Fizyolojik Oksijen Koşullarına Maruz İnsan hücrelerinde Cap-bağlayıcı proteinlerin analizi
28 Aralık 2016
Burada, fizyolojik oksijen koşulları sırasında mRNA'nın 5' başlığını bağlayan translasyon başlatma faktörlerini analiz etmek için insan hücre kültürü protokollerini sunuyoruz. Bu yöntem, Agaroz bağlantılı bir m7GTP başlık analoğu kullanır ve kapak bağlama faktörlerini ve bunların etkileşen ortaklarını araştırmak için uygundur.
Bu deneyin genel amacı, düşük oksijen koşullarında kapak bağlayıcı proteinleri yakalamaktır. Bu yöntem, kapak bağlama faktörlerini ve bunların etkileşen ortaklarını araştırmak için agaroza bağlı yedi metil-guanozin başlık analoğu kullanır. Bu yöntem, kapsüle bağlı translasyonda yer alan yeni oksijen regüle faktörlerin tanımlanması gibi protein sentezi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olacaktır.
Bu tekniğin temel avantajı, hücrelerin lizis noktasına kadar bir hipoksi iş istasyonunda tutulmasıdır. Bu tekniğin etkileri kanser tedavisine kadar uzanır, çünkü bir tümör içindeki kanser hücreleri çok düşük oksijen seviyelerine maruz kalır ve translasyonel kontrol tümör ilerlemesinde önemli bir rol oynar. Bu yöntem için ilk olarak, Corona'nın meslektaşlarının doku oksijenasyonunun, hücrelerin rutin olarak kültürlendiği normaxiadan ziyade hipoksi dediğimiz şeye daha yakın olduğunu bildiren yakın tarihli bir yayını okuduğumuzda aklımıza geldi.
Bu prosedüre başlayın, metin protokolünde açıklandığı gibi hücre kültürü olacaktır. Hücreleri bir hemositometre kullanarak saydıktan sonra, santimetre kare başına 2500 ila 5000 hücre yoğunluğu elde etmek için 15 mililitre tam ortam içeren 150 milimetre kültürlü kapları besleyin. Her kapak bağlama testi için iki adet 150 milimetrelik tabak kullanın.
Tohumlanmış kültür kaplarını 37 santigrat derecede ve yüzde beş karbondioksit atmosferinde inkübatöre yerleştirin. Hücreler en az 24 saat inkübe edildikten sonra, hücreleri istenen süre boyunca bir hipoksi iş istasyonuna yerleştirin. Ardından, iş istasyonunu uygun fizyolojiye ayarlayın.
Bir X fosfat tamponlu salin veya PBS ve tripsini 37 santigrat derece su banyosunda 30 dakika önceden ısıtın. Gerçekleştirilen her kapak bağlama testi için 980 mikrolitre lizis tamponunu 1.5 mikrolitrelik bir santrifüj tüpüne alıkoyun. 10 mikrolitre 100X proteaz inhibitör kokteyli ve 10 mikrolitre 4-benzensülfonil florür hidroklorid, buz üzerinde 980 mikrolitre lizis tamponuna.
Her 150 milimetrelik çanaktaki medyayı hipoksi iş istasyonundaki bir atık kabına atın. Ardından, hücreleri üç ila dört mililitre ılık bir X PBS ile yıkayın ve sıvıyı atın. Her yemeğe bir mililitre ılık yüzde 05 tripsin EDTA ekleyin ve bulaşıkları iki dakika veya hücreler artık tabağa yapışmayana kadar bekletin.
Bir pipet kullanarak, bir plakanın hücrelerini 1,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Her bir hücre plakasının ayrı bir 1.5 mililitrelik mikro santrifüj tüpüne aktarılması için gerektiği kadar tekrarlayın. Hücreleri peletlemek için mikro santrifüj tüplerini 6000 kez g'de 90 saniye santrifüjleyin.
