Bir Mikro Kuyruklu Dizi Platformunda Mikrobik Topluluk Geliştirmenin Montajı ve Takibi
6 Haziran 2017
Mikrobiyal toplulukların gelişimi, çevresel mimari, üye bolluğu, özellikleri ve etkileşimleri de içeren faktörlerin bir kombinasyonuna bağlıdır. Bu protokol, femtolitör kuyularda bulunan binlerce topluluğun eşzamanlı olarak izlenebilmesi için sentetik, mikrofabrik bir ortam tanımlamakta olup niş boyut ve sınırlama gibi anahtar faktörler yaklaşık olarak belirlenebilmektedir.
Bu yöntemin genel amacı, silikon mikro kuyu dizileri kullanılarak kapalı ortamlarda çok üyeli mikrobiyal toplulukların yüksek verimli paralel analizidir. Bu tekniğin ana avantajı, endüstri, tıp ve çevre için önemli olan ince lokalize mikrobiyal etkileşimlerin yüksek verimli, yüksek düzeyde paralel bir şekilde taranmasına izin vermesidir. Bu yöntem, biyomedikal ve mikrobiyal ekoloji alanlarında, ince ölçeklerde var olan uzaysal kısıtlamaların, topluluk gelişiminin deterministik ve stokastik parametrelerini nasıl yönlendirdiği ve bunların mikrobiyal üye bolluğu ve organizasyonu üzerindeki temel etkileri gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.
Mikro kuyu dizilerini hazırlamakla başlayın. İlk olarak, bir elmas çizici kullanarak birden fazla diziyle basılmış silikon gofretlerden tek tek mikro kuyu dizisi çiplerini kesin. Her bir çip, üç farklı aralık yoğunluğunda beş ila 100 mikron arasında değişen çaplara sahip kuyucukların alt dizilerini içerir.
Her çipte, kuyuların tam motifi de dört kez tekrarlanır. Ardından, bir pipet ucu kutusu ve PBS ıslatılmış bir mendil kullanarak nemlendirilmiş bir oda yapın. Daha sonra her bir çipe 150 mikrolitrelik bir BSA çözeltisi damlatın ve cipsleri kutuda oda sıcaklığında bir saat inkübe edin.
Bu arada bakterileri hazırlayın. Bir kültürü döndürün ve yüzde iki gliserol içeren 500 mikrolitre taze R2A ortamında yeniden süspanse edin. Daha sonra kültür yoğunluğunu 600 nanometrede ölçün ve konsantrasyonu 0.02'lik bir optik yoğunluğa ayarlayın.
Çip inkübasyonundan sonra, BSA çözeltisini çıkarın ve talaşları PBS ile üç kez durulayın. Durulamalardan sonra, talaşları nitrojen gazı ile kurutun ve nemlendirilmiş odaya geri koyun. Daha sonra, her bir kuru çipe 150 mikrolitre kültür süspansiyonu ekleyin ve cipsleri dört santigrat derecede bir saat boyunca inkübe edin, böylece bakterilerin kuyucuklara yapışması için zaman kalır, ancak olası herhangi bir kontamine hücre bölünmesi yavaştır.
Görüntüleme için bir çip hazırlamak için, önce her çip için agaroz kaplı bir lamel yapın. Küçük bir hacimde agarozu sıvılaştırın, her kapak kayması için yaklaşık beş mililitre gerekir. Daha sonra, bir kapak astarının bir tarafını etanol ile yıkayın ve yıkanmış tarafı yukarı bakacak şekilde bir cam slayt üzerine ortalayın.
Ardından, bir milimetre kalınlığında iki PDMS ara parçasını kapak kaymasının uzun kenarları boyunca yerleştirin ve kapak kızağını, sürgüden bir milimetre sarkacak şekilde kaydırın. Şimdi, kapak fişinin üzerine tamamen kaplayacak kadar agaroz dökün. Ardından, agarozu eşit bir kalınlığa düzleştirmek için ikinci bir cam slayt kullanın.
Bu tür birkaç slayt düzeneğini paralel olarak hazırlayın. Agaroz katılaşmaya başladığında, düzenekleri dört santigrat dereceye aktarın. 15 dakika soğuduktan sonra, kapak kızaklarının etrafındaki fazla agarozu kesin.
Ardından, düzenekleri petri kaplarına koyun ve dört santigrat derecede saklayın. Cipsler bakterilerle kuluçkaya yatırıldıktan sonra, cipsleri her biri 10 saniye boyunca birer birer ultra saf suya batırın. Ardından, sıvının çoğu boşalana kadar ıslak talaşları bir mendilin üzerine kenarlarına koyun.
Şimdi, kuyulara yerleşmeyen bakterileri uzaklaştırın. Silikon çip uzunluğunda bir parça bant kesin ve silikon üzerindeki parilen kaplamaya yapıştırın. Ardından parilen kaplamayı çıkarmak için bandı soyun ve hemen çipi ters çevirmeye hazırlanın.
