Name: Fizyolojik Oksijen Koşullarına Maruz İnsan hücrelerinde Cap-bağlayıcı proteinlerin analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Keşfedin, agaroz bağlı m7GTP kap analogu kullanarak hipoksik koşullarda insan hücrelerinde kap-bağlayıcı proteinleri yakalama yöntemini. Bu teknik, kanser biyolojisinde çeviri kontrolünü anlamak için yeni oksijen düzenlenmiş faktörleri belirlemeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Konseyi ve Ontario Araştırma ve Yenilik Bakanlığı tarafından desteklenmiştir.

Hücre Kültürü 1. Hazırlıklar <ol><li> insan hücrelerinin ticari olarak temin stoklarının al. NOT: Bu protokol, HCT116 kolon karsinomu ve birincil insan renal proksimal tübüler epitelyel hücrelerin (HRPTEC) kullanır. </li><li> Dulbecco Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı (DMEM)% 7.5 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 Penisilin / Streptomisin (P / S) ile desteklenmiş / yüksek glukoz ortamı: HCT116 kültürü için 500 mi tanesidir. </li><li> % 5 FBS,% 1 epitel hücre büyüme takviyesi ile takviye Epitelyal hücre ortamı, ve% 1 P / S: 500 mi HRPTEC kültürü için tanesidir. </li><li> 140 mM NaCI, 3 mM KCI, 10 mM Na-2 HPO 4, 15 mM KH 2 PO 4: 1x Fosfat Tamponlu Salin (PBS) 500 ml hazırlayın. 7.4 pH ayarlamak ve 121 ° C&#39;de 40 dakika süre ile otoklavlama sureti ile sterilize. </li></ol> Hücre kültürü 2. Başlatma <ol><li> Dikkatle t bozmadan% 80-90 konfluent çanak orta aspireO hücreleri. </li><li> kültür çanak başına 1x PBS Kısım 3-5 ml yavaşça kaplamak çanak yüzey alanını her şişeyi sallayın ve dikkatle 1x PBS aspire. İkinci 1x PBS yıkama için tekrarlayın. </li><li> 3, her bir kültür tabağı içine% 0.05 tripsin etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ile yıkanır ve hafifçe eşit şekilde kaplamak tripsin-EDTA ile hücrelere kaya kısım. 2-3 dakika boyunca, 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> 90 sn için 4000 xg, 15 ml&#39;lik bir santrifüj tüpü ve santrifüje müstakil hücreleri aktarın. </li><li> tam DMEM 1 ml tekrar süspansiyon hücre pelet. </li><li> bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın. Cm2 başına yaklaşık 2,500-5,000 hücre ilk önce tohum ekme yoğunluğu elde etmek için gereken kaç pirojenik olmayan ve polistiren 100 mm&#39;lik bir hücre kültür kaplarına hesaplayın. </li><li> adım 30-45 dakika boyunca 37 ° C su banyosu içinde 1.2 veya 1.3 yapılan ön sıcak tam hücre kültürü ortamı. </li><li> % 70 etanol ile orta şişe ve hücre şişesini dekontamine. ileriye bu noktadan itibarenişlemler aseptik olarak yapılmalıdır. </li><li> Kısım adım 2.6 belirtilen tohum ekme yoğunluğu olan dondurulmuş hücre, tüm birimi kullanmak, çok 100 mm hücre kültür kaplarına tam DMEM 6 mi. </li><li> 100 mm kültür çanakları her adım 2.6 hesaplanan hücre süspansiyonu hacmi aktarın. eşit plaka yüzeyi üzerinde hücreleri dağıtmak için elle her plakayı sallayın. </li><li> % 5 CO2 atmosferinde 37 ° C&#39;de inkübatörde tohumlanmış 100 mm hücre kültür çanağı yerleştirin. Hücreler sonraki adımlarda önce en az 24 saat inkübe izin verin. </li></ol> 3. besi yerinden <ol><li> Hücre konfluent yüzdesini (çanak alanı kapsayan% hücreleri) belirlemek için bir mikroskop altında her bir hücre kültür çanağı gör. kuvöz ve öncesi sıcak tam orta ve 1x PBS hücreleri dönün. Hücreler% 80-100 konfluent iseniz bir sonraki adıma geçin. </li><li> Dikkatlice bozmadan harcanan orta aspireHer bir kültür kabı hücreler. </li><li> kültür çanak başına 1x PBS Kısım 3-5 ml yavaşça kaplamak çanak yüzey alanını her şişeyi sallayın ve dikkatle 1x PBS aspire. İkinci 1x PBS yıkama için tekrarlayın. </li><li> Kısım 3, her bir kültür tabağı içine% 0.05 tripsin-EDTA ve yavaşça kaya eşit şekilde kaplamak tripsin-EDTA ile hücrelerine temin etmektedir. 2-3 dakika boyunca, 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Bu kuluçka sırasında, kısım kadar kültür tabaklarında tam ortam, 10 ml cm2 başına 2,500-5,000 hücre hücre yoğunluğu elde etmek için gereklidir. </li><li> Hücreler plakasından ayrılmış olduğunda, hızlı bir şekilde 1 x tanımlanan tripsin inhibitörü 3 ml ilave edilir ve yavaşça tripsin-EDTA tüm nötralize edilmiş olmasını sağlamak için 1 dakika için çanak girdap. </li><li> steril bir 15 ml&#39;lik santrifüj tüpüne ayrılmış hücreleri aktarın ve kenara. Kalan hücreler bir araya ve aynı 15 mi santrifüj borusuna bu transfer çanak PBS 1X 3 ml ekleyin. </li><li> 150 xg santrifüj edilerek pelet hücreleri5 dakika karıştırıldı. </li><li> Süpernatant aspire ve tam ortam 3 ml hücre pelletini. </li><li> Bir hemositometre kullanılarak hücrelerin sayısı ve cm2 başına 2,500-5,000 hücre, bir hücre yoğunluğu elde etmek için tam ortam 15 ml ihtiva eden 150 mm kültür kaplarına tohum. Her bir kap-bağlanma tahlili için iki 150 mm kullanın. Not: sıvı ortam ile hücrelere oksijen difüzyon Cilt 36 bağlıdır. Süspansiyon içindeki yapışan hücreler veya hücre kullanılıp kullanılmadığını deneyler arasında tutarlı medya hacmini tutulması tavsiye edilir. Medya yayılmasında bu değişkenliğe önlemek için (Tartışma tartışıldığı gibi 24 saat iş istasyonu inkübe) önceden klimalı edilebilir. </li><li> % 5 CO2 atmosferinde 37 ° C&#39;de inkübatör tohumlanmış kültür yemekler yerleştirin. Hücreler sonraki adımlara geçmeden önce en az 24 saat inkübe izin verin. </li></ol> 4. Physioxic Pozlama <ol><li> mikroskop altında hücre gör. bes içint sonuçları, hücreler 24 saat pozlama için% 70-80 konfluent, 48 saat pozlama için% 50-60 konfluent ve 72 saat pozlama için% 40-50 konfluent olduğundan emin olun. </li><li> İstenen süre (24, 48, ya da deneye bağlı olarak 72 saat) hipoksiyaya iş istasyonuna hücreleri yerleştirin. </li><li> Uygun physioxia için iş istasyonu ayarlayın. NOT: Örneğin,% 3 O 2 ayar% 5 CO 2 ve% 92 N2 eşlik ediyorum. NOT: Dinamik aralık içinde oksijen dalgalanmaları aracı haline belirli bir zaman çizelgesi, program takvimi üzerinde istenen veya manuel olarak istenen aralıklarla oksijen ayarlarını varsa. </li><li> % 