Name: IgG ve IgM Antikorlarının Eşzamanlı Algılama için İki Renkli Antijen Mikroarrayler Üretimi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Öğrenin, insan ve fare serumlarından IgG ve IgM otoantikorlarının eşzamanlı tespiti için özelleştirilebilir antijen mikrodizileri oluşturmayı. Bu yüksek verimli yöntem, otoimmün hastalıklarla ilişkili antikorları hızla taramanıza olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

AC, Kanada Kalp ve İnme Vakfı ve Rejeneratif Tıp Eğitim Programı'ndan (Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri) doktora sonrası bir burs ile desteklenmiştir. F.Y.Y.H. Rejeneratif Tıp Eğitim Programı tarafından desteklenmiştir. Bu çalışma Astellas Pharma Canada'dan bir hibe ile finanse edilmiştir. Ayrıca Dr. Mark Menenghini'ye (Toronto Üniversitesi) Axon mikroarray tarayıcısını kullandığı için teşekkür ederiz.

1. Sulandırma antijen ve Yaratma Antijen Mikroarray&#39;ler <ol><li> 0.2 mg / ml&#39;lik bir son konsantrasyona PBS içinde antijenleri seyreltilir. 9 iğneli bir mikro-dizici konfigürasyonu ile iki nüsha halinde 162 kadar benzersiz antijenleri yazdırın. antijen kitaplık olarak pozitif kontrol IgG ve IgM antijenleri ekleyin. Yalnızca bir negatif kontrol olarak PBS içerir. </li><li> 384 gözlü bir kaynak plaka her bir antijenin 20 ul ekle. Kafasının kurulumu ayna gruplar halinde kaynak plakasına antijenleri ekleyin (9 pimleri baskı için kullanıldığında, örneğin, 9 kişilik gruplar halinde antijenleri düzenlemek). </li><li> diziler yazdırmak için hazır olana kadar -80 ° C&#39;de folyo ve dondurma ile kapak kaynak plakası. </li><li> 3 x 1 dakika boyunca iyonu giderilmiş su ile, bir sonikasyon banyosu içinde onları kuluçka katı mikro-dizici işaretçilerini temizleyin. rafa yerleştirin pimleri kurutun ve daha sonra mikroarray yazıcı kafasındaki işaretçilerine düzenlemek için. 9 pin için, 3 x 3 yapılandırmayı kullanın. </li><li> kafasının sayı işaretçilerine ayarlayarak tarafından işletilen baskı için program mikro-dizici,slaytlar sayısı her slaytta, pedleri numarasını yazdırmak ve her bir antijen için çoğaltmak lekelerin sayısı için. Tipik olarak, 9 işaretçilerine, 70 kaydırak, 2 pedleri / slayt ve her bir antijen için 2 suret noktalar kullanın. Program mikro-dizici antijenlerin farklı gruplar arasında suda işaretçilerine ses dalgalarına maruz için. </li><li> Çözülme kaynak plakası 100 x g, 1 dakika daha sonra santrifüj plaka. mikro dizicinin belirlenen noktada kaynak plaka koyun. Basılacak antijenlerin ilk grubu kapsayan folyo bölümünü kaldırın. </li><li> arrayer yüzeyi ve çalıştırma baskı programı baskısız slaytlar düzenleyin. Dizi makinesinin nemlendirici inşa ile% 60 - nem oda sıcaklığında baskı slaytlar 55 de arrayer ayarlanır. </li><li> antijenlerin her grup her slaytlarda basıldıktan sonra, mikro-dizici duraklatmak. sadece folyo ile basıldı antijenleri Kapak (buharlaşmasını önlemek için) ve antijenlerin sonraki grup basılacak ortaya çıkarmak. Baskı programına devam edin. </li><li> Tüm antijenler yazdırıldıktan sonra, kapak kaynak pl-80 ° C folyo ve dondurma yeni bir parça ile yedi. slayt kutu ve vakum mühür basılmış slaytlar yerleştirin. Slaytlar ertesi gün kullanılan veya en fazla bir ay sonra olabilir. </li></ol> 2. Seyreltik Sera ile Antijen mikrodizileri Probing <ol><li> Kuluçka odaları kullanarak çerçevelerin içine slaytlar yerleştirin. Her bir dizi yüzey engelleme tamponu (% 2.5 [hacim / hacim] fetal buzağı serumu (FCS), PBS içinde Tween 20,% 0.1 [/ hacim: hacim]) 700 ul ekle. </li><li> Islak bir doku parçası ile kapalı bir kapta çerçeve ve yerde yapışkan film yerleştirin. bir rocker 4 ° C&#39;de O / N inkübe edin. </li><li> Serum örnekleri 1 sulandırmak: 100 tampon engelleme. Aspire dizilerden engelleme çözümü ve her dizi yüzeyine seyreltilmiş örnek 500 ul ekleyin. </li><li> yapışkan film ile örtün ve sallanan 4 ° C sıcaklıkta 1 saat boyunca inkübe edilir. </li><li> tampon engelleme ikincil antikorlar seyreltilir. İnsan deneyleri için, 0.33 mg / ml ve Cy5 bir Cy3 etiketli keçi anti-insan IgG antikoru seyreltilmiş keçi anti-Huma etiketli0.25 ug / ml IgM antikoru n. Fare çalışmaları için, bir Cy3 mi 0.38 ug / keçi anti-fare IgG antikoru etiketlenmiş ve bir Cy5 / ml 0.7 ug keçi anti-fare IgM antikoru etiketli seyreltin. </li><li> dizileri aspire örnekler ve dizi yüzeyleri durulama tamponu (PBS içerisinde% 0.1 Tween 20) ile 4 kez yıkayın. slaytlar üzerine tampon ve çabuk fiske dökün. </li><li> sallanan oda sıcaklığında her dizi yüzeyini yıkamak ve 10 dakika inkübe etmek blokaj tamponu 700 ul ekle. Tekrarlayın yıkama adımı iki kez daha. </li><li> Her slayt yüzeyine seyreltilmiş ikincil antikor 500 ul ekleyin ve yapışkan film ile kaplayın. sallanan 4 ° C&#39;de 45 dakika inkübe edin. </li><li> Aspire ikincil antikor slaytlar gelen karışım ve yukarıdaki gibi 4 kez yıkayın. Yıkama yukarıdaki gibi engelleme / seyreltme tamponu 700 ul ile 3 kez kayar. </li><li> PBS batırılır metal slayt raf çerçeveleri ve yerden slaytları çıkarın. yörünge çalkalama ile oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkalayın. PBS yeni kapta koyun ve başka bir 20 m inkübesallayarak ile. </li><li> deiyonize su 15 saniye bir kap içine koyun slayt raf. su, yeni bir kapta raf yerleştirin ve başka bir 15 saniye kuluçkaya yatmaktadır. </li><li> Kuru slaytlar, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 220 xg&#39;de santrifüj ve spin bir ELISA plakası adaptörü üzerindeki yeri slayt rafa. </li><li> tarama için hazır olana kadar ışık geçirmez kutu slaytlar yerleştirin. </li></ol> 3. Tarama Antijen Mikroarray&#39;ler ve İhracat Verileri <ol><li> Cy3 ve Cy5 floresan sinyalleri algılayabilen bir mikrodizi tarayıcı kullanarak tarama slaytlar. Tarayıcının photomultiplier tüp (PMT) seviyesini ayarlamak için, sadece sekonder antikor ile problanmıştır bir slayt önceden tarayın. Not: Bu slayt tam pozitif (IgG ve IgM) de dahil olmak üzere basılmış antijen kütüphanesi yanı sıra negatif (PBS) kontrolleri olmalıdır. ön tarama optimum PMT ayarlarını bulmak için hızlı bir şekilde kullanıcı sağlayan bir düşük çözünürlüklü tarama olduğunu. </li><li> PMT değerlerini ayarlayın, böylece (Cy3 kanalında) insan IgG özellikleri ve uğultu(Cy5 kanalında) bir IgM özellikleri benzer medyan floresan eksi arka plan (MFI-B) (tipik olarak 40.000) var. PMT düzeyleri &quot;donanım&quot; düğmesine basarak ayarlanır. ayarlandıktan sonra, sabit bu PMT ayarları korumak. </li><li> &quot;Tarama&quot; tuşuna basarak iki kanal deneysel slaytlar tarayın. Her taramadan sonra slayt görüntüleri (iki kanal) kaydedin. </li><li> slayt yükle &quot;Dosya&quot; düğmesini kullanarak mikroarray yazılımı içine analiz edilecek. </li><li> &quot;Dosya&quot; düğmesini kullanarak gen dizisi listesi (GAL) dosyasını yükleyin. GAL dosya dizisi özellikleri kimlikleri ile dizinin düzeni vardır. </li><li> diziler özellikleri mümkün olduğunca yakından şablonu eşleşecek şekilde taranan görüntünün üzerine dizi şablonu yerleştirin. </li><li> &quot;Hizalama&quot; düğmesine basarak şablonu ile tüm bloklarda özellikleri aynı hizaya getirin. Program genellikle dairesel özellikleri anahat bulacaksınız ama bazı manuel ayarlamalar gerekebilir. Bu ayarlamalar özellik moduna girerek yapılabilir. Yazılım daha sonra antijenlerin her biri için bir MFI-B hesaplar. </li><li> Bir metin dosyası olarak bu sonuçları ihracat &quot;dosya&quot; düğmesini kullanın. </li></ol> Mikroarray&#39;ler Önemi Analizi ile 4. Analiz Dizi Verileri (SAM) <ol><li> excel içine tek metin dosyaları yüklemek ve Cy3 ve Cy5 kanalları için MFI-B var sütunları belirlemek. </li><li> yinelenen özellikler için ortalama hesaplayın. </li><li> herhangi bir olumsuz MFI-B, 10 ile negatif sayı günlük tabanı 2 hesaplayarak sonra 100 ile ham MFI-B bölünmesi ve verileri Transform değiştirin. </li><li> Daha önce 7 açıklandığı gibi Mikroarray&#39;ler (SAM) Önemi Analizi ile günlük dönüştürülmüş verileri analiz edin. </li><li> Iki grup (örneğin, sağlıklı kontrol vs hasta), etiket bir grup &quot;1&quot; ve grup kullanarak bir çalışma için &quot;2.&quot; ler vardır antijenler reaksiyonlarını belirlemek için SAM iki sınıf, eşleşmemiş analizini kullanınHer iki grup arasında önemli ölçüde farklıdır (q &lt;0.05). </li><li> Sunum 8 görüntüleri yapmak için kümeleme ve ısı haritası üreten yazılımını kullanın. </li></ol>

