Yüzey koloniler Mikrobiyal Populasyonlarında Mekansal Ayrışma İzleme

Bu prosedürün genel amacı, floresan mikroskobu kullanarak oğul verme, kayma veya biyofilm oluşumu sırasında mikrobiyal suşların uzamsal dağılımını gözlemlemektir. Bu yöntem, mekansal ayrışmanın mikrobiyal etkileşimi nasıl etkilediği gibi sosyal mikrobiyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, mikrobiyal suşların uygunluğunun ve mekansal dağılımının mikroskobik teknikler ve alt segment görüntü analizi kullanılarak kolayca değerlendirilebilmesidir.

Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir doktora araştırmacısı olan Theresa Holscher olacak. Deneyden bir gün önce, bir kültür tüpüne üç mililitre LB besiyeri ekleyin ve bir dondurucu B.subtilis stoğundan aşılayın. Bu aşılamayı, ilgilenilen her suş için ayrı bir tüp ile tekrarlayın.

Tüpleri gece boyunca 37 santigrat derecede yatay bir çalkalama inkübatörüne yerleştirin. Sürüleme ve kayma deneyleri için plakalar hazırlamak için, 20 mililitre temperlenmiş LB ortamını 90 milimetrelik bir polistiren Petri kabına dökün. Kabı hemen kapatın ve en az bir saat soğuması için steril davlumbazın bir tarafına yerleştirin.

Daha sonra, 90 milimetrelik bir Petri kabına 25 mililitre agar iki kez SG ortamı dökerek koloni biyofilm deneyleri için plakalar hazırlayın. Plakaları hemen kapatın ve en az bir saat boyunca dört veya daha az yığın halinde soğumaya bırakın. Başlamak için, LB agar kaynama ve kayar plakaları laminer akış başlığına yerleştirin ve kapakları çıkarın.

Plakaların 20 dakika kurumasını bekleyin. Bu deneylerde plakaların nemi kritiktir. Fazla nem bakterilerin yüzmesine izin verirken, uzun süreli kurutma kaynamayı ve kaymayı önler.

Benzer şekilde, koloni biyofilm yapısı ortamın kuruluğuna bağlıdır. Bir spektrofotometre kullanarak, gece starter kültürlerinin optik yoğunluklarını 600 nanometrede belirleyin. 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünde, toplam 200 mikrolitre için yeşil ve kırmızı floresan protein üreten suşların yoğunluğu normalleştirilmiş miktarlarını karıştırın.

Tüpü üç saniye boyunca girdaplayın. Bir mikro pipet kullanarak, karışık kültürün iki mikrolitresini laminer akış başlığındaki önceden kurutulmuş 90 milimetrelik bir LB agar plakasının ortasına yerleştirin. Plakayı 10 dakika kurumaya bırakın.

Son olarak, agarın yüzeyinde yoğuşma birikmesini önlemek için plakaları 37 santigrat derecede dik konumda inkübe edin. İlk olarak, iki kez SG agar plakalarını kuruması için 15 dakika laminer akış başlığına yerleştirin. Daha sonra, 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne yeşil ve kırmızı floresan protein üreten biyofilm suşu, B.subtilis 168 başlangıç kültürlerinin her birine 100 mikrolitre ekleyin.

Tüpü üç saniye boyunca girdaplayın. 100 mikrolitre LB ortamı içeren tüpler hazırlayın ve karışık kültürü kullanarak 10 kat seyreltme serisi aşı oluşturun. Bir mikro pipet kullanarak, seyreltilmemiş karışık kültürün iki mikrolitresini iki kez SG agar plakasına yerleştirin.

Bunu, tek bir tabakta altı ila dokuz koloninin yetiştirilmesine izin vermek için eşit mesafelerde aralık noktaları olan 10 ila bir, 10 ila iki, 10 ila üç ve 10 ila dört seyreltme için aşılarla tekrarlayın. Plakaları bir ila üç gün boyunca 30 santigrat derecede dik olarak inkübe edin. Başlamak için, plakaları bir floresan tespit mikroskobunun görüntüleme platformuna yerleştirin.

Kayma ve sürü oluşturma deneyleri için, radyal koloni genişlemesinin ölçülmesine izin vermek için Petri kabının ortası olan aşılamanın kaynağını görünür alanın köşesine ayarlayın. Büyütmeyi, 90 milimetrelik plakanın mümkün olan en büyük bölgesinin görüntülenmesine izin veren en yüksek çözünürlüğe ayarlayın. Floresan sinyalinin gücüne bağlı olarak maruz kalma süresini uygun şekilde ayarlayın.

Biyofilm analizi için, ilgilenilen bir koloniyi görüş alanının merkezine yerleştirin. Büyütmeyi, tüm koloninin görüntülenmesine izin veren en yüksek çözünürlüğe ayarlayın. Koloniler artık ölçüm ve analiz için hazırdır.

Son olarak, verileri metin protokolünde açıklandığı gibi analiz edin. Bu şekil, tipik iki suşla birlikte aşılanmış bir Bacillus subtilis kolonisinin büyümesini göstermektedir. Kamçılı bağımlı bir kolektif yüzey hareketi olan sürü, oldukça karışık bir popülasyonla sonuçlanır.

Bu hızlandırılmış videoda, ilk aşılayıcı plaka yayılımının ortasına yerleştirildi. İnce tabaka kaynaması açıkça gözlenir ve koloni geliştikçe, iki kırmızı ve yeşil floresan suş karışık ve üst üste binmiş gibi görünür. Tersine, kayma davranışının görüntüleri, farklı şekilde etiketlenmiş floresan suşlara karşılık gelen tanımlanmış büyüme sektörlerini gösterir.

Bu video, suşların işlevsel bir flagella'dan yoksun olduğu, kayan bir ko-inoküle edilmiş koloninin büyümesini göstermektedir. Bu koloniler, salgılanan ekzo-polisakkarit, hidrofobin ve yüzey aktif maddenin bir kombinasyonunu kullanarak hala yayılabilir. Ortaya çıkan koloniler, sürü suşuna kıyasla farklı mekansal büyüme çeşitliliği sergiler.

Hücre yoğunluklarından başlayarak biyofilm üreten koloniler, ortaya çıkan kolonilerin mekansal çeşitliliğini büyük ölçüde etkiledi. Karışık popülasyonların yüksek hücre yoğunluğu ile başlatılan koloniler, çok az mekansal çeşitlilik gösterdi veya hiç göstermedi. Buna karşılık, başlangıçta hücre yoğunluğu düşük olduğunda, berrak yeşil ve kırmızı floresan sektörler tespit edilebilir.

Bu videoyu izledikten sonra, mikrobiyal kolonilerde floresan etiketli suşların nispi bolluklarının nasıl belirleneceğini, mekansal ayrışmanın nasıl inceleneceğini ve kurucu hücre yoğunluğunun etkisinin nasıl inceleneceğini iyi anlamalısınız.