60 nem ayarlayın. iş istasyonu atmosfer yine de çok kuru ve medya belirgin uzun deneyler (&gt; 48 saat) boyunca buharlaşır. (Ortam iş istasyonu bir atmosfer ile dengelenir böylece) hücre kültürü DIS ortamı doldurmak için iş istasyonu olan bir hücre kültür şişesi içinde ortam rezervini muhafazahes. Not: çözünmüş oksijen, atmosferik oksijen 36 dengelenir, böylece (örneğin, PBS ve tripsin-EDTA gibi) liziz önce hücreler ile etkileşim herhangi bir çözüm hipoksi iş istasyonu olan, kullanımdan önce, 24 saat için önceden şartlandınlmalıdır. </li><li> lizis kadar iş istasyonu içinde hücreler tutun. </li></ol> Cap-bağlama deneyi 5. hazırlanması Tamponlar <ol><li> 1x Tris-tamponlu tuzlu su (TBS) hazırlayın. <ol><li> DH 2 O 800 ml, 8.76 g, NaCl ve 6.05 g Tris baz çözülür. </li><li> 1 M HCI kullanılarak 7.4&#39;luk bir nihai pH&#39;a çözüm sağlamaktadır. </li><li> DH 2 O. kullanarak 1 L son hacim kazandırın </li></ol></li><li> denatüre lizis tamponu hazırlayın. Cap-bağlama analizinin yapılacağı güne liziz tamponunda hazırlanır. Boş agaroz boncuk ve γ-aminofenil-m 7 GTP agaroz C10-bağlantılı boncuk (7,9 ve 7.13 adımlar) yıkamak için ekstra lizis tamponu yapın. <ol><li> DH 2 O 7 ml, 160 ul 5 M NAC eklemeL, 160 ul 1 M Tris-HCI pH 7.4, 40 ul 200 mM NaF, 40 ul 1 M MgCl2, 40 ul 1 mM sodyum ortovanadat. </li><li> 7 mi çözeltisine Igepal 40 ul ekle. son derece viskoz olduğu gibi Igepal ™ almak yardımcı olmak için pipet ucu kesin. </li><li> Igepal tüm çözünmüş kadar, aşağı yukarı pipetleme veya vorteks 7 ml solüsyon karıştırın. </li><li> 8 ml çözeltinin son hacmi kaldırın ve buz üzerinde tutun. </li></ol></li><li> 4x sodyum dodesil sülfat (SDS) -PAGE Örnek Tamponu hazırlayın. <ol><li> Bir cam kaba, 16 ml 1 M Tris-HCI pH 6.8, 12.64 ml gliserol, ve 8 ml ditiotreitol (DTT) birleştirir. </li><li> SDS 3.2 g ve bromofenol mavisi, 0.16 g ekleyin. Toz tamamen manyetik karıştırıcı ile karıştırılarak erimesine izin verir. </li><li> -20 ° C&#39;de 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri içine kısım ve mağaza. </li></ol></li></ol> 6. Hücre Liziz <ol><li> denatüre edici olmayan lizis tamponu hazırlayın ve buz üzerinde th günlük tutmakE Cap-bağlanma tahlili. </li><li> 30 dakika boyunca 37 ° C su banyosu içinde 1 x PBS öncesi sıcak ve tripsin. </li><li> Her bir kap-bağlanma tahlili için, 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içine lizis tamponu kısım 980 ul yapılmaktadır. </li><li> liziz tamponu 980 ul 4- (2-aminoetil) benzensülfonil fluorür hidroklorür 10 ul ve 100x proteaz önleyici kokteyl 10 ul ekle. buz üzerinde tutun. </li><li> hipoksi iş istasyonu içinde bir çöp konteynırına her 150 mm çanak medya atın. </li><li> Sıcak 1x PBS 3-4 ml hücreleri yıkayın ve tüm sıvı atın. </li><li> Her bir tabak sıcak% 0.05 tripsin-EDTA 1 ml ilave edilir ve 2 dakika boyunca ya da hücreleri artık plakaya tutunur kadar bekletin. </li><li> Bir pipet kullanarak, 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü, bir plaka hücreleri transferi. hücrelerin her plaka ayrı bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne aktarılır, böylece gerektiğinde tekrar edin. </li><li> 90 saniye t 6,000 xg&#39;de 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri santrifüjO pelet hücreleri. </li><li> pelet bozmadan pipet kullanarak tripsin aspire. pelet 90 saniye boyunca 6.000 xg, yeniden santrifüj 1,5 ml&#39;lik ependorf tüp rahatsız edilirse. </li><li> nazikçe sadece pelet yukarıda tüpe PBS 200 ul pipetleme sıcak 1x PBS ile hücreleri yıkayın. Yeniden santrifüj pelet rahatsız olup olmadığını. </li><li> pelet bozmadan PBS aspire. </li><li> 1 ml Pipet 500 ul birinci hücresel pelet üzerine liziz tampon çözeltisi hazırlandı. Yukarı ve aşağı pipetleme tamamen pelletini. </li><li> İkinci hücre pelet ile yeniden süspanse hücreleri birleştirin ve yukarı ve aşağı pipetleme ikinci pelletini. Tüm topaklar birleştirildi ve her bir örnek için yeniden süspanse edilene kadar bu işlemi tekrarlayın. </li><li> 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde liziz tamponunda kalan 500 ul lizat birleştirin. </li><li> hipoksi iş istasyonundan örnekleri çıkarın. Not: liziz tamponu ilave edildikten sonra, birII Daha sonraki aşamalar, hipoksi, iş istasyonu, 37 ° C olarak ayarlanmış ve aşağıdaki adımlar soğuk (4 ° C veya buz üzerinde) gerçekleştirilir edilecek olduğu gibi çevre havası ifa edilecek olan vardır. </li><li> Lyse 1.5-2 saat boyunca 4 ° C&#39;de örnekleri çevirerek nazik ajitasyon kullanılarak hücreler. </li><li> selüler artığın ayrılması için 4 ° C&#39;de 15 dakika boyunca 12,000 x g&#39;de lize hücreleri santrifüjleyin. </li><li> Yeni 1.5 ml mikrosantrifüj tüp lizat aktarın ve pelet atın. </li><li> Süpernatantın bir kısmı (% 5-10), gelecekte Western blot analizi için bir bütün hücre lizatı giriş kontrol olarak kullanılmak üzere ayırın. </li></ol> 7. Cap-bağlanma deneyi <ol><li> Her numune için, 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri ayırmak için boş agaroz boncuk kontrol bulamacın 50 ul ve γ-aminofenil m 7 GTP agaroz C10-bağlanmış boncuk çamuru 50 ul transfer. boncuk bulamaç toplanmasını kolaylaştırmak için pipet ucu çıkarmak için makas kullanın. </li><li> boncuk b peletY 30 sn boyunca 500 xg&#39;de bulamaç santrifüj. </li><li> dikkatlice Süpernatantı ve TBS 500 ul boncuklar tekrar süspansiyon. </li><li> Tekrarlayın 7.2 ve 7.3 adımları tekrarlayın. 