Yüzey koloniler Mikrobiyal Populasyonlarında Mekansal Ayrışma İzleme

Bu prosedürün genel amacı, floresan mikroskopi kullanarak sürüm (swarming), kayma (sliding) veya biyofilm oluşumu sırasında mikrobiyal suşların mekansal dağılımını gözlemlemektir. Bu yöntem, mekansal ayrışmanın mikrobiyal etkileşimi nasıl etkilediği gibi sosyal mikrobiyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, mikrobiyal suşların uygunluğunun ve mekansal dağılımının mikroskobik teknikler ve alt segment görüntü analizi kullanılarak kolayca değerlendirilebilmesidir.

Prosedürü, laboratuvarımdan PhD araştırmacısı Theresa Holscher uygulamalı olarak gösterecektir. Deneyden bir gün önce, bir kültür tüpüne üç mililitre LB medium ekleyin ve bunu bir B.subtilis dondurucu stoğu ile inoküle edin. Bu inokülasyon işlemini, ilgilenilen her bir suş için ayrı bir tüp kullanarak tekrarlayın.

Tüpleri 37 °C'de gece boyunca yatay sallamalı inkübatöre yerleştirin. Sürüme (swarming) ve kayma (sliding) deneyleri için plakları hazırlamak üzere, 90 mm'lik polistiren Petri kabına 20 mL ılıtılmış LB ortamı dökün. Kabı hemen kapatın ve soğuması için en az bir saat boyunca steril kabinin bir kenarına bırakın.

Ardından, 90 milimetrelik bir Petri kabına 25 mililitre iki kat SG besiyerli agar dökerek koloni biyofilm deneyleri için plakları hazırlayın. Plakların kapaklarını hemen kapatın ve soğumaları için en fazla dörderli yığınlar halinde en az bir saat bekletin. Başlamak için, LB agar sürülme (swarming) ve kayma (sliding) plaklarını laminar akışlı kabine yerleştirin ve kapaklarını çıkarın.

Plakaların 20 dakika boyunca kurumasına izin verin. Bu deneylerde plakaların nem oranı kritiktir. Aşırı nem bakterilerin yüzmesine olanak tanırken, uzun süreli kurutma sürünme ve kaymayı önler.

Benzer şekilde, koloni biyofilm yapısı ortamın kuruluğuna bağlıdır. Bir spektrofotometre kullanarak, gece boyu inkübe edilmiş başlangıç kültürlerinin optik yoğunluklarını 600 nanometrede belirleyin. 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünde, toplam 200 mikrolitre olacak şekilde, yoğunlukları normalize edilmiş yeşil ve kırmızı floresan protein üreten suşları karıştırın.

Tüpü üç saniye boyunca vorteksleyin. Laminar akışlı kabinde, bir mikro-pipet kullanarak, karışık kültürden iki µL'yi önceden kurutulmuş 90 mm'lik LB agar plakasının merkezine damlatın. Plakayı kuruması için 10 dakika bekletin.

Son olarak, yoğuşmanın agar yüzeyinde toplanmasını önlemek için plakları dik konumda 37 °C'de inkübe edin. İlk olarak, iki kat SG agar plaklarını kurumaları için 15 dakika boyunca laminar akışlı kabine yerleştirin. Ardından, yeşil ve kırmızı floresan protein üreten biyofilm suşları olan B.subtilis 168 başlangıç kültürlerinden 100 µL'şer miktarda 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne ekleyin.

Tüpü üç saniye boyunca vorteksleyin. 100 µL LB medium içeren tüpler hazırlayın ve karışık kültürü kullanarak inokülatların 10 katlık dilüsyon serisini oluşturun. Bir mikro-pipet kullanarak, seyreltilmemiş karışık kültürden iki µL'yi iki kat SG agar plakasına damlatın.

Bu işlemi 10⁻¹, 10⁻², 10⁻³ ve 10⁻⁴ dilüsyonlar için hazırlanan inokülatlarla, tek bir plak üzerinde altı ila dokuz koloni büyümesine izin verecek şekilde lekeleri eşit mesafelerle yerleştirerek tekrarlayın. Plakları 30 °C'de, dik konumda bir ila üç gün boyunca inkübe edin. Başlamak için plakları bir floresan dedektörlü mikroskobun görüntüleme platformuna yerleştirin.

Kayma ve sürünme deneyleri için, radyal koloni genişlemesinin ölçülebilmesine olanak sağlamak amacıyla, inokülasyon başlangıç noktasını (Petri kabının ortasını) görünür alanın köşesine ayarlayın. Büyütmeyi, 90 milimetrelik plağın mümkün olan en geniş bölgesinin görüntülenmesine izin veren en yüksek çözünürlüğe ayarlayın. Pozlama süresini, floresan sinyalinin gücüne bağlı olarak uygun şekilde ayarlayın.

Biyofilm analizi için, ilgilenilen bir koloniyi görüş alanının merkezine yerleştirin. Büyütmeyi, tüm koloninin görülmesine izin veren en yüksek çözünürlüğe ayarlayın. Koloniler artık ölçüm ve analiz için hazırdır.

Son olarak, verileri metin protokolünde açıklandığı şekilde analiz edin. Bu şekil, iki suşun birlikte inoküle edildiği tipik bir Bacillus subtilis kolonisinin büyümesini göstermektedir. Kamçı bağımlı kolektif bir yüzey hareketi olan swarming, yüksek derecede karışmış bir popülasyonla sonuçlanır.

Bu hızlandırılmış videoda, başlangıç inokülantı plak yayılımının merkezine yerleştirilmiştir. İnce tabaka sürüme (swarming) davranışının açıkça gözlemlendiği ve koloni geliştikçe, iki kırmızı ve yeşil floresan suşun karışmış ve üst üste binmiş şekilde göründüğü görülmektedir. Buna karşılık, kayma (sliding) davranışına ait görüntüler, farklı şekilde etiketlenmiş floresan suşlara karşılık gelen belirgin büyüme sektörlerini göstermektedir.

Bu video, işlevsel kamçıları olmayan suşların birlikte inoküle edildiği bir kayan koloninin büyümesini göstermektedir. Bu koloniler, salgılanan ekzo-polisakkarit, hidrofobin ve surfaktin kombinasyonunu kullanarak hala yayılma yeteneğine sahiptir. Ortaya çıkan koloniler, sürüş yapan (swarming) suşa kıyasla belirgin bir mekansal büyüme düzeni sergiler.

Biyofilm üreten kolonilerin başlangıç hücre yoğunlukları, ortaya çıkan kolonilerin mekansal ayrışmasını önemli ölçüde etkilemiştir. Karışık popülasyonların yüksek hücre yoğunluğuyla başlatılan koloniler, düşük düzeyde mekansal ayrışma göstermiş veya hiç göstermemiştir. Buna karşılık, başlangıçtaki hücre yoğunluğu düşük olduğunda, belirgin yeşil ve kırmızı floresan sektörler tespit edilebilmiştir.

Bu videoyu izledikten sonra, mikrobiyal kolonilerdeki floresan işaretli suşların bağıl bolluklarının nasıl belirleneceği, mekansal ayrışmanın nasıl inceleneceği ve kurucu hücre yoğunluğunun etkisinin nasıl çalışılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmanız gerekir.