Bir Mikro Kuyruklu Dizi Platformunda Mikrobik Topluluk Geliştirmenin Montajı ve Takibi

Bu yöntemin genel amacı, silikon mikro kuyu dizileri kullanarak sınırlı ortamlardaki çok üyeli mikrobiyal toplulukların yüksek verimli paralel analizini gerçekleştirmektir. Bu tekniğin temel avantajı; endüstri, tıp ve çevre için önemli olan, hassas şekilde lokalize edilmiş mikrobiyal etkileşimlerin yüksek verimli ve oldukça paralel bir şekilde taranmasına olanak tanımasıdır. Bu yöntem, biyomedikal ve mikrobiyal ekoloji alanlarındaki; ince ölçeklerde doğal olarak bulunan mekansal kısıtlamaların, topluluk gelişiminin deterministik ve stokastik parametrelerini nasıl yönlendirdiği ve bunların mikrobiyal üye bolluğu ile organizasyonu üzerindeki temel etkilerinin neler olduğu gibi kilit soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Mikro kuyucuk dizilerinin hazırlanmasıyla başlayın. İlk olarak, birden fazla dizinin basıldığı silikon waferlardan, elmas kalem kullanarak tekil mikro kuyucuk dizisi çipleri kesin. Her bir tekil çip, üç farklı aralık yoğunluğunda, çapları 5 ile 100 mikron arasında değişen kuyucuklardan oluşan alt diziler içerir.

Her bir çipte, kuyucukların tam motifi ayrıca dört kez tekrarlanır. Ardından, bir pipet uç kutusu ve PBS emdirilmiş bir mendil kullanarak nemlendirilmiş bir hazne hazırlayın. Daha sonra her bir çipe 150 µL BSA çözeltisi damlatın ve çipleri kutu içerisinde oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin.

Bu sırada bakterileri hazırlayın. Bir kültürü santrifüjle çöktürün ve yüzde iki gliserol içeren 500 µL taze R2A besiyerinde yeniden süspanse edin. Ardından, kültür yoğunluğunu 600 nm'de ölçün ve konsantrasyonu 0.02 optik yoğunluğa ayarlayın.

Çip inkübasyonundan sonra, BSA çözeltisini uzaklaştırın ve çipleri üç kez PBS ile durulayın. Durulama işlemlerinin ardından çipleri azot gazı ile kurutun ve nemlendirilmiş hazneye geri yerleştirin. Ardından, her bir kuru çipe 150 µL kültür süspansiyonu ekleyin ve bakterilerin kuyucuklara tutunması için zaman tanımanız, ancak olası herhangi bir kontaminanın hücre bölünmesini yavaşlatmanız amacıyla çipleri dört °C'de bir saat boyunca inkübe edin.

Görüntüleme için bir çip hazırlamak için, önce her çip için agaroz kaplı bir kapatma lamı hazırlayın. Küçük bir hacimde agaroz sıvılaştırın; her bir kapatma lamı için yaklaşık beş mililitre gereklidir. Ardından, bir kapatma lamının bir yüzünü etanol ile yıkayın ve yıkanan yüzü yukarı bakacak şekilde bir lamın merkezine yerleştirin.

Ardından, lamelin uzun kenarları boyunca iki adet bir milimetre kalınlığındaki PDMS ara parçayı yerleştirin ve lamelin bir milimetresi lamet dışına taşacak şekilde lameli kaydırın. Şimdi, lameli tamamen kaplayacak kadar agarozu lamelin üzerine dökün. Daha sonra, agarozu tekdüze bir kalınlığa getirmek için ikinci bir cam lamet kullanın.

Bu tür birkaç lam düzeneğini paralel olarak hazırlayın. Agaroz katılaşmaya başladığında, düzenekleri dört santigrat dereceye aktarın. 15 dakikalık soğutmanın ardından, lam örtme camlarının etrafındaki fazla agarozu kesin.

Ardından, düzenekleri petri kaplarına yerleştirin ve dört derece Celsius'ta saklayın. Çipler bakterilerle inkübe edildikten sonra, her bir çipi sırayla 10 saniye boyunca ultra saf suya daldırın. Daha sonra, sıvının çoğu süzülene kadar ıslak çipleri bir mendil üzerine kenarları dik gelecek şekilde yerleştirin.

Şimdi, kuyucuklara yerleşmeyen bakterileri uzaklaştırın. Silikon çip uzunluğunda bir bant parçası kesin ve bunu silikon üzerindeki parilen kaplamaya yapıştırın. Ardından, parilen kaplamayı kaldırmak için bandı soyun ve çipi hemen ters çevirmeye hazırlanın.