Santrifüjlemeyi takiben, peleti bozmadan bir pipet kullanarak tripsini aspire edin. 200 mikrolitre PBS'yi peletin hemen üzerindeki tüpe nazikçe pipetleyerek hücreleri ılık bir X PBS ile yıkayın. Ardından peleti bozmadan PBS'yi aspire edin.
Daha sonra, bir mililitre hazırlanmış lizis tampon çözeltisinden 500 mikrolitreyi ilk hücresel pelet üzerine pipetleyin. Yukarı ve aşağı pipetleyerek peleti tamamen yeniden süspanse edin. Yeniden süspanse edilmiş hücreleri ikinci hücre peleti ile birleştirin ve ikinci peleti yukarı ve aşağı pipetleyerek yeniden süspanse edin.
Her numune için tüm peletler birleştirilene ve yeniden askıya alınana kadar bu işlemi tekrarlayın. Daha sonra, lizatı 1.5 litrelik bir mikro santrifüj tüpünde kalan 500 mikrolitre lizis tamponu ile birleştirin. Numuneleri hipoksi iş istasyonundan çıkarın.
Numuneleri 1,5 ila iki saat boyunca dört derece santipus'ta döndürerek hafif çalkalama kullanarak hücreleri parçalayın. İnkübasyondan sonra, hücresel kalıntıları gidermek için parçalanmış hücreleri 1200 kez g'de dört santigrat derecede 15 dakika santrifüjleyin. Lizatı yeni bir 1.5 mililitrelik mikro santrifüj tüpüne aktarın ve peleti atın.
Western blot analizi için tüm hücre lizat giriş kontrolü olarak kullanılmak üzere süpernatantın bir kısmını ayırın. Kapak bağlama testine hazırlanmak için, boncuk bulamacının toplanmasını kolaylaştırmak için pipetin ucunu çıkarmak için makas kullanın. Her numune için, 50 mikrolitre boş agaroz boncuk kontrol bulamacını ve 50 mikrolitre m7GTP agaroz C10 bağlantılı boncuk bulamacını 1.5 mililitrelik mikro santrifüj tüplerine aktarın.
Ardından, bulamacı 30 saniye boyunca 500 kez g'da santrifüjleyerek boncukları peletleyin. Süpernatanı dikkatlice çıkarın ve boncukları 500 mikrolitre TBS'de tekrar askıya alın. Bu adımları tekrarladıktan sonra, boncukları 30 saniye boyunca 500 kez g pelet haline getirin ve süpernatanı çıkarın.
Daha sonra, lizatı içeren süpernatanı, boş agaroz boncuklarını içeren 1.5 mililitrelik mikro santrifüj tüpüne aktarın. Hafif çalkalama ile dört santigrat derecede 10 dakika inkübe edin. 10 dakika sonra, boş agaroz boncuklarını 30 saniye boyunca 500 kez g'de santrifüjleyerek peletleyin.
Santrifüjlemeyi takiben, boncuklara bağlanmayan lizatı, m7GTP agaroz C10'a bağlı boncukları içeren 1,5 mililitrelik mikro santrifüj tüpüne aktarın. Boncukları 500 mikrolitre lizis tamponunda yeniden süspanse ederek, boncukları 30 saniye boyunca 500 zaman g'da santrifüjleyerek ve süpernatanı atarak boş agaroz boncukları yıkayın. Toplam beş yıkama için bunu dört kez tekrarlayın.
Boş agaroz boncuklarını bir X SDS-PAGE numune tamponunda yeniden askıya alın. Ve boncukları 95 santigrat derecede 90 saniye kaynatın. Numuneyi 20 santigrat derecede saklayın, hava durumunu gözlemlemek için gelecekteki western blot analizi için, ilgilenilen protein boncuklara spesifik olmayan bir şekilde bağlanır.