<ol><li>Naparstek, Y., Plotz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+autoantibodies+in+autoimmune+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The role of autoantibodies in autoimmune disease.</a> Annu Rev Immunol. 11, 79-104 (1993).</li>
<li>Damoiseaux, J., Andrade, L. E., Fritzler, M. J., Shoenfeld, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantibodies+2015%3A+From+diagnostic+biomarkers+toward+prediction%2C+prognosis+and+prevention%5BTitle%5D)+AND+%22Autoimmun+Rev%22%5BJournal%5D)">Autoantibodies 2015: From diagnostic biomarkers toward prediction, prognosis and prevention.</a> Autoimmun Rev. 14, 555-563 (2015).</li>
<li>Robinson, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantigen+microarrays+for+multiplex+characterization+of+autoantibody+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature.+medicine%22%5BJournal%5D)">Autoantigen microarrays for multiplex characterization of autoantibody responses.</a> Nature. medicine. 8, 295-301 (2002).</li>
<li>Quintana, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+microarrays+identify+unique+serum+autoantibody+signatures+in+clinical+and+pathologic+subtypes+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Antigen microarrays identify unique serum autoantibody signatures in clinical and pathologic subtypes of multiple sclerosis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 18889-18894 (2008).</li>
<li>Hueber, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+microarray+profiling+of+autoantibodies+in+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">Antigen microarray profiling of autoantibodies in rheumatoid arthritis.</a> Arthritis Rheum. 52, 2645-2655 (2005).</li>
<li>Price, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+microarray+analysis+reveals+BAFF-binding+autoantibodies+in+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Protein microarray analysis reveals BAFF-binding autoantibodies in systemic lupus erythematosus.</a> J. Clin. Invest. 123, 5135-5145 (2013).</li>
<li>Tusher, V. G., Tibshirani, R., Chu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significance+analysis+of+microarrays+applied+to+the+ionizing+radiation+response%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Significance analysis of microarrays applied to the ionizing radiation response.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 5116-5121 (2001).</li>
<li>Eisen, M. B., Spellman, P. T., Brown, P. O., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cluster+analysis+and+display+of+genome-wide+expression+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 14863-14868 (1998).</li>
<li>Chruscinski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Antigen+Microarrays+to+Screen+for+Autoantibodies+in+Heart+Failure+and+Heart+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Generation of Antigen Microarrays to Screen for Autoantibodies in Heart Failure and Heart Transplantation.</a> PloS one. 11, e0151224(2016).</li>
<li>Price, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+influenza+vaccine+immunogenicity+using+influenza+antigen+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Characterization of influenza vaccine immunogenicity using influenza antigen microarrays.</a> PloS one. 8, e64555(2013).</li>
<li>Singh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactivity+profiles+of+broadly+neutralizing+anti-HIV-1+antibodies+are+distinct+from+those+of+pathogenic+autoantibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Aids%22%5BJournal%5D)">Reactivity profiles of broadly neutralizing anti-HIV-1 antibodies are distinct from those of pathogenic autoantibodies.</a> Aids. 25, 1247-1257 (2011).</li>
<li>Porcheray, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+humoral+rejection+of+human+kidney+allografts+associates+with+broad+autoantibody+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Chronic humoral rejection of human kidney allografts associates with broad autoantibody responses.</a> Transplantation. 89, 1239-1246 (2010).</li>
<li>Haddon, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+epitopes+of+U1-70K+autoantibodies+at+single-amino+acid+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Autoimmunity%22%5BJournal%5D)">Mapping epitopes of U1-70K autoantibodies at single-amino acid resolution.</a> Autoimmunity. 48, 513-523 (2015).</li>
<li>Schroeder, H. W. Jr, Cavacini, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+immunoglobulins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Structure and function of immunoglobulins.</a> J Allergy Clin Immunol. 125, S41-S52 (2010).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Burada açıklanan protokol antijen mikrodizi tekniği kullanılarak otoantikorlann ölçümü sağlar. Antijen mikrodizileri otoantikorlar için eleme testi esnasında klasik ELISA göre birçok avantajı vardır. Her şeyden önce, nükleik asitler, proteinler, peptidler ve hücre lizatları dahil çeşitli antijenlere ve böylece oto antikorların çoğaltılmış çok katlı taranması için izin nitroselüloz kaplı slaydlar üzerine dizilmiş olabilir. antijen nanolitre Her bir slayt üzerine fark vardır Ek olarak, antijenin yalnızca mikrogram diziler...

