Yatay Gen Transferi Çalışmasında Metodolojisi Staphylococcus aureus

Bu prosedürün genel amacı, üç ana transfer yolunu ele alarak staphylococcus aureus'ta DNA'nın yatay iletimini incelemek için ayrıntılı bir metodoloji sağlamaktır. Konjugasyon, transdüksiyon ve doğal dönüşüm. Bu yöntem, insan patojeni staph aureus'ta antibiyotiğe dirençli genlerin yatay transferi ile ilgilidir.

Burada tanıtılan tekniklerin temel avantajı, yakın zamanda keşfedilen doğal genetik dönüşüm de dahil olmak üzere üç ana transfer modunu test edebilmemizdir. Prosedürü göstermek, laboratuvarımızdan bir doktora öğrencisi olan Le Thuy olacaktır. Deneye başlamak için, triptik soya suyunda donör ve alıcı bakteri için beş mililitre gece boyu kültür hazırlayın. Veya sırasıyla litre başına 32 miligram kloramfenikol içeren ve içermeyen TSB ortamı.

37 santigrat derecede çalkalama ile. Ertesi gün, gece boyunca kültürlerin optik yoğunluğunu taze TSB ortamı olan bir yoğunluğa ayarlayın. 0.5 mililitre donör kültürü ile 0.5 mililitre alıcı kültürü karıştırın.

Ve karışıma bir mililitre fosfat tamponlu salin veya PBS ekleyin. Daha sonra bir vakum pompası sistemi kullanarak, bakteri karışımını 0,45 mikrometrelik bir filtre membranına aktarın. Filtre membranlarını bir koyun kanlı agar plakasına yerleştirin.

Plakaları bir gün boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Filtre membranını plakadan çıkarın ve 10 mililitre PBS'ye asın. Zara bağlı tüm bakterileri toplamak için karışımı yaklaşık bir dakika vorteksleyin.

Bakteriyel süspansiyonun taze TSB ile seri 10 kat seyreltilmesini yapın. TSB agar üzerine 0, 10, 4 seyreltilmiş numunelerin 100 mikrolitresini plakalayın. Veya transkonjuganları seçmek için litre başına 32 miligram kloramfenikol ve litre başına sekiz miligram tetrasiklin ile desteklenmiş TSA plakaları.

Seyreltilmiş süspansiyonun 100 mikrolitresini, yalnızca litre başına sekiz miligram tetrasiklin ile TSA plakalarına yerleştirin. Toplam alıcı sayısını saymak için. İnkübasyondan sonra, koloni PCR ile CFR geninin varlığı ve duyarlılık profilleri için çift dirençli kolonileri analiz edin.

Standart mikrodilüsyon yöntemine veya disk difüzyon yöntemine göre uygun antibiyotiklerin minimum inhibitör konsantrasyonlarını, MIC'leri ölçerek antibiyogramı belirleyin. Transkonjugantların duyarlılık profili alıcı ile aynı olmalıdır. Kloramfenikol ve CFR geninden etkilenen diğer bileşikler hariç.

Donör suşu tarafından geliştirilen tetrasiklin direncini ekarte etmek için. 3.6 milimolar kalsiyum ile desteklenmiş beş mililitre besin suyunda bir gece boyunca N315-45 kültürü hazırlayın. 50 mililitrelik cam şişelerde 10 mililitrelik son hacimde gece boyunca kültürü bir ila 1.000 seyrelterek alt kültürleri hazırlayın.

Bakterileri bir saat boyunca 37 santigrat derecede çalkalayarak, dakikada 180 dönüşle büyütün. Daha sonra, NB kalsiyum klorür ortamında bir dizi seyreltilmiş faj MR83a hazırlayın. Bakteri kültürüne 20 mikrolitre seyreltilmiş faj ekleyin.

Bakteri hücresi büyümesi için pozitif kontrol görevi görmesi için faj enfeksiyonu olmayan bir kontrol kültürü hazırlayın. Daha sonra kültürleri gece boyunca dakikada 100 dönüşte hafifçe çalkalayarak 37 santigrat derecede büyütün. Ertesi gün, eklenen fajın en yüksek seyreltilmesine sahip bir veya iki temizlenmiş kültür şişesi seçin.

Kültürleri 15 mililitrelik santrifüj tüplerine aktarın. Tüplere 250 mikrolitre kloroform ekleyin ve kültürü ters çevirerek iyice karıştırın. Kültürü 4 santigrat derecede 20 dakika boyunca 5.000 kez G'de santrifüjleyin.

Süpernatanları yeni tüplere aktarın ve kullanana kadar 4 santigrat derecede saklayın. Besin suyu agar ortamını hazırlayın ve 55 santigrat derecede bir su banyosunda sıcak tutun. Ortama otoklavlanmış 0.5 molar kalsiyum klorür çözeltisini, 3.6 milimolar nihai konsantrasyona ekleyin.