Lizatı, kapak bağlayıcı proteinleri yakalamak için dört derece celsuis'te bir saat boyunca hafif çalkalama ile m7GTP agaroz C10 bağlantılı boncuklarla inkübe edin. Çalkalamayı takiben, m7GTP agaroz C10 bağlantılı boncukları 30 saniye boyunca 500 kez g'de santrifüjleyerek peletleyin. Süpernatanı attıktan sonra, m7GTP agaroz C10 bağlantılı boncukları daha önce olduğu gibi yıkayın.
Boncukları 600 mikrolitre lizis tamponunda tekrar süspanse edin ve GTP'yi bir milimolar nihai konsantrasyona ekleyin. M7GTP agaroz C10 bağlantılı boncukları ve bir milimolar GTP'yi dört santigrat derecede bir saat boyunca hafif çalkalama ile inkübe edin. Bu, m7GTP ile spesifik olmayan bir şekilde etkileşime giren proteinleri ayrıştıracaktır.
M7GTP agaroz C10 bağlantılı boncukları 500 zaman g'da 30 saniye santrifüjleyerek peletleyin. Süpernatanı yeni bir 1,5 mililitrelik mikro santrifüj tüpüne aktarın ve 200 mikrolitre dört X SDS-PAGE numune tamponu ekleyin. Boncukları daha önce olduğu gibi yıkadıktan sonra, boncukları bir X SDS-PAGE numune tamponunda tekrar süspanse edin ve 95 santigrat derecede 90 saniye kaynatın.
Burada, primer insan renal proksimal tübül epitel hücrelerindeki oksijen dalgalanmalarına yanıt olarak iki ana kap bağlayıcı proteinin tipik bir m7GTP afinite saflaştırmasının temsili western lekeleri gösterilmektedir. Hücre lizatları 24 saat boyunca yüzde sekiz, yüzde beş, yüzde üç veya yüzde bir oksijene maruz bırakıldı. Şeritler, girdi olarak tüm hücre lizatının yüzde 10'unu, m7GTP'nin özgüllüğünü ölçmek için yıkanmış bir GTP'yi ve GTP yıkamasından sonra m7GTP boncuklarına bağlanan proteinleri içerir.
En az üç bağımsız deneyden elde edilen veriler, Görüntü J ile ölçüldü ve tüm hücre lizatının yüzde 10'luk girdisine göre nispi yoğunluk birimleri olarak ifade edildi. Sonuçlar, fizyolojik oksijen altında kültürlenen insan hücrelerinin, translasyon için farklı mRNA'ları işe almak için iki kapak bağlayıcı protein kullandığını göstermektedir. Bu videoyu izledikten sonra, düşük oksijen koşullarında kapak bağlayıcı proteinlerin nasıl yakalanacağını iyi anlamış olmalısınız.
Bu prosedürü denerken, hücreleri hipoksi iş istasyonunda lizis noktasına kadar tutmayı hatırlamak önemlidir, çünkü oksijen bu translasyon başlatma faktörlerinin biyokimyasal özelliklerini hızla değiştirebilir. Bu prosedürü takiben, düşük oksijen koşulları altında hangi kapak bağlayıcı proteinlerin aktif translasyon ile ilişkili olduğu gibi ek soruları yanıtlamak için polizom fraksiyonasyonu gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, düşük oksijen koşullarında mRNA'nın 5' başlığını bağlayan çeviri başlatma faktörlerini analiz etmek için bir yöntem sunmaktadır. Agaroz bağlı m7 GTP başlık analogu kullanarak, bu teknik, başlık bağımlı çeviriye dahil olan yeni oksijen düzenlemeli faktörleri tanımlamayı amaçlamaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Hücre Biyolojisi
- Protein Sentezi
Arka Plan
- Başlık bağlayıcı proteinler, çeviri başlatmada önemli bir rol oynamaktadır.
- Tümörlerdeki hücreler genellikle hipoksi koşullarında bulunurlar.
- Düşük oksijen altında çeviriyi anlamak, kanser tedavisini bilgilendirebilir.
- Son çalışmalar, doku oksijenasyonunun genellikle hipoksiden ziyade normoksiye daha yakın olduğunu öne sürmektedir.