Otoantikorlar birçok hastalık durumunda bulunur ve sıklıkla doğrudan patojenik aktiviteyesahip olabilir 1. Otoantikorların tanımlanması bazı hastalıkların tanısı, hastalık sonuçlarının prognozu ve spesifik tedavilerden fayda görebilecek hastaların sınıflandırılması için önemlidir2. Otoantikorlar tipik olarak ELISA tekniği kullanılarak hasta serumunda tanımlanır; Bununla birlikte, bu teknikle çoklu antijenlerin taranması zahmetlidir ve büyük miktarda hasta örneği tüketir. Bu nedenle, otoantikorları daha büyük ölçekte profillemek için yeni teknolojilere ihtiyaç vardır.
Antijen mikroarray tekniği, otoantikorların multipleks bir şekilde profillenmesine izin veren proteomik bir teknolojidir3. Bu işlemin ilk adımında, bir antijen kütüphanesi, robotik bir mikroarrayer kullanılarak bir slayt yüzeyine dizilir. Slaytlar seyreltilmiş serum ile incelenir ve daha sonra floresan işaretli ikincil antikorlar eklenir. Antikor reaktiviteleri, slaytların bir mikroarray tarayıcı ile taranmasıyla görselleştirilir ve floresan yoğunlukları ile ölçülür. Antijen mikrodizileri, otoantikorların taranmasında ELISA tekniğine göre birçok avantaj sunar: 1) otoantikorları aynı anda birden fazla antijene karşı profillemek için sadece mikrolitre seruma ihtiyaç duyarlar, 2) antijeni idareli kullanırlar, çünkü dizilerde sadece nanolitre antijen tespit edilir, 3) ELISA'ya kıyasla gelişmiş duyarlılığasahiptirler 3 ve 4) eşzamanlılığa izin verirler, Birden fazla antikor izotipinin ayrı ayrı tespiti. Antijen mikrodizileri, romatoid artrit, multipl skleroz ve sistemik lupus eritematozus4-6 gibi otoimmün hastalıklarda otoantikorların profilini çıkarmak için kullanılmıştır. Bu hastalıkların her üçünde de, otoantikorların dizilerle büyük ölçekte profillenmesiyle hastalık patogenezine ilişkin yeni bilgiler elde edildi. 
Burada, nitroselüloz kaplı slaytlar kullanarak antijen mikrodizileri oluşturmak için bir protokol açıklıyoruz. Proteinler, peptitler ve hücre lizatları dahil olmak üzere çeşitli antijenler, bu teknik kullanılarak slaytlar üzerine dizilebilir. Diziler, antijen kütüphanesini tutan kaynak plakasına ilgilenilen antijenleri dahil ederek kolayca özelleştirilebilir. Ek olarak, aynı slayt yüzeyi üzerinde IgG ve IgM reaktivitelerini ayırmak için bir çift ikincil antikorun nasıl kullanılabileceğini gösteriyoruz. Şimdi bu tekniği hem insanlarda hem de farelerde otoantikorları ölçmek için optimize ettik.

<table><tbody><tr><td>Ribozomal P0</td><td>Diarect</td><td>14100</td>, PBS <td></td></tr><tr><td>insan IgG Jackson</td><td>Immuno</td><td>009-000-003'te</td><td>0.2 mg / ml'ye seyreltilir, PBS insan IgM'sinde 0.2 mg / ml'ye seyreltilir</td></tr><tr><td></td><td>Jackson Immuno</td><td>009-000-012</td>, <td>PBS faresinde 0.2 mg / ml'ye seyreltilir</td></tr><tr><td>IgG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5381</td>, <td>PBS fare IgM'de 0.2 mg / ml'ye seyreltilir</td></tr><tr><td></td><td></td><td>Biolegend 401601</td><td>PBS</td></tr><tr><td>çift sarmallı DNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1626'da</td><td>0.2 mg / ml'ye seyreltin PBS</td></tr><tr><td>tek sarmallı DNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8899'da</td><td>0.2 mg / ml'ye seyreltin PBS mikroarrayer Virtek VersArray Chipwriter Pro'da 0.2 mg / ml'ye seyreltin</td></tr><tr><td></td><td></td><td>birçok arrayer türü uygundur</td><td></td></tr><tr><td>katı baskı pimleri</td><td>Arrayit Corporation</td><td>SSP015</td><td></td></tr><tr><td>robotik mikroarrayer Virtek</td><td></td><td>Chipwriter Pro için yazılım&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>HIZLI slaytlar (2 Ped)</td><td>GVS Northa America</td><td>10485317</td><td></td></tr><tr><td>HIZLI çerçeve</td><td>GVS Northa America</td><td>10486001</td><td></td></tr><tr><td>HIZLI inkübasyon odaları (2 Ped)</td><td>GVS Northa America</td><td>10486242</td><td></td></tr><tr><td>384 kuyulu plakalar</td><td>Whatman</td><td>7701-5101</td><td></td></tr><tr><td>plaka kapatıcılar</td><td>VWR</td><td>60941-062</td><td></td></tr><tr><td>folyo plaka kapakları</td><td>VWR</td><td>60941-124</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Fetal buzağı serumu</td><td>Invitrogen</td><td>12483020</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 keçi anti-insan IgG</td><td>Jackson Immuno</td><td>109-165-096</td>% <td>50 glyercol</td></tr><tr><td>Cy5 keçi anti-insan IgM</td><td>Jackson Immuno</td><td>109-175-129</td>% <td>50 glyercol Cy3 keçide çalışma stoğu kullanın</td></tr><tr><td> anti-fare IgG Jackson</td><td>Immuno</td><td>115-165-071</td><td>%50 glyercol</td></tr><tr><td>Cy5 keçi anti-fare IgM'de</td> çalışma stoğu kullanın <td>Jackson Immuno</td><td>115-175-075</td><td>%50 glyercol'de çalışma stoğu kullanın</td></tr><tr><td>Mikrodizi Tarayıcı</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td>Axon 4200A</td><td></td></tr><tr><td>Mikroarray yazılımı</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td>Genepix 6.1</td><td></td></tr><tr><td>Kümeleme yazılımı</td><td>eisenlab.org</td><td>Cluster: 3.0</td><td></td></tr><tr><td>Isı haritası yazılımı</td><td>eisenlab.org</td><td>Treeview 1.60</td><td></td></tr><tr><td>Microarray istatistik yazılımı</td><td>Stanford Üniversitesi</td><td>SAM 4.0 (Mikrodizilerin Anlamlılık Analizi)</td><td></td></tr></tbody></table>