30 saniye boyunca 500 xg&#39;de boncuk Pelet ve süpernatant kaldırmak. </li><li> Boş agaroz boncuklar içeren 1.5 ml mikrosantrifüj tüp adım 6.19 lizat içeren süpernatant aktarın. NOT: Boş agaroz boncuklar non-spesifik boncuk ile etkileşime lizat proteinleri kaldırmak için bir ön temizleme adımı olarak hareket ederler. </li><li> yavaşça sallanarak 4 ° C&#39;de 10 dakika süreyle inkübe edin. </li><li> 30 saniye boyunca 500 xg&#39;de santrifüj edilerek boş agaroz boncuk pelet. </li><li> Γ-aminofenil-m 7 GTP agaroz C10-bağlantılı boncuklar içeren 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne lizat aktarın. </li><li> Liziz tamponu 500 ul boncuk yeniden süspanse 30 sn boyunca 500 xg&#39;de santrifüjleme ile boncuk tane haline ve Superna ayıklayarak boş agaroz boncuk yıkayıntant. Beş yıkar toplam bu dört kez tekrarlayın. </li><li> 1x SDS-PAGE numune tampon maddesi içinde boş bir agaroz boncuklar tekrar süspansiyon ve 95 ° C&#39;de 90 sn için boncuk kaynatın. gelecekteki Western blot analizi için -20 ° C&#39;de saklayın ilgili protein boncuk olmayan spesifik olarak bağlanan bakmaktır. </li><li> Cap bağlayıcı proteinler yakalamak için 4 ° C sıcaklıkta 1 saat boyunca yavaşça sallanarak γ-aminofenil m 7 GTP agaroz C10-bağlı boncuklar ile lizat inkübe edin. </li><li> 30 saniye için 500 x g&#39;de santrifüj γ-aminofenil m 7 GTP agaroz C10-bağlı boncuklar Pelet. süpernatant atın. </li><li> Adım 7.9 yineleyerek γ-aminofenil-m 7 GTP agaroz C10-bağlantılı boncuk yıkayın. </li><li> liziz tamponu 600 ul boncuk tekrar. </li><li> 1 mM&#39;lik nihai bir konsantrasyona kadar GTP ekleyin. </li><li> 4 ° C sıcaklıkta 1 saat boyunca yavaşça sallanarak γ-aminofenil m 7 GTP agaroz C10-bağlı boncuklar + 1 mM GTP inkübe edin. Not: Bunon-spesifik m 7 GTP ile etkileşim proteinleri ilişkisini (yani, non-metile GTP ile etkileşim). </li><li> 30 saniye için 500 x g&#39;de santrifüj γ-aminofenil m 7 GTP agaroz C10-bağlı boncuklar Pelet. </li><li> yeni bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü süpernatantı aktarın ve 4x SDS-PAGE örnek tamponu (50 mM Tris-HCI, 100 mM DTT,% 2 SDS, mavi,% 0.1 bromofenol ve% 10 gliserol) 200 ul ilave edin. Gelecekteki western blot analizi 37 -20 ° C &#39;de GTP kontrol örneği saklayın. adım 7.9 tekrarlayarak boncuk yıkayın. </li><li> 90 sn için 95 ° C &#39;de 1 x SDS-PAGE örnek tamponu (50 mM Tris-HCI, 100 mM DTT,% 2 SDS, mavi,% 0.1 bromofenol ve% 10 gliserol) ve kaynama boncuk tekrar. Gelecekteki western blot analizi 37 -20 ° C &#39;de 7 m GTP&#39;ye bağlı fraksiyonu saklayın. </li></ol>

<ol><li>Holcik, M., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+control+in+stress+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Translational control in stress and apoptosis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).</li>
<li>Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+translation+initiation+in+eukaryotes%3A+mechanisms+and+biological+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of translation initiation in eukaryotes: mechanisms and biological targets.</a> Cell. 136 (4), 731-745 (2009).</li>
<li>Gingras, A. C., Raught, B., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((eIF4+initiation+factors%3A+effectors+of+mRNA+recruitment+to+ribosomes+and+regulators+of+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">eIF4 initiation factors: effectors of mRNA recruitment to ribosomes and regulators of translation.</a> Annu Rev Biochem. 68, 913-963 (1999).</li>
<li>Weingarten-Gabbay, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+genetics.+Systematic+discovery+of+cap-independent+translation+sequences+in+human+and+viral+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Comparative genetics. Systematic discovery of cap-independent translation sequences in human and viral genomes.</a> Science. 351 (6270), (2016).</li>
<li>Andreev, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+and+glucose+deprivation+induces+widespread+alterations+in+mRNA+translation+within+20+minutes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Oxygen and glucose deprivation induces widespread alterations in mRNA translation within 20 minutes.</a> Genome Biol. 16, 90(2015).</li>
<li>Ho, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+Reprogramming+of+Translation+Efficiencies+on+Oxygen+Stimulus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Systemic Reprogramming of Translation Efficiencies on Oxygen Stimulus.</a> Cell Rep. 14 (6), 1293-1300 (2016).</li>
<li>Shatsky, I. N., Dmitriev, S. E., Andreev, D. E., Terenin, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+studies+uncover+the+diversity+of+modes+of+mRNA+recruitment+to+eukaryotic+ribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Biochem+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide studies uncover the diversity of modes of mRNA recruitment to eukaryotic ribosomes.</a> Crit Rev Biochem Mol Biol. 49 (2), 164-177 (2014).</li>
<li>Ho, J. J., Lee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cap+for+Every+Occasion%3A+Alternative+eIF4F+Complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">A Cap for Every Occasion: Alternative eIF4F Complexes.</a> Trends Biochem Sci. , (2016).</li>
<li>Lin, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PHAS-I+as+a+link+between+mitogen-activated+protein+kinase+and+translation+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">PHAS-I as a link between mitogen-activated protein kinase and translation initiation.</a> Science. 266 (5185), 653-656 (1994).</li>
<li>Richter, J. D., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cap-dependent+translation+by+eIF4E+inhibitory+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regulation of cap-dependent translation by eIF4E inhibitory proteins.</a> Nature. 433 (7025), 477-480 (2005).</li>
<li>Tee, A. R., Tee, J. A., Blenis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+the+interaction+of+the+mammalian+eIF4E-related+protein+4EHP+with+4E-BP1%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Characterizing the interaction of the mammalian eIF4E-related protein 4EHP with 4E-BP1.</a> FEBS Lett. 564 (1-2), 58-62 (2004).</li>
<li>Rom, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+characterization+of+4EHP%2C+a+novel+mammalian+eIF4E-related+cap-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cloning and characterization of 4EHP, a novel mammalian eIF4E-related cap-binding protein.</a> J Biol Chem. 273 (21), 13104-13109 (1998).</li>