Şimdi, çipi, mikro kuyucuklar agaroz ile temas halinde olacak şekilde bir kayar düzenek üzerine yerleştirin. Çipi agaroz ile temas ettiğinde hareket ettirmemeye veya kaydırmamaya çok dikkat edin. Şimdi, tüm aksamı bir sahne üstü çevresel kontrol odasının sürgü tutucusuna aktarın ve sonraki 24 saat içinde istenen aralıkta ve 10x büyütme altında hızlandırılmış görüntüler elde edin.
Geleneksel, ücretsiz olarak kullanılabilen yazılımı kullanarak görüntü yığınlarını işleyin. İlk olarak, görüntü sırasını içe aktarın. Ortalama almak için düzeltme veya karanlık alan görüntülerini yükleyin.
Ardından bir arka plan çıkarma işlemi gerçekleştirin. 135 piksel gibi bir yarıçap değeri sağlayın ve kayan paraboloidi seçin. Ardından, iki görüntüyü seçip çıkarma işlemini kullanarak ortalama karanlık alan görüntüsünü ortalama aydınlatma alanı görüntüsünden kaldırın.
Şimdi, aşağıdaki gibi bir aydınlatma düzeltmesi uygulayın. Bölme işlemini ayarlayın, i1'i kuyu görüntüsüne ayarlayın, i2'yi düzeltme görüntüsüne ayarlayın, k1'i düzeltme görüntüsü ortalamasına ayarlayın ve k2'yi sıfıra ayarlayın. Ardından Yeni Pencere Oluştur'u tıklayın.
Mikro kuyucuklardaki bakteri üremesini ölçmek için, önce mikro dizi eklentisi ile ilgilenilen bölgeleri seçin. Harita menüsünde ızgarayı sıfırla'ya tıklayın ve satırları, sütunları ve kuyu çaplarını belirtin. Ardından ROI şekli menüsünden daireyi seçin.
ROI dizisini görüntüye göre ayarlamak için, ROI dizisi ALT veya ALT+SHIFT tuşlarına basılarak ve fareyle sol üst ROI seçilerek taşınabilir. ROI'leri yeniden boyutlandırmak için, ROI dizisinin sağ alt kısmını seçerken shift tuşuna basın. ROI'ler arasındaki boşluğu ayarlamak için, dizinin üst veya alt tarafını sürüklerken shift tuşuna basın.
ROI dizisi görüntünün kuyularına sığdığında, RT'yi Ölç'e tıklayın. Ardından, her görüntü veya zaman noktası için tüm ölçümleri içeren bir tablo çıktısı alınır ve analiz için bir elektronik tabloya kopyalanabilir. Pseudomonas aeruginosa'nın iki suşunun büyümesi karşılaştırıldı. Bir suş, tip altı sekresyonlarla ilişkili toksik efektör proteinleri yapısal olarak eksprese eder.
Diğeri ise fonksiyon kaybı nedeniyle tip altı patogeneze yatkındır. Her ikisi de farklı bir floresan proteini ifade eder. Ko-kültürler boylamsal olarak ve farklı kuyu boyutlarında incelenmiştir.
Bakteriler tek tek ve ko-kültür olarak kültürlendi. 30 dakikalık aralıklarla 20 saatlik büyüme görüntülendi. Görüntüleme verileri üzerinde yazılım düzeltmeleri yapıldıktan sonra, kantitatif büyüme yörüngeleri çizildi.
Ko-kültürde, veriler büyümede çok fazla bir değişiklik olduğunu göstermez. Analizi ilerletmek için, her yörünge, maksimum sinyal, maksimum hız ve gecikme süresi olmak üzere üç parametreli değiştirilmiş bir lojistik fonksiyona takıldı. Bu analiz, bu türlerin ortak kültürünün genel büyümeleri üzerinde ihmal edilebilir bir etkiye sahip olduğunu ve büyüme eğrilerinde görülen değişkenliklerinin büyük olasılıkla çevresel faktörlerden kaynaklandığını göstermektedir.
Bir kez ustalaştıktan sonra, düzgün bir şekilde gerçekleştirilirse kurulum sadece birkaç saat içinde gerçekleştirilebilir. Bu prosedürü denerken, çip düzeneklerinde tek tip burgu katmanlarına sahip olmak için nihai hücre OD değerlerini uygun şekilde ayarlamak ve parilen soyma adımı sırasında dikkatli olmak için sağlam bir şekilde büyüyen hücrelere sahip olmak önemlidir. Bu prosedürü takiben, her bir topluluk içindeki gen ekspresyonunun, topluluk bileşimi ve organizasyonunun bir fonksiyonu olarak nasıl değiştiği gibi sorular, genetik materyal analizi ile ele alınabilir.
Pseudomonas aeruginosa ile çalışmanın potansiyel olarak tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman eldiven, ceket, gözlük ve uygun aseptik teknikler gibi önlemlerin kullanılması gerektiğini unutmayın.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, sınırlı ortamlarda mikrobiyal toplulukların yüksek verimli analizi için bir yöntem sunar ve silikon mikro kuyu dizilerine dayanır. Bu, endüstri ve tıp dahil olmak üzere çeşitli alanlar için önemli olan mikrobiyal etkileşimlerin izlenmesini sağlar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Mikrobiyal Ekoloji
- Biyomedikal Araştırma
- Çevre Bilimi
Arka Plan
- Mikrobiyal toplulukları çevresel yapı ve üye etkileşimleri etkiler.