igg ve igm antikorlarının eşzamanlı algılama için İki renkli antijen mikroarray&#39;ler Üretimi

Generation of Two-color Antigen Microarrays for the Simultaneous Detection of IgG and IgM Autoantibodies

Kendi antijenlerine karşı antikorlar olan otoantikorlar, birçok hastalık durumunda bulunur ve hastalık aktivitesi için belirteç görevi görebilir. Spesifik antijenlere karşı otoantikor seviyeleri tipik olarak enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) tekniği ile tespit edilir. Bununla birlikte, ELISA ile çoklu otoantikorların taranması zaman alıcı olabilir ve büyük miktarda hasta örneği gerektirir. Antijen mikroarray tekniği, otoantikorları multipleks bir şekilde taramak için kullanılabilecek alternatif bir yöntemdir. Bu teknikte antijenler, robotik bir mikroarrayer ile özel olarak kaplanmış mikroskop lamları üzerine dizilir. Slaytlar hasta serum örnekleri ile incelenir ve daha sonra serum otoantikorlarının antijenlere bağlanmasını tespit etmek için floresan işaretli ikincil antikorlar eklenir. Otoantikor reaktiviteleri, slaytların floresan sinyalleri algılayabilen bir tarayıcı ile taranmasıyla ortaya çıkarılır ve ölçülür. Burada, özel antijen mikrodizileri oluşturma yöntemlerini açıklıyoruz. Mevcut dizilerimiz 9 katı pim ile basılmıştır ve çift olarak tespit edilmiş 162 adede kadar antijen içerebilir. Diziler, mikroarrayer tarafından kullanılan kaynak plakasındaki antijenler değiştirilerek kolayca özelleştirilebilir. Aynı slayt yüzeyi üzerinde IgG ve IgM reaktivitelerini ayırt edebilen iki renkli bir ikincil antikor tespit şeması geliştirdik. Tespit sistemi, insan ve murin otoantikorlarının bağlanmasını incelemek için optimize edilmiştir.

Şekil 1&#39;de gösterildiği gibi antijenler bir robot mikro dizicinin tarafından Slaytlarınıza 384 plaka olarak düzenlenmiş ve yazdırılır. 2 inkübasyon odaları ve işlenmesinden sonra taranmış bir slayt ile bir çerçeve içinde yerleştirildi slaytlar göstermektedir. 3 pozitif ve negatif kontrol slaytlar göstermektedir. Negatif bir slayt, sadece sekonder antikor ile incelendi ve pozitif kontrol slayt sistemi...

Burada, insanlardan ve farelerden serum IgG ve IgM otoantikorlarının aynı anda tespiti için kullanılabilecek özelleştirilebilir antijen mikrodizileri oluşturmak için bir yöntem açıklıyoruz. Bu diziler, ilgilenilen herhangi bir antijene veya epitopa karşı antikorların yüksek verimli ve kantitatif tespitine izin verir.

IgG ve IgM Antikorlarının Eşzamanlı Algılama için İki Renkli Antijen Mikroarray&#39;ler Üretimi

Autoantibodies, which are antibodies against self-antigens, are present in many disease states and can serve as markers for disease activity. The levels ...