<li>Uniacke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+oxygen-regulated+switch+in+the+protein+synthesis+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An oxygen-regulated switch in the protein synthesis machinery.</a> Nature. 486 (7401), 126-129 (2012).</li>
<li>Morita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+4EHP-GIGYF2+translational+repressor+complex+is+essential+for+mammalian+development%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A novel 4EHP-GIGYF2 translational repressor complex is essential for mammalian development.</a> Mol Cell Biol. 32 (17), 3585-3593 (2012).</li>
<li>Webb, N. R., Chari, R. V., DePillis, G., Kozarich, J. W., Rhoads, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+the+messenger+RNA+cap-binding+protein+using+a+new+affinity+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Purification of the messenger RNA cap-binding protein using a new affinity medium.</a> Biochemistry. 23 (2), 177-181 (1984).</li>
<li>Kiriakidou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+mRNA+m7G+cap+binding-like+motif+within+human+Ago2+represses+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An mRNA m7G cap binding-like motif within human Ago2 represses translation.</a> Cell. 129 (6), 1141-1151 (2007).</li>
<li>Mazza, C., Segref, A., Mattaj, I. W., Cusack, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+induced+fit+recognition+of+an+m%287%29GpppG+cap+analogue+by+the+human+nuclear+cap-binding+complex%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Large-scale induced fit recognition of an m(7)GpppG cap analogue by the human nuclear cap-binding complex.</a> EMBO J. 21 (20), 5548-5557 (2002).</li>
<li>Nojima, T., Hirose, T., Kimura, H., Hagiwara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interaction+between+cap-binding+complex+and+RNA+export+factor+is+required+for+intronless+mRNA+export%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The interaction between cap-binding complex and RNA export factor is required for intronless mRNA export.</a> J Biol Chem. 282 (21), 15645-15651 (2007).</li>
<li>Pabis, M., Neufeld, N., Shav-Tal, Y., Neugebauer, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+properties+and+dynamic+localization+of+an+alternative+isoform+of+the+cap-binding+complex+subunit+CBP20%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleus%22%5BJournal%5D)">Binding properties and dynamic localization of an alternative isoform of the cap-binding complex subunit CBP20.</a> Nucleus. 1 (5), 412-421 (2010).</li>
<li>Ruud, K. A., Kuhlow, C., Goss, D. J., Browning, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+a+novel+cap-binding+protein+from+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of a novel cap-binding protein from Arabidopsis thaliana.</a> J Biol Chem. 273 (17), 10325-10330 (1998).</li>
<li>Ptushkina, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+second+eIF4E+protein+in+Schizosaccharomyces+pombe+has+distinct+eIF4G-binding+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A second eIF4E protein in Schizosaccharomyces pombe has distinct eIF4G-binding properties.</a> Nucleic Acids Res. 29 (22), 4561-4569 (2001).</li>
<li>Cho, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+paradigm+for+translational+control%3A+inhibition+via+5%27-3%27+mRNA+tethering+by+Bicoid+and+the+eIF4E+cognate+4EHP%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A new paradigm for translational control: inhibition via 5'-3' mRNA tethering by Bicoid and the eIF4E cognate 4EHP.</a> Cell. 121 (3), 411-423 (2005).</li>
<li>Dinkova, T. D., Keiper, B. D., Korneeva, N. L., Aamodt, E. J., Rhoads, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translation+of+a+small+subset+of+Caenorhabditis+elegans+mRNAs+is+dependent+on+a+specific+eukaryotic+translation+initiation+factor+4E+isoform%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Translation of a small subset of Caenorhabditis elegans mRNAs is dependent on a specific eukaryotic translation initiation factor 4E isoform.</a> Mol Cell Biol. 25 (1), 100-113 (2005).</li>
<li>Timpano, S., Uniacke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Cells+Cultured+Under+Physiological+Oxygen+Utilize+Two+Cap-binding+Proteins+to+Recruit+Distinct+mRNAs+for+Translation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Human Cells Cultured Under Physiological Oxygen Utilize Two Cap-binding Proteins to Recruit Distinct mRNAs for Translation.</a> J Biol Chem. , (2016).</li>
<li>Dings, J., Meixensberger, J., Jager, A., Roosen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+experience+with+118+brain+tissue+oxygen+partial+pressure+catheter+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Clinical experience with 118 brain tissue oxygen partial pressure catheter probes.</a> Neurosurgery. 43 (5), 1082-1095 (1998).</li>
<li>Le, Q. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evaluation+of+tumor+oxygenation+and+gene+expression+in+patients+with+early+stage+non-small+cell+lung+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">An evaluation of tumor oxygenation and gene expression in patients with early stage non-small cell lung cancers.</a> Clin Cancer Res. 12 (5), 1507-1514 (2006).</li>
<li>Muller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+desflurane+and+isoflurane+on+intestinal+tissue+oxygen+pressure+during+colorectal+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Anaesthesia%22%5BJournal%5D)">Effects of desflurane and isoflurane on intestinal tissue oxygen pressure during colorectal surgery.</a> Anaesthesia. 57 (2), 110-115 (2002).</li>
<li>Brooks, A. J., Eastwood, J., Beckingham, I. J., Girling, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+tissue+partial+pressure+of+oxygen+and+carbon+dioxide+during+partial+hepatectomy%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Anaesth%22%5BJournal%5D)">Liver tissue partial pressure of oxygen and carbon dioxide during partial hepatectomy.</a> Br J Anaesth. 92 (5), 735-737 (2004).</li>