- Bu toplulukları anlamak, ekolojik ve biyomedikal sorular hakkında içgörüler sağlayabilir.
- Yüksek verimli yöntemler, karmaşık etkileşimleri analiz etmek için esastır.
- Bu çalışma, hassas izleme için mikro üretilmiş ortamlar kullanır.
Çalışmanın Amacı
- Sınırlı alanlarda çok üyeli mikrobiyal toplulukları analiz etmek.
- Uzaysal kısıtlamaların topluluk gelişimini nasıl etkilediğini araştırmak.
- Mikrobiyal üye bolluğu ve organizasyonu üzerindeki etkileri keşfetmek.
Kullanılan Yöntemler
- Silikon yongalardan mikro kuyu dizilerinin hazırlanması.
- Beşten 100 mikron arasında değişen kuyulara sahip diziler kullanılması.
- Yüksek verimli bir şekilde mikrobiyal etkileşimlerin taranması.
- Sınırlı ortamlarda topluluk dinamiklerinin paralel analizi.
Ana Sonuçlar
- Binlerce mikrobiyal topluluğu eşzamanlı olarak izleme yeteneğini gösterdi.
- Niş boyutu ve sınırlama tarafından etkilenen anahtar etkileşimleri belirledi.
- Topluluk gelişiminin deterministik ve stokastik parametreleri hakkında içgörüler sağladı.
- Bu yöntemin endüstri ve çevresel uygulamalar için önemini vurguladı.
Sonuçlar
- Bu yöntem, mikrobiyal etkileşimleri incelemek için yeni bir yaklaşım sunar.
- Sınırlı ortamlarda topluluk dinamiklerini anlamayı geliştirir.
- Gelecekteki araştırmalar bu bulgulara dayanarak ekolojik ve biyomedikal zorlukları ele alabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This microwell array platform enables high-throughput parallel analysis of microbial community development in confined environments, supporting mechanistic de-risking in early discovery by quantifying spatial and interaction effects on microbial growth. The method provides predictive confidence in target validation by revealing how fine-scale spatial constraints influence deterministic and stochastic parameters of community dynamics, directly informing translational biomarker and preclinical model relevance. Its scalability and reproducibility support enterprise R&D workflows in antimicrobial target screening and phenotypic screening applications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying how spatial confinement alters microbial member abundance and organization in co-culture systems.
- Operational Value: Enables functional target validation through longitudinal tracking of fluorescently labeled strains in defined microwell environments.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by measuring growth trajectories and interaction effects under controlled niche sizes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by standardizing microbial seeding in arrays with well diameters from 5 to 100 microns.
- Operational Value: Ensures assay reproducibility through BSA passivation, controlled incubation, and agarose-coated imaging substrates that minimize evaporation and drift.
- Scalability Value: Enables parallel analysis of thousands of communities, supporting platform reuse across antimicrobial and pathogenicity studies.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Connects discovery-phase interaction data to preclinical continuity by modeling how spatial constraints affect pathogenic outcomes in Pseudomonas aeruginosa co-cultures.
- Mechanistic De-risking: Quantifies negligible growth effects in co-culture, helping de-risk false positives in target validation screens.
- Predictive Confidence: Uses modified logistic fitting of growth curves to extract maximum signal, rate, and lag time for comparative strain analysis.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from hypothesis testing to lead identification, providing quantitative interaction data that informs go/no-go decisions in antimicrobial target programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by revealing how spatial constraints drive community development parameters in multi-member systems.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized chip preparation, bacterial adhesion at 4°C, and time-lapse fluorescence imaging at 30-minute intervals over 20 hours.
- Analytics: Generates quantitative growth trajectories via background subtraction, illumination correction, and ROI-based fluorescence measurement, enabling statistical comparison of conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical relevance by modeling Type VI secretion-dependent interactions in Pseudomonas aeruginosa, a pathogen with biomedical significance.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for screening microbial interactions across industry, medicine, and environmental applications due to its parallel throughput and confined-environment precision.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through quantification of microbial interaction effects in spatially constrained environments.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via controlled chip preparation, fluorescence labeling, and automated image analysis workflows.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by de-risking mechanistic ambiguity in early-stage antimicrobial target identification.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on quantitative interaction data from high-throughput community arrays.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microbiology, fluorescence microscopy, and image analysis software for ROI setup and quantitative measurement.
- Depends on silicon microfabrication infrastructure, agarose-coated slide assemblies, and environmental control chambers for stable 24-hour imaging.
- Necessitates cross-team standardization of bacterial preparation, OD adjustment, and parylene removal steps to ensure well-specific adhesion.
- Requires adaptation considerations when extending beyond Pseudomonas aeruginosa to other microbial models due to surface chemistry and growth variability.
- Practical limitations include the need for aseptic technique when handling Pseudomonas aeruginosa and potential well-to-well variability in sub-10 micron features.