Bu tekniğin genel amacı, otoantikorların çoklu bir biçimde hızlıca taranmasıdır. Bu yöntem, hangi otoantikorların farklı hastalık durumlarıyla ilişkili olduğu gibi otoimmünite alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajları; otoantikorların paralel bir şekilde taranabilmesi, yalnızca mikrolitre düzeyinde serum gerektirmesi ve yalnızca mikrogram düzeyinde antijen gerektirmesidir.Antijen mikro dizileri oluşturmak için, öncelikle antijenleri PBS içinde 2 mg/mL nihai konsantrasyona gelecek şekilde seyrelterek başlayın. 162'ye kadar benzersiz antijeni çiftle basmak için dokuz pimli bir mikro dizici konfigürasyonu kurun. Pozitif kontroller olarak antijen kütüphanesine IgG ve IgM antijenlerini ekleyin.Negatif kontrol olarak sadece PBS ekleyin. Her bir antijenden 20 µL'yi, baskı kafasının kurulumunu yansıtan gruplar halinde 384 kuyucuklu kaynak plakasına ekleyin. Kaynak plağını folyo ile kapatın ve diziler basılmaya hazır olana kadar plakayı -80 °C'de dondurun.Katı mikro-dizi pinlerini, her biri bir dakika sürecek şekilde üç kez deiyonize su içeren sonikasyon banyosunda inkübe ederek temizleyin. Pinleri kurumaları için bir rafa yerleştirin. Ardından pinleri mikro-dizi baskı kafasına yerleştirin.Dokuz pin için, üç çarpı üç konfigürasyon kullanın. Ardından, baskı kafasındaki pin sayısını, basılacak lam sayısını, her lamdaki ped sayısını ve her antijen için tekrarlanan spot sayısını ayarlayarak mikro-dizilim cihazını baskı işlemi için programlayın. Ek olarak, mikro-dizilim cihazını farklı antijen grupları arasında pinleri suda sonike edecek şekilde programlayın.Ardından, kaynak plakayı çözdürdükten sonra 100 ×g'de bir dakika boyunca santrifüjleyin. Kaynak plakayı mikro-dizilim cihazındaki belirlenmiş noktaya yerleştirin, ardından basılacak ilk antijen grubunu örten folyo bölümünü çıkarın. Basılmamış lamları dizilim cihazının yüzeyine yerleştirin ve basım programını çalıştırın. Lamları, cihazdaki nem oranı %55 ile %60 arasında ayarlanmışken oda sıcaklığında basın. Her antijen grubu tüm lamlara basıldıktan sonra mikro-dizilim cihazını duraklatın.Buharlaşmayı önlemek için yeni basılan antijenlerin üzerini folyo ile kapatın ve basılacak bir sonraki antijen grubunun üzerini açın. Ardından, basma programına devam edin. Tüm antijenler basıldıktan sonra, kaynak plakanın üzerini yeni bir folyo parçasıyla kapatın ve eksi 80 degrees Celsius'ta dondurun.Basılı lamları bir lam kutusuna yerleştirin ve vakumla mühürleyin. Lamlar ertesi gün veya bir aya kadar sonra kullanılabilir. Seyreltilmiş serumlar ile inkübasyon odaları kullanarak mikro-dizileri analiz etmek için lamları çerçevelere yerleştirin.Ardından, her dizi yüzeyine 700 µL bloklama tamponu ekleyin. Yapışkan filmi çerçevenin üzerine yerleştirin ve ıslak bir mendil ile birlikte sızdırmaz bir kaba aktarın. Daha sonra, lamları bir rocker üzerinde dört °C'de gece boyunca inkübe edin.Ertesi gün, serum örneklerini bloklama tamponunda 1:100 oranında seyreltin. Ardından, dizilerdeki bloklama solüsyonunu aspire edin ve her bir dizi yüzeyine 500 µL seyreltilmiş örnek ekleyin. Daha sonra, dizileri yapışkan filmle kapatın ve bir saat boyunca, sallayarak 4 °C'de inkübe edin.Ardından, serum örneklerini dizilerle aspirat edin ve tamponu lamların üzerine döküp hızla silkeleyerek dizey yüzeylerini dört kez durulama tamponu ile yıkayın. Her bir dizi yüzeyini yıkamak için 700 microliters bloklama tamponu kullanın ve oda sıcaklığında, sallayarak 10 dakika inkübe edin. Daha sonra, her bir lam yüzeyine 500 microliters seyreltilmiş sekonder antikor ekleyin ve üzerini yapışkan filmle kapatın.Lamları dört derece Celsius'ta, sallayarak 45 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyonun ardından, ikincil antikor karışımını lamlardan aspire edin ve az önce gösterildiği gibi dört kez durulayın. Ardından, lamları 700 microliter bloklama dilüsyon tamponu ile her biri 10 dakika sürecek şekilde üç kez yıkayın.Slaytları