<li>Muller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renocortical+tissue+oxygen+pressure+measurements+in+patients+undergoing+living+donor+kidney+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Anesth+Analg%22%5BJournal%5D)">Renocortical tissue oxygen pressure measurements in patients undergoing living donor kidney transplantation.</a> Anesth Analg. 87 (2), 474-476 (1998).</li>
<li>Richardson, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+skeletal+muscle+intracellular+oxygenation%3A+the+impact+of+ambient+oxygen+availability%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Human skeletal muscle intracellular oxygenation: the impact of ambient oxygen availability.</a> J Physiol. 571 (Pt 2), 415-424 (2006).</li>
<li>Harrison, J. S., Rameshwar, P., Chang, V., Bandari, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+saturation+in+the+bone+marrow+of+healthy+volunteers%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Oxygen saturation in the bone marrow of healthy volunteers.</a> Blood. 99 (1), 394(2002).</li>
<li>Gleadle, J., Ratcliffe, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGleadle%2C+J+%22Hypoxia%22">Hypoxia</a>. , John Wiley & Sons, Ltd. Chichester. (2001).</li>
<li>Gluckman, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+reconstitution+in+a+patient+with+Fanconi%27s+anemia+by+means+of+umbilical-cord+blood+from+an+HLA-identical+sibling%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic reconstitution in a patient with Fanconi's anemia by means of umbilical-cord blood from an HLA-identical sibling.</a> N Engl J Med. 321 (17), 1174-1178 (1989).</li>
<li>Parrinello, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+sensitivity+severely+limits+the+replicative+lifespan+of+murine+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Oxygen sensitivity severely limits the replicative lifespan of murine fibroblasts.</a> Nat Cell Biol. 5 (8), 741-747 (2003).</li>
<li>Jewell, U. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+HIF-1alpha+in+response+to+hypoxia+is+instantaneous%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Induction of HIF-1alpha in response to hypoxia is instantaneous.</a> FASEB J. 15 (7), 1312-1314 (2001).</li>
<li>Newby, D., Marks, L., Lyall, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissolved+oxygen+concentration+in+culture+medium%3A+assumptions+and+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Dissolved oxygen concentration in culture medium: assumptions and pitfalls.</a> Placenta. 26 (4), 353-357 (2005).</li>
<li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li>
<li>Haghighat, A., Mader, S., Pause, A., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repression+of+cap-dependent+translation+by+4E-binding+protein+1%3A+competition+with+p220+for+binding+to+eukaryotic+initiation+factor-4E%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Repression of cap-dependent translation by 4E-binding protein 1: competition with p220 for binding to eukaryotic initiation factor-4E.</a> EMBO J. 14 (22), 5701-5709 (1995).</li>
<li>Pyronnet, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+eukaryotic+translation+initiation+factor+4G+%28eIF4G%29+recruits+mnk1+to+phosphorylate+eIF4E%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Human eukaryotic translation initiation factor 4G (eIF4G) recruits mnk1 to phosphorylate eIF4E.</a> EMBO J. 18 (1), 270-279 (1999).</li>
<li>Okumura, F., Zou, W., Zhang, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ISG15+modification+of+the+eIF4E+cognate+4EHP+enhances+cap+structure-binding+activity+of+4EHP%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">ISG15 modification of the eIF4E cognate 4EHP enhances cap structure-binding activity of 4EHP.</a> Genes Dev. 21 (3), 255-260 (2007).</li>
<li>Kedersha, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+ternary+complex+%28eIF2-GTP-tRNA%28i%29%28Met%29%29-deficient+preinitiation+complexes+are+core+constituents+of+mammalian+stress+granules%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Evidence that ternary complex (eIF2-GTP-tRNA(i)(Met))-deficient preinitiation complexes are core constituents of mammalian stress granules.</a> Mol Biol Cell. 13 (1), 195-210 (2002).</li>
<li>Gu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+structure%2C+mechanism%2C+and+regulation+of+scavenger+mRNA+decapping+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Insights into the structure, mechanism, and regulation of scavenger mRNA decapping activity.</a> Mol Cell. 14 (1), 67-80 (2004).</li>
<li>Szczepaniak, S. A., Zuberek, J., Darzynkiewicz, E., Kufel, J., Jemielity, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity+resins+containing+enzymatically+resistant+mRNA+cap+analogs--a+new+tool+for+the+analysis+of+cap-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Affinity resins containing enzymatically resistant mRNA cap analogs--a new tool for the analysis of cap-binding proteins.</a> RNA. 18 (7), 1421-1432 (2012).</li>
<li>Joshi, B., Cameron, A., Jagus, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+mammalian+eIF4E-family+members%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Characterization of mammalian eIF4E-family members.</a> Eur J Biochem. 271 (11), 2189-2203 (2004).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Fizyolojik oksijen koşullarına maruz insan hücrelerinde kap bağlayıcı proteinlerin analizi, yeni oksijen regüle çeviri başlatma faktörlerinin tanımlanması için izin verir. MRNA veya başka bir kap ile ilişkili proteinlerin hem 5 &#39;başlık için bu faktörlerin afinite m 7&#39;ye olan ilişkilerine gücü ölçülebilir agaroz boncuklar GTP-bağlı. Bu tekniğin bir uyarı proteinlerin post-lisis kapağı bağlama potansiyelini ölçer, ancak, protein-protein etkileşimleri ve post-translasyonel modifikasyonları (PTMS) muhafaz...