90 milimetre petri kaplarına, NB kalsiyum klorür plakalarına dökün. Çalkalayarak 37 santigrat derecede beş mililitre NB kalsiyum klorür içinde bir gece boyunca N315 kültürü hazırlayın. Ertesi gün, gece boyunca 10 mikrolitre kültürü 200 mikrolitre NB kalsiyum klorür içine ekleyin ve NB kalsiyum klorür plakasına eşit şekilde yayın.

Plakanın yüzeyi sıvı ile kaplandığında yayılmayı durdurun. Ardından plakanın beş dakika kurumasını bekleyin. NB kalsiyum klorür ortamı kullanarak önceden hazırlanmış fajın seri bir ila 10 seyreltmesini yapın.

Bakterilerle kaplı plakaya her faj seyreltmesinden üç mikrolitre tespit edin. Plakayı gece boyunca 30 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi sabah, plak numaralarını sayın ve aşağıdaki denklemi kullanarak faj titresini hesaplayın.

N315, COL veya MU50'nin gece kültürünü, dakikada 180 dönüşte çalkalayarak 37 santigrat derecede beş mililitre NB kalsiyum klorür içinde hazırlayın. Gece boyunca kültürden sonra, fajı NB kalsiyum klorür içinde mililitre başına 109 PFU'ya seyreltin. 50 mililitrelik bir cam şişede, 500 mikrolitre gece kültürü, 500 mikrolitre taze NB kalsiyum klorür ve mililitre başına bir mililitre faj 109 PFU karıştırın.

Karışımı 37 santigrat derecede 30 dakika boyunca dakikada 100 dönüşte hafifçe çalkalayarak inkübe edin. İnkübasyondan sonra, kültürlere 50 mikrolitre% 20 trisodyum sitrat ekleyin. 37 santigrat derecede 30 dakika boyunca hafifçe çalkalamaya devam edin.

Erimiş beyin kalp infüzyonunu veya BHI agar ortamını hazırlayın ve 55 santigrat derecede bir su banyosunda tutun ve agar ortamını litre başına 32 miligram kloramfenikol ile tedavi edin. Daha sonra bakteri faj karışımını 100 mililitrelik bir şişeye aktarın. Litre başına 32 miligram kloramfenikol ile desteklenmiş 50 mililitre ılık BHI agar ekleyin ve iyice karıştırın.

Karışımı 90 milimetrelik petri kaplarına dökün. Plakayı 37 santigrat derecede inkübe edin. Kolonileri litre başına 32 miligram kloramfenikol ile takviye edilmiş yeni BHI agar plakalarına aktararak, üretilen kolonileri, transdükantları direnç açısından daha fazla test edin.

Koloni PCR ile CFR geninin varlığını doğrulayın. Alıcı hücreyi gece boyunca, 37 santigrat derecede beş mililitre TSB'de çalkalayarak kültürleyin. Ertesi sabah, gece boyunca süren kültürün 0,5 mililitresini 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın.

Hücreleri santrifüjleme ile çökeltin. Daha sonra hücreleri 50 mililitrelik bir tüpte 10 mililitre CS2 ortamı ile askıya alın. Daha sonra bakterileri 37 santigrat derecede büyütün ve geç üstel faza kadar sekiz saat boyunca dakikada 180 dönüşte çalkalayın.

Hücreleri santrifüjleme ile hasat edin. Süpernatanı atın ve hücreleri 10 mililitre taze CS2 ortamında yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonuna 10 mikrogram saflaştırılmış plazmit veya genomik DNA ekleyin.

Kültürü dakikada 180 dönüşle çalkalayın. Daha sonra hücreleri santrifüjleme ile toplayın. Hücreleri 10 mililitre BHI ortamında yeniden süspanse edin.

Hücre süspansiyonunu 90 mililitre erimiş BHI agar takviyesi ile karıştırın Litre başına 32 miligram kloramfenikol ve kontrol deneyinde litre başına beş mikrogram tetrasiklin ile. Karışımı 90 milimetrelik petri kaplarına dökün ve hızla soğutun ve agarın katılaşmasına izin verin. Direnç özelliklerini doğrulamak için kürdan kullanarak kolonileri uygun antibiyotik içeren plakalara çoğaltın.

Konjugasyon protokolü, CFR donörü olarak staphylococcus epidermidis'in kullanıldığı tür içi iletim için yararlıdır. Ve alıcı olarak staphylococcus aureus N315 suşu kullanıldı. Türler arası aktarım için kullanılan protokol, farklı konjugatif donörlerde aynı konjugatif vektörü kullanarak benzer sonuçlar verir.

Bu, doğal dönüşüm detaylarının anlatıldığı ilk makaledir. Sağlanan metodoloji, araştırmacının antibiyotik direncinin iletimini ve yayılmasını ve ayrıca insan patojeni staph aureus'ta birincil belirleyiciyi incelemesi için yararlı olacaktır.