çerçevelerden çıkarın, ardından onları metal bir slayt rafına yerleştirin ve PBS içine daldırın. Oda sıcaklığında, orbital çalkalamalı olarak 20 dakika inkübe edin. Bir slayt rafını 15 saniye boyunca deiyonize su içeren bir kaba yerleştirin.Ardından rafı yeni bir su kabına yerleştirin ve 15 saniye daha inkübe edin. Lamları kurutmak için, lam rafını santrifüjdeki bir ELISA plak adaptörüne yerleştirin ve oda sıcaklığında, 220 ×g hızında beş dakika boyunca döndürün. Tarama aşamasına kadar lamları ışık geçirmeyen bir kutuda saklayın.Slaytları taramak için SI three ve SI five floresan sinyallerini tespit edebilen bir mikroarray tarayıcı kullanın. Yalnızca sekonder antikorlarla problanmış tam bir antijen kütüphanesi slaytını ön tarama yaparak optimal çoğaltıcı tüp veya PMT ayarlarını belirleyin. SI three kanalındaki insan IgG özelliklerinin ve SI five kanalındaki insan IGM özelliklerinin, genellikle 40.000 olan benzer bir medyan floresan yoğunluğu eksi arka plan (MFIB) değerine sahip olması için donanım düğmesine basarak kullanılan PMT değerlerini ayarlayın.Ardından, tarama düğmesine basarak deneysel lamları iki kanalda tarayın. Her taramadan sonra her iki kanaldaki lam görüntülerini kaydedin. Dosya düğmesini kullanarak, analiz edilecek lamı mikro array yazılımına yükleyin.Ardından, dizi düzenini ve dizi özelliklerinin kimliklerini içeren gen dizisi listesini veya GAL dosyasını yüklemek için dosya düğmesini kullanın. Dizinin özelliklerinin şablonla mümkün olduğunca yakın şekilde eşleşmesi için dizi şablonunu taranmış görüntünün üzerine yerleştirin. Tüm bloklardaki özellikleri şablonla hizalamak için hizala düğmesine basın.Yazılım daha sonra her bir antijen için arka plan çıkarılmış bir MFI değeri hesaplayacaktır. Son olarak, sonuçları bir metin dosyası olarak dışa aktarmak için dosya düğmesini kullanın ve verileri metin protokolüne göre analiz edin. Pozitif ve negatif kontrol lamlarını gösteren bu şekilde, negatif lam sadece sekonder antikorlarla probe edilmiş, pozitif kontrol lamı ise sistemik lupus eritematozus hastası bir kişiden alınan serumla probe edilmiştir.Burada belirtildiği gibi, riboP'ye karşı bilinen reaktiviteye sahip pozitif kontrol serumunun, tek zincirli DNA'ya karşı IgM antikorları ve riboP'ye karşı IgG antikorları içerdiği gösterilmiştir. Tüm serum dilüsyonlarında IgM ile lineer yanıtlar, IgG ile ise yaklaşık 30.000'lik bir arka plan çıkarılmış MFI değerine kadar lineer yanıtlar gözlemlenmiştir. Bu deneyde dizi, IgG'ye karşı bir IgM antikoru olan romatoid faktörü belgelenmiş, kriyoglobulinemik vaskülit hastasından alınan insan serumu ile sondalanmaktadır.Dizideki immobilize IgG'ye hastanın serumundaki IgM'nin bağlanması nedeniyle IgG özelliği sarı-yeşil renktedir. Yalnızca ikincil antikorlar kullanıldığında, dizi üzerine damlatılmış IgG'ye karşı herhangi bir IgM reaktivitesi görülmez. Burada gösterildiği üzere, dizi üzerine damlatılan fare IgM ve IgG'leri, sırasıyla yalnızca IgM ve IgG'ye yönelik anti-fare ikincil antikorlar ile tespit edilmektedir.Bu şekil, mikroarray analiz yazılımı kullanılarak taranmış bir dizi görüntüsü üzerine şablon ızgaranın hizalanmasını göstermektedir. Hizalama işlemi tamamlandıktan sonra, her bir özellik için arka plan çıkarılmış medyan floresans yoğunluğunu elde etmek amacıyla dizi özellikleri analiz edilebilir. İşleme hakim olunduğunda, antijen mikroarraylerinin problanması uygun şekilde yapıldığı takdirde dört saat içinde tamamlanabilir.Bu prosedürün ardından, antijen mikro dizileriyle elde edilen sonuçları doğrulamak için ELISA gibi diğer teknikler uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra; antijen mikro dizilerinin nasıl basılacağı, serum ile nasıl problanacağı ve bir tarayıcı ile nasıl taranacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. İnsan serumu ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken evrensel önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.