Çeviri kontrol özellikle hücresel stres 1 dönemlerde, gen ifadesinin transkripsiyonel düzenlemeye eşit derecede önemli bir adım olarak ortaya çıkmaktadır. Çeviri kontrolünün odak noktası protein sentezi ilk adımları 7-methylguanosine ökaryotik başlatma faktörü 4E (eIF4E) bağlanma içeren başlatılması hız kısıtlayıcı adım (m 7 GTP) mRNA 2 5 &#39;kapak olan . eIF4E eIF4A, bir RNA helikaz ve eIF4G, diğer çeviri faktörleri ve 40S 3 ribozom alımı için gerekli bir iskele protein içerir eIF4F adında bir trimerik kompleksinin bir parçasıdır. Normal fizyolojik şartlar altında, mRNA büyük çoğunluğu bir kapak-bağımlı mekanizma yoluyla çevrilir, hücresel stres dönemlerinde, insan mRNA yaklaşık% 10 1,4 intiation kap bağımsız çeviri izin verebilir 5 &#39;UTRs içerir. Cap-bağımlı çeviri tarihsel eşanlamlı olmuşturous eIF4F ile, ancak, eIF4F stres özgü varyasyonlar eğilimi konu 5-8 haline gelmiştir. Çeşitli hücresel stresler eIF4E aktivite rapamisin kompleksi 1 (mTORC1) memeli hedefin üzerinden bastırılmış neden olur. Bu kinaz hedefleri birinin aktivite artışı ile sonuçlanır stres altında güçleşir, (4E-BP) proteini 4E bağlayıcı değildir. Fosforilatlanmamış 4E-BP eIF4E ve bloklar eIF4G kap bağımlı çeviri 9,10 baskı neden ile etkileşim yeteneğini bağlanır. İlginç bir şekilde, eIF4E2 (veya 4EHP) adı eIF4E bir homologu, belki de stres kaynaklı baskı kaçmasına izin 4E-BP 11 için daha düşük bir afiniteye sahiptir. Gerçekten de, ilk bağlı eIF4G 12 ile etkileşim olmayışı nedeniyle çevrilmesinin bir bastıncısı olarak, özelliği, eIF4E2 hipoksik strese 6,13 sırasında 3 &#39;UTR RNA hipoksiya tepki unsurları içeren mRNA yüzlerce çeviri başlatır. Bu aktivasyon, IeIF4G3, RNA hipoksik eIF4F kompleksi veya eIF4F H 6,13 teşkil protein motifi 4, ve hipoksi indüklenebilir faktör (HIF) 2a bağlayıcı etkileşimler yoluyla elde s. Normal koşullar altında, bir bastıncısı olarak eIF4E2 GIGYF2 ve ZNF598 14 ile bağlanmaktadır. Bu kompleksler, kısmen, Agaroz bağlanmış m 7 GTP afinite reçinesi ile tespit edilmiştir. Bu klasik yöntem 15 çeviri alanında standart ve en iyi ve en yaygın aşağı çekme de kap-bağlama kompleksleri izole etmek için tekniği kullanılmıştır ve in vitro bağlanma deneyleri 16-19 olduğunu. Kap-bağımlı çeviri makine arası değişen parçalar 6-8,13 gibi esnek ve uyarlanabilir ortaya çıkmaktadır olarak, bu yöntem hızla stres yanıtı katılan yeni kap-bağlayıcı proteinlerin tanımlamak için güçlü bir araçtır. Birkaç ökaryot model sistemler stres yanıtları gibi bir eIF4E2 homolog kullanmak göründükleri gibi Dahası, eIF4F değişimleri geniş etkileri olabilirC. thaliana 20 gibi, S. Pombe 21, D 22 melanogaster ve C 23 elegans. Kanıt eIF4F değişiklikler sıkı koşullar stres, ancak normal fizyolojisi 24 dahil olmak sınırlandırılamaz düşündürmektedir. (Mikroelektronlar üzerinden ölçülen) (kılcal uçlarında) ya da dokular içinde dokulara oksijen kaynağı beyindeki 25% 2-6 arasında değişmektedir, akciğerlerde 26% 3-12, bağırsak 27,% 4 in 3,5-6% karaciğer 28, böbrek 29% 7-12, kas 30 içinde% 4 ve kemik iliği 31% 6-7. Hücreler ve mitokondri% 1,3 oksijen 32 daha az içerirler. Bu değerler hücrelerinin rutin olarak kültürlendiği olan çevre havası daha hipoksiye daha yakındırlar. Bu ne daha önce hipoksi özgü hücresel süreçleri fizyolojik bir ortamda ilgili olabileceği gibi düşündüm olduğunu göstermektedir. İlginç bir şekilde, eIF4F ve eIF4F H </sup&gt; aktif fizyolojik oksijen ya da &quot;physioxia&quot; 24 maruz çeşitli insan hücre çizgileri belirgin havuzlar ya da mRNA sınıfları için başlatma katılabilir. Düşük oksijen, aynı zamanda uygun fetal gelişim 33 sürücüler ve hücreler genellikle daha yüksek çoğalma oranları, uzun ömürleri, daha az DNA hasarını ve physioxia 34 daha az genel stres yanıtları var. Bu nedenle, eIF4F lH olasılıkla fizyolojik koşullar altında seçme genin ifadesinde önemli bir faktördür. Burada, sabit fizyolojik oksijen koşullarında veya doku mikroçevrelerde büyük olasılıkla daha fazla temsilcisi olan dinamik bir dalgalanma aralığı kültür hücreleri bir protokol sağlar. Bu yöntemin bir avantajı, hücre hipoksi iş istasyonu içinde lize olmasıdır. Hücre lizizi hipoksik hücre kültüründen geçiş diğer protokollere yapılan ne sıklıkta açık değildir. Hücreler genellikle ilk olarak