Floresan Etiketli Suşların Cocultivation'ı ile Bakteri Hücre Popülasyonunda İntraspecies Rekabetini İzleme

Bu yöntem, zaman içinde bir bakteri hücre popülasyonundaki hızlı klonal genişlemeyi ve faydalı ve zararlı mutasyonların ortadan kaldırılmasını izlemek için floresan olarak işaretlenmiş bacillus sutilis'in birlikte yetiştirilmesini kullanır. İlk olarak, yarışma deneyi için bakterilerin ön kültürlerini hazırlayın. Floresan etiketli suşların eşit miktarlarını karıştırın ve bakterileri farklı beslenme koşulları altında birlikte yetiştirin.

Daha sonra numuneleri farklı zaman noktalarında toplayın, uygun şekilde seyreltin ve hücreleri agar plakaları üzerinde çoğaltın. Şimdi hayatta kalan suşları stereo floresan mikroskobu ile görselleştirin ve sayın. Sonuç olarak, sonuçlar, sayılan kolonilerin tam sayısına göre hayatta kalan bakterilerin yüzdesini belirleyebilir.

Tür içi rekabetin izlenmesinden farklı olarak, suş etiketlemesi için farklı antibiyotik yeniden kasetleri kullanmak. Bu yöntemde, floresan etiketli rakip suşlar neredeyse tamamen izotoniktir ve aynı AGA plakaları üzerinde demleme yeteneğine sahiptir. Ön prosedür, laboratuvarımda doktora öğrencisi olan Lorena tarafından sunulacak, dört mililitre LB ortamını eksi 80 santigrat dereceden bir mikrolitre bakteri ile aşılayacak, kriyo stokları ve ön kültürleri gece boyunca 28 santigrat derecede ve 220 RPM'de büyütecek, 0.1 mililitre kültürü 1.5 mililitrelik bir damarda 0.9 mililitre LB ortamına seyreltecek, ve optik yoğunluğu belirleyin.

Daha sonra yarışma deneyleri için karışık hücre popülasyonları elde etmek için, 20 mililitre CGLC ve CGLC içeren 100 mililitrelik çalkalama şişelerini aşılayın. Bire bir oranında minimal ortam, kültürlerin 10 mililitresini 15 mililitrelik plastik tüplere aktarın. Hücreleri 4.000 kez yerçekiminde 10 dakika santrifüjleme ile hasat edin ve süpernatanı atın.

Daha sonra hücreleri 0.5 mililitre taze LB ortamında yeniden süspanse edin ve hücreleri steril 1.5 mililitrelik bir reaksiyon kabına aktarın, 0.5 mililitre% 50 steril gliserol ekleyin. Süspansiyonu sıkı bir girdaplama ile karıştırın ve numuneleri eksi 80 santigrat derece dondurucuda saklayın. Bir sonraki kültür, çalkalama şişelerinde kalan bakterilerdir.

Floranın foto-ağartılmasını önlemek için çalkalama şişelerini karanlıkta tutun, yedi saat ve 24 saatlik büyümeden sonra kültürlerin 0,1 mililitre örneğini zorlayın, numunelerin bir ila 10 seyreltilmesinin optik yoğunluğunu ölçün ve not edin, eksi 80 santigrat derecede saklamak için numunelerin kriyo stoklarını yapın. Tüm numuneleri topladıktan sonra, kriyo stoklarını çözün ve hücreleri her bir gerinim plakası için% 0.9'luk bir tuzlu su çözeltisi içinde seyreltin. 0.1 mililitre 10 ila negatif beşinci seyreltme bir SP orta agar plakası üzerinde ve hücreleri steril bir cam pipet kullanarak dağıtın.

Plakaları gece boyunca karanlıkta 37 santigrat derecede inkübe edin, ta ki siyah bir kalemle tek koloniler ortaya çıkana kadar. Stereo floresan mikroskobu altında hayatta kalanları sayarken daha iyi bir yönlendirme için agar plakasının altını dört parçaya bölün. Şimdi, plakayı mikroskobun altına baş aşağı yerleştirin ve soğuk ışık kaynağını kullanarak kolonileri odak noktasına getirin.

Koloniler odaklandıktan sonra, CFP Flora four için uygun filtre setine geçin. CFP etiketli suşun hayatta kalan hücrelerini görselleştirmek için, kolonileri bir kalemle etiketleyerek bu suştan kurtulanları sayın. Ve numarayı not edin.

Etiketleri etanol ile çıkarın. Ardından YFP filtre setine geçin. YFP etiketli suşun hayatta kalan hücrelerini görselleştirmek için.

Kolonileri bir kalemle etiketleyerek hayatta kalanları tekrar sayın. Ve numarayı not edin. CFP filtre seti ve YFP filtre seti ile çekilmiş resimleri tek bir noktadan açın.

Ortamdan gelen arka plan floresansını azaltmak için kontrastı ve parlaklığı optimize edin. Resimlerden birine gidin ve tümünü seçin. Resmi kopyalayın ve diğer resmin üzerine yapıştırın.

Katmanlar menüsünde daha açık renk seçeneğini seçerek resimleri birleştirin. Bu deneyde, iki BCI suşundan oluşan bir hücre popülasyonu, agar plakaları üzerine uygun seyreltme kaplayarak farklı nitrojen kaynaklarının büyüme üzerindeki etkisini değerlendirmek için Fluor CFP ve YFP ile etiketlendi. Bir hücre popülasyonunun zaman içindeki klonal bileşimi, sarı ve mavi floresan kolonilerinin sayılmasıyla kesin olarak belirlenebilir.

Glutamat dehidrojenaz enzim aktivitesi, ekzojen glutamat mevcudiyetine bağlı olarak otus'un uygunluğunu güçlü bir şekilde etkiler. Ekzojen glutamatın yokluğunda, yüksek seviyeli GDH aktivitesi bakteriler için dezavantajlıdır, çünkü kaya G ve iyi B enzimleri anabolizmada ihtiyaç duyulan glutamatı bozar. Buna karşılık, eksojen glutamat mevcut olduğunda iki fonksiyonel gdh'nin sentezi bakteriler için avantajlıdır, çünkü G'ye ek olarak glikoz glutamat bir karbon kaynağı olarak kullanılır.

Bir kalıp anahtarı deneyinde de benzer sonuçlar elde edildi. Yine, yüksek düzeyde GDH aktivitesine sahip bakteriler, glutamat içermeyen büyüme ortamında GDH aktivitesi azalmış hücrelerle rekabet etti. Buna karşılık, sadece bir aktif GDH sentezleyen bakteriler kültürden elimine edildi.

Ortam glutamat ile desteklendiğinde, karışık hücre popülasyonunun ilk bileşimi zaman içinde neredeyse sabit kalmıştır. Fluor'dan bağımsız olarak birlikte alınır. Flora Force'un kullanımı, bir bakteri hücresi popülasyonunda tür içi rekabeti izlemek için güçlü bir araçtır Rakip güçlü yönleri oluşturulduktan sonra.

Bu teknik, uygun şekilde uygulandığı takdirde beş gün içinde yapılabilir.