Şimdi, mikro kuyucuklar agarozla temas edecek şekilde çipi bir lam düzeneğinin üzerine yerleştirin. Agarozla temas ettikten sonra çipi hareket ettirmemeye veya kaydırmamaya çok dikkat edin. Ardından, tüm düzeneği bir sahne üstü çevresel kontrol odacığının lam tutucusuna aktarın ve önümüzdeki 24 saat boyunca istenilen aralıklarla ve 10x büyütmede zaman ayarlı (time-lapse) görüntüler edinin.

Görüntü yığınlarını geleneksel, ücretsiz olarak erişilebilen yazılımları kullanarak işleyin. İlk olarak, görüntü dizisini içe aktarın. Ortalama alma işlemi için düzeltme veya karanlık alan görüntülerini yükleyin.

Ardından bir arka plan çıkarma işlemi gerçekleştirin. 135 piksel gibi bir yarıçap değeri girin ve kayan paraboloid seçeneğini belirleyin. Sonra, iki görüntüyü seçip çıkarma işlemini kullanarak ortalama karanlık alan görüntüsünü ortalama aydınlatma alanı görüntüsünden çıkarın.

Şimdi, aşağıdaki şekilde bir aydınlatma düzeltmesi uygulayın. İşlemi bölme (divide) olarak ayarlayın, i1'i kuyucuk görüntüsüne, i2'yi düzeltme görüntüsüne, k1'i düzeltme görüntüsü ortalamasına ve k2'yi sıfıra ayarlayın. Ardından Yeni Pencere Oluştur (Create New Window) seçeneğine tıklayın.

Mikro kuyucuklardaki bakteriyel büyümeyi nicelendirmek için, öncelikle mikro dizi eklentisiyle ilgilenilen bölgeleri seçin. Harita menüsünde, ızgarayı sıfırla seçeneğine tıklayın ve satırları, sütunları ve kuyucuk çaplarını belirtin. Ardından ROI şekil menüsünden daireyi seçin.

ROI dizisini görüntüye göre ayarlamak için, ALT veya ALT+SHIFT tuşuna basıp fareyle sol üstteki ROI'yi seçerek ROI dizisi hareket ettirilebilir. ROI'leri yeniden boyutlandırmak için, ROI dizisinin sağ alt köşesini seçerken shift tuşuna basın. ROI'ler arasındaki boşluğu ayarlamak için, dizinin üst veya alt kenarını sürüklerken shift tuşuna basın.

ROI dizisi görüntüdeki kuyucuklara oturduğunda, Measure RT seçeneğine tıklayın. Ardından, her görüntü veya zaman noktası için tüm ölçümleri içeren bir tablo oluşturulacaktır ve bu tablo analiz için bir hesap çizelgesine kopyalanabilecektir. İki Pseudomonas aeruginosa suşunun büyümesi karşılaştırılmıştır. Suşlardan biri, tip altı salgılarla ilişkili toksik efektör proteinleri sürekli olarak eksprese etmektedir.

Diğeri ise fonksiyon kaybı nedeniyle tip altı patogenezine karşı duyarlıdır. Her ikisi de farklı bir floresan protein eksprese eder. Ko-kültürler boylamsal olarak ve farklı kuyucuk boyutlarında incelenmiştir.

Bakteriler hem tek tek hem de ko-kültür olarakle kültüre edildi. 20 saatlik büyüme, 30 dakikalık aralıklarla görüntülendi. Görüntüleme verileri üzerinde yazılımsal düzeltmeler yapıldıktan sonra, kantitatif büyüme yörüngeleri çizildi.

Ko-kültürde veriler, büyümede çok büyük bir değişime işaret etmemektedir. Analizi ilerletmek için her bir trajektori; maksimum sinyal, maksimum hız ve gecikme süresi olmak üzere üç parametreli modifiye edilmiş bir lojistik fonksiyona uydurulmuştur. Bu analiz, bu türlerin ko-kültürünün genel büyümeleri üzerinde ihmal edilebilir bir etkiye sahip olduğunu ve büyüme eğrilerinde görülen değişkenliğin büyük olasılıkla çevresel faktörlerden kaynaklandığını göstermektedir.

Bir kez ustalaşıldığında, kurulum düzgün şekilde gerçekleştirilirse sadece birkaç saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü uygularken, çip düzeneklerinde homojen burgu tabakaları elde etmek için nihai hücre OD değerlerini uygun şekilde ayarlayabilmek adına güçlü şekilde büyüyen hücrelere sahip olmak ve parylen soyma adımı sırasında dikkatli olmak önemlidir. Bu prosedürün ardından, her bir topluluk içindeki gen ekspresyonunun topluluk kompozisyonu ve organizasyonunun bir fonksiyonu olarak nasıl değiştiği gibi sorular, genetik materyal analizi ile yanıtlanabilir.

Pseudomonas aeruginosa ile çalışmanın potansiyel olarak tehlikeli olabileceğini unutmayın; bu prosedürü gerçekleştirirken eldiven, önlük, koruyucu gözlük gibi önlemler alınmalı ve uygun aseptik teknikler her zaman uygulanmalıdır.