küçük bir hipoksi inkübatör kaldırılır olmakoksijene hücresel yanıtı (bir ya da iki dakika) 35 hızlı olduğu ön parçalama, ancak oksijen bu poz biyokimyasal yollar etkileyebilir. Bazı kap-bağlayıcı proteinler ikinci bir baz ile etkileşimleri gerektiren veya bu nedenle bazı kapak interaktörler arıtma sürecinde gözden kaçabilir m 7 GTP, hidrolize olabilir. Agaroz bağlanmış enzimatik dayanıklı kap analoglarına Bu protokolde ikame edilebilir. Burada anlatılan yöntemi ile aktivite ve eIF4F H ve eIF4F diğer varyasyonları kompozisyonunu keşfetmek hücreler fizyolojik koşullar ya da stres yanıtları sırasında kullanmak karmaşık gen ifadesi makine ışık tutacaktır.

<table><tbody><tr><td>&gamma;-aminofenil-m7GTP agaroz C10 bağlı boncuklar</td><td>Jena Bioscience</td><td>AC-1555</td><td>Agaroz bağlantılı m7GTP</td></tr><tr><td>100 mm kültür kabı</td><td>Corning</td><td>877222</td><td>10 cm kültür kabı</td></tr><tr><td>150 mm kültür kabı</td><td>Thermofisher</td><td>130183</td><td>15 cm kültür kabı</td></tr><tr><td>AEBSF Hidroklorür</td><td>ACROS Organikler</td><td>A0356829</td><td>AEBSF</td></tr><tr><td>Agaroz Boncuk</td><td>Jena Bioscience&nbsp;</td><td>AC-0015</td><td>Agaroz boncuk kontrolü</td></tr><tr><td>Bromofenol Blue</td><td>Fisher</td><td>BP112-25</td><td>SDS-PAGE yükleme tamponunun bileşeni</td></tr><tr><td>1.5 ml Santrifüj Tüpleri</td><td>FroggaBio</td><td>1210-00S</td><td>Küçük hacimleri santrifüjlemek için kullanılır</td></tr><tr><td>15 ml Konik Santrifüj Tüpleri</td><td>Fisher</td><td>1495970C</td><td>Birincil hücrelerin kültürlenmesinde kullanılır</td></tr><tr><td>Tanımlanmış tripsin inhibitörü</td><td>Fisher</td><td>R007100</td><td>DTI</td></tr><tr><td>Ditiyotreitol</td><td>Fisher</td><td>BP172-25</td><td>DTT</td></tr><tr><td>Epitel hücre ortamı (komple kit)</td><td>ScienCell</td><td>4101</td><td>Serum ve büyüme faktörü takviyeleri içerir)</td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Fisher</td><td>BP229-1</td><td>SDS-PAGE yükleme tamponunun bileşeni</td></tr><tr><td>100 mM Guanozin 5'-trifosfat, 1 ml</td><td>Jena Bioscience</td><td>272076-0251M</td><td>GTP</td></tr><tr><td>HCT116 kolorektal karsinom</td><td>ATCC</td><td>CCL-247</td><td>İnsan kanseri hücre hattı</td></tr><tr><td>İnsan renal proksimal tübüler epitel hücreleri</td><td>ATCC</td><td>PCS-400-010</td><td>HRPTEC</td></tr><tr><td>Hyclone DMEM/Yüksek Glikoz</td><td>GE Yaşam Bilimleri</td><td>SH30022.01</td><td>İnsan hücre kültürü için standart ortam</td></tr><tr><td>Hipklon Penisilin-Streptomisin çözeltisi</td><td>GE Yaşam Bilimleri</td><td>SV30010</td><td>DMEM'in</td></tr> <tr>antibiyotik bileşeni<td>H35 HypOxystation</td><td>Hypoxygen</td><td>N/A</td><td>Hipoksi iş istasyonu</td></tr><tr><td>Igepal CA-630</td><td>MP Biyomedikal</td><td>2198596</td><td>Lizis tamponunun deterjan bileşeni</td></tr><tr><td>Monopotasyum fosfat</td><td>Fisher</td><td>P288-500</td><td>KH2PO4</td></tr><tr><td>Potasyum klorür</td><td>Fisher</td><td>P217-500</td><td>KCl</td></tr><tr><td>Magnezyum klorür</td><td>Fisher</td><td>M33-500</td><td>MgCl2</td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Fisher</td><td>BP358-10</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>Sodyum florür</td><td>Fisher</td><td>5299-100</td><td>NaF (lizis tamponunun fosfataz inhibitörü bileşeni)</td></tr> <tr><td>Disodyum fosfat</td><td>Fisher</td><td>5369-500</td><td>Na2HPO4</td></tr><tr><td>Premium Sınıf Fetal Sığır Serumu</td><td>Seradigm</td><td>1500-500</td><td>FBS</td></tr><tr><td>Proteaz İnhibitörü Kokteyli (100x)</td> <td>Hücre Sinyalizasyonu</td><td>58715</td><td>Lizis tamponunun bileşeni</td></tr><tr><td>Sodyum Dodesil Sülfat</td><td>Fisher</td><td>BP166-100</td><td>SDS</td></tr><tr><td>Sodyum Ortovanadat</td><td>Sigma</td><td>56508</td><td>Na3VO4</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher</td><td>BP152-5</td><td>Tamponların bileşeni</td></tr><tr><td>% 0.05 Tripsin-EDTA (1x)</td> <td>Life Technologies</td><td>2500-067</td><td>Tripsin yapışkan hücreleri ayırmak için kullanılır</td></tr></tbody></table>

fizyolojik oksijen koşullarına maruz İnsan hücrelerinde cap-bağlayıcı proteinlerin analizi

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