generation-two-color-antigen-microarrays-for-simultaneous-detection

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu videoda, bir serum örneğindeki çeşitli antikor izotiplerini aynı anda tespit etmek için farklı antijenlerle birleştirilmiş floresan manyetik boncuklar veya mikroküreler kullanan bir immünolojik test tekniği açıklanmaktadır. Test, bir enfeksiyon sırasında veya aşılama sonrası serokonversiyonun anlaşılmasında yardımcı olur.

Multianalit İmmünoboncuk Testi: İnsan Serum Numunesinde Çoklu Antikor Alt Tiplerinin Eşzamanlı Tespiti için Akış Tabanlı Bir İmmünoassay Tekniği

Bu videoda, influenza virüsü suşlarının antijenik alt tipleriyle basılmış bir mikrodizi slaytı kullanarak birden fazla insan serum örneğinde antikor izotiplerini tespit etme sürecini gösteriyoruz.

Viral Antijene Karşı Serumdaki Antikor İzotiplerini Tespit Etmek için Viral Antijen Mikroarray Testi

Bu video, fare serumunda dolaşımdaki anti-glikan antikorlarını analiz etmek için basılı glikan dizisi teknolojisini göstermektedir. Serumdaki antikorlar, çip üzerindeki spesifik glikanlarla etkileşime girer ve bu, immün boyama ve ardından floresan taraması ile doğrulanır.

Basılı Glikan Dizisi ile Dolaşımdaki Anti-Glikan Antikorlarının Saptanması

Video, çapraz reaktivite içermeyen çoğullanmış sandviç immünolojik testler için çıtçıtlı çip teknolojisinin uygulanmasını göstermektedir. Her biri farklı reaktifler içeren iki mikrodizi slaytını koparmanın basit eylemi, çapraz kontaminasyon olmadan reaktif transferini sağlar ve sandviç immünolojik test kullanılarak birden fazla proteinin tespit edilmesine yardımcı olur.

Çapraz Reaktivitesiz Çoklanmış Sandviç İmmünoassay için Bir Snap Chip Teknolojisi

Biz sadece iki slayt şaklatarak çoğaltılmış sandviç çapraz-reactivity ücretsiz uzun gerçekleştirmek için bir ek çip teknolojisi göstermek. Bir ek aparatı reaktifler Mikroarray Mikroarray güvenilir bir şekilde aktarmak için kullanılır. Ek çip olmadan Çapraz bulaşma farklı reaktifler colocalization gerektiren herhangi bir biyokimyasal reaksiyonlar için kullanılabilir.

Çip için çapraz-reactivity ücretsiz ve gözcü-Alerjik çoğaltılmış sandviç uzun snap

Burada, biz electrochemiluminescence (ECL) deneyleri kullanarak insan adacık otoantikorlar algılamak için yöntemler sundu. Tip 1 diyabet, tahmin etmek için kullanılan iletişim kuralı, üzerine otoantikorlar diğer otoimmün hastalıklar için algılamak için genişletilebilir.

Electrochemiluminescence deneyleri için insan adacık otoantikorlar

Biz farklı virüs suşları 250 üzerinde antijenler karşı birden fazla antikor izotürler için aynı anda prob serum nitroselüloz kaplı slaytlar üzerine baskı grip antijenleri tarafından inşa edilen bir protein mikroarray kullanmak için bir protokol sunuyoruz, böylece virüs alt türleri arasında serum antikorları genişliği ölçümü izin.

Virüs subtypes arasında serum antikorların genişliğini ölçmek için bir Influenza antijen microarray kullanımı

7 otoantikor testini bir araya getiren basit bir çoklanmış ECL testi modelliyoruz. Tahlil, çölyak hastalığı, otoimmün tiroid hastalığı ve otoimmün poliglandüler sendrom 1 dahil olmak üzere T1D ve diğer birçok otoimmün hastalığı aynı anda tarayabilir.

Yüksek Verimli Bir Elektrokemilüminesans 7-Plex Testi Aynı Anda Tip 1 Diyabet ve Çoklu Otoimmün Hastalıklar İçin Tarama

SARS-CoV-2 için nötralize IgG ve IgM antikorlarını aynı anda ölçebilen multipleks serolojik ve antikor nötralizasyon tahlillerinin geliştirilmesi için iki muhabirli okuma sağlayan boncuk bazlı çok katlı tahliller için bir akış analiz sistemi kullanılmıştır.

Çok Katlı Boncuk Tabanlı Akış Analiz Sistemi için Hızlı, Çok Katlı Çift Muhabir IgG ve IgM SARS-CoV-2 Nötralizasyon Tahlil

Avrupa ve Kuzey Amerika'da Lyme borreliosis'e neden olan farklı Borrelia türlerinin çoklu antijenlerine karşı ortaya çıkan IgG ve IgM için serum örneklerini aynı anda değerlendiren boncuk bazlı bir multipleks immünolojik test geliştirmek için üç kanallı bir çift raportör floresan akış analiz sistemi kullanıldı.

Çoğullanmış Serolojik Testte Farklı Antikor Sınıflarının Eş Zamanlı Tespiti

Öğrenin, insan ve fare serumlarından IgG ve IgM otoantikorlarının eşzamanlı tespiti için özelleştirilebilir antijen mikrodizileri oluşturmayı. Bu yüksek verimli yöntem, otoimmün hastalıklarla ilişkili antikorları hızla taramanıza olanak tanır.

IgG ve IgM Antikorlarının Eşzamanlı Algılama için İki Renkli Antijen Mikroarray'ler Üretimi

Daha fazla video keşfet