Çalışmanın Amacı
- Düşük oksijen koşullarında başlık bağlayıcı proteinleri yakalamak.
- Başlık bağlayıcı faktörlerin ve ortaklarının etkileşimini araştırmak.
- Hipoksik koşullar altında çeviriyi düzenleyen yeni faktörleri tanımlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Agaroz bağlı m7 GTP başlık analogunun kullanımı.
- Hücre lizise kadar hipoksi iş istasyonunda korunan hücre kültürü.
- Kontrollü oksijen seviyelerinde protein etkileşimlerinin analizi.
- Yöntemin kanser hücrelerinde çeviri kontrolünü incelemek için uygulanması.
Ana Sonuçlar
- Hipoksik koşullarda başlık bağlayıcı proteinlerin başarılı bir şekilde yakalanması.
- Çeviriye dahil yeni oksijen düzenlemeli faktörlerin tanımlanması.
- Tümör ilerlemesinde çeviri kontrolünün rolü hakkında bilgiler.
- Yöntemin protein sentezini incelemede etkinliğinin doğrulanması.
Sonuçlar
- Bu yöntem, çeviri başlatma faktörlerini incelemek için yeni bir yaklaşım sağlamaktadır.
- Bulgular, kanser biyolojisini anlamak açısından önemli olabilir.
- Dahası araştırmalar, hipoksikli tümörleri hedef alan terapötik stratejilerin geliştirilmesine yardımcı olabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Understanding oxygen-dependent regulation of translation initiation is critical for de-risking oncology targets, as tumor microenvironments exhibit physiological oxygen levels that alter cap-dependent protein synthesis. This method enables identification of oxygen-sensitive cap-binding proteins, supporting mechanistic validation of translation factors in disease-relevant systems. By preserving native oxygen conditions during sample preparation, the approach enhances predictive confidence in target validation and assay development for hypoxic disease models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating cap-binding proteins under physioxia conditions that mimic human tissue oxygenation.
- Operational Value: Provides a reproducible workflow for validating oxygen-regulated translation factors as potential drug targets in cancer biology.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative binding data for cap-dependent translation factors across oxygen gradients, enabling assay standardization for target engagement studies.
- Operational Value: Supports development of oxygen-controlled biochemical assays to screen modulators of translation initiation in physiologically relevant conditions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates mechanistic de-risking by linking oxygen-sensitive cap-binding proteins to translational control in disease-relevant primary human cells.
- Operational Value: Enables continuity from discovery to preclinical validation by maintaining hypoxic conditions throughout sample processing, reducing artifactual target modulation.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing oxygen-regulated biochemical readouts that inform target selection and lead identification in oncology programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of oxygen-dependent translation initiation by capturing cap-binding proteins under controlled physioxia.
- Screening: Enables assay readiness through standardized capture and elution of m7GTP-binding proteins under low oxygen conditions.
- Analytics: Generates quantitative western blot outputs to compare cap-binding protein abundance across oxygen levels, aiding comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by using primary human renal proximal tubule epithelial cells as a disease-relevant system for oxygen-regulated translation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying oxygen-sensitive RNA-binding proteins across multiple target classes beyond translation factors.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in oxygen-sensitive translation pathways.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization by requiring hypoxia workstation use for cell culture, lysis, and biochemical steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early de-risking of targets whose activity is confounded by standard normoxic culture conditions.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets in hypoxic disease areas through oxygen-controlled biochemical validation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in hypoxic cell culture and biochemical assay execution within controlled atmosphere workstations.
- Dependent on access to hypoxia workstations for maintaining physioxia during cell handling and sample preparation.
- Necessitates standardization of oxygen levels and equilibration times across laboratories for reproducible cap-binding protein recovery.
- Involves adaptation considerations when applying the method to non-adherent or primary cell types with varying oxygen sensitivity.
- Limited by potential loss of cap interactors that require second-base interactions or m7GTP hydrolysis, as noted in the protocol.
