizala düğmesine basın.

Yazılım daha sonra antijenlerin her biri için bir MFI eksi arka planı hesaplar. Son olarak, sonuçları bir metin dosyası olarak dışa aktarmak ve verileri metin protokolüne göre analiz etmek için dosya düğmesini kullanın. Pozitif ve negatif kontrol slaytlarını gösteren bu şekilde, negatif slayt sadece ikincil antikorlarla problanmıştır ve pozitif kontrol slaytı sistemik lupus eritematozuslu bir hastadan alınan serum ile problanmıştır.

Burada belirtildiği gibi, riboP'ye karşı bilinen reaktiviteye sahip pozitif kontrol serumunun, tek sarmallı DNA'ya karşı IgM antikorlarına ve riboP'ye karşı IgG antikorlarına sahip olduğu gösterilmiştir. Tüm serum dilüsyonlarında IgM ile ve yaklaşık 30.000 MFI eksi arka plana kadar IgG ile doğrusal tepkiler gözlendi. Bu deneyde, dizi, IgG'ye karşı bir IgM antikoru olan belgelenmiş bir romatoid faktöre sahip kriyoglobulinemik vaskülitli bir hastadan alınan insan serumu ile incelenir.

IgG özelliği, hastanın serumundaki IgM'nin dizi üzerindeki hareketsiz hale getirilmiş IgG'ye bağlanması nedeniyle sarı-yeşil renktedir. Tek başına ikincil antikorlar kullanıldığında, dizi üzerinde tespit edilen IgG'ye karşı hiçbir IgM reaktivitesi görülmez. Burada gösterilen, dizi üzerinde tespit edilen fare IgM ve IgG, yalnızca sırasıyla IgM ve IgG'ye karşı anti-fare ikincil antikorları ile tespit edilir.

Bu şekil, mikrodizi analiz yazılımı kullanılarak taranan bir dizi görüntüsü üzerindeki bir şablon ızgarasının hizalamasını gösterir. Hizalandıktan sonra, dizi unsurları, her bir unsur için medyan floresan yoğunluğu eksi arka plan elde etmek için analiz edilebilir. Bir kez ustalaştıktan sonra, antijen mikrodizilerinin sondalanması, uygun şekilde yapılırsa dört saat içinde yapılabilir.

Bu prosedürü takiben, antijen mikrodizilerinden elde edilen sonuçları doğrulamak için ELISA gibi diğer teknikler uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, antijen mikrodizilerinin nasıl yazdırılacağını, antijen mikrodizilerinin serumla nasıl araştırılacağını ve antijen mikrodizilerinin bir tarayıcı ile nasıl taranacağını iyi anlamış olmalısınız. İnsan serumu ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken evrensel önlemler alınması gerektiğini unutmayın.