Translasyonel kontrol, özellikle hücresel stres dönemlerinde gen düzenlemesinin odak noktasıdır. eIF4F kompleksi aracılığıyla kap bağımlı translasyon, ökaryotik hücrelerde protein sentezini başlatmak için açık ara en yaygın yoldur, ancak bu kompleksin strese özgü varyasyonları şimdi ortaya çıkmaktadır. Kapak bağlayıcı proteinlerin, Agaroz'a bağlı m7GTP'den (bir 5' mRNA kapak analogu) oluşan bir afinite reçinesi ile saflaştırılması, translasyon başlatmanın düzenlenmesinde yer alan faktörleri tanımlamak için yararlı bir araçtır. Hipoksi (düşük oksijen), fetal gelişim ve tümör ilerlemesi sırasında karşılaşılan hücresel bir strestir ve büyük ölçüde translasyon regülasyonuna bağlıdır. Ayrıca, yakın zamanda, insan yetişkin organlarının, hücrelerin rutin olarak kültürlendiği ortam havasından hipoksiye daha yakın olan daha düşük bir oksijen içeriğine (fizyoksi% 1-9 oksijen) sahip olduğu bildirilmiştir. Hipoksik bir eIF4F kompleksinin (eIF4FH) devam eden karakterizasyonu ile, 5' mRNA başlığı aracılığıyla oksijene bağlı translasyon başlangıcını anlamaya yönelik artan bir ilgi vardır. Yakın zamanda, oksijen mevcudiyeti ile düzenlenen kapak bağlayıcı proteinleri analiz etmek için bir insan hücre kültürü yöntemi geliştirdik. Bu protokol, oksijene maruz kalmayı ortadan kaldırmak için hücre kültürü ve lizisin bir hipoksi iş istasyonunda gerçekleştirilmesini vurgular. Sıvı ortamın iş istasyonu içindeki atmosferle dengelenmesi için hücrelerin en az 24 saat inkübe edilmesi gerekir. Bu sınırlamayı önlemek için, daha kısa zaman noktaları gerekiyorsa hücrelere önceden koşullandırılmış ortam (oksijeni alınmış) eklenebilir. Bazı kapak bağlayıcı proteinler, ikinci bir baz ile etkileşimler gerektirir veya m7GTP'yi hidrolize edebilir, bu nedenle saflaştırma işleminde bazı kapak interaktörleri gözden kaçabilir. Enzimatik olarak dirençli kapak analoglarına bağlı agaroz bu protokolde ikame edilebilir. Bu yöntem, kullanıcının kapağa bağlı çeviride yer alan yeni oksijen regüle çeviri faktörlerini tanımlamasına olanak tanır.

Bir m 7 GTP Affinity Sütun içinde eIF4E ve eIF4E2 ve Oksijen Cevabı Cap-bağlama yeteneği analizi 1. Şekil 2, iki insan hücre çizgileri oksijen dalgalanmalara tepki olarak iki ana kap bağlayıcı proteinler tipik m 7 GTP afinite saflaştırma western lekelerinin temsil etmektedir: F ŞEKIL 1 ve kolorektal karsinom primer insan renal proksimal tübüler epitelyel hüc...

Burada, fizyolojik oksijen koşulları sırasında mRNA'nın 5' başlığını bağlayan translasyon başlatma faktörlerini analiz etmek için insan hücre kültürü protokollerini sunuyoruz. Bu yöntem, Agaroz bağlantılı bir m7GTP başlık analoğu kullanır ve kapak bağlama faktörlerini ve bunların etkileşen ortaklarını araştırmak için uygundur.

Fizyolojik Oksijen Koşullarına Maruz İnsan hücrelerinde Cap-bağlayıcı proteinlerin analizi

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

Bu deneyin genel amacı, düşük oksijen koşullarında kapak bağlayıcı proteinleri yakalamaktır. Bu yöntem, kapak bağlama faktörlerini ve bunların etkileşen ortaklarını araştırmak için agaroza bağlı yedi metil-guanozin başlık analoğu kullanır. Bu yöntem, kapsüle bağlı translasyonda yer alan yeni oksijen regüle faktörlerin tanımlanması gibi protein sentezi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olacaktır.Bu tekniğin temel avantajı, hücrelerin lizis noktasına kadar bir hipoksi iş istasyonunda tutulmasıdır. Bu tekniğin etkileri kanser tedavisine kadar uzanır, çünkü bir tümör içindeki kanser hücreleri çok düşük oksijen seviyelerine maruz kalır ve translasyonel kontrol tümör ilerlemesinde önemli bir rol oynar. Bu yöntem için ilk olarak, Corona'nın meslektaşlarının doku oksijenasyonunun, hücrelerin rutin olarak kültürlendiği normaxiadan ziyade hipoksi dediğimiz şeye daha yakın olduğunu bildiren yakın tarihli bir yayını okuduğumuzda aklımıza geldi.Bu prosedüre başlayın, metin protokolünde açıklandığı gibi hücre kültürü olacaktır. Hücreleri bir hemositometre kullanarak saydıktan sonra, santimetre kare başına 2500 ila 5000 hücre yoğunluğu elde etmek için 15 mililitre tam ortam içeren 150 milimetre kültürlü kapları besleyin. Her kapak bağlama testi için iki adet 150 milimetrelik tabak kullanın.Tohumlanmış kültür kaplarını 37 santigrat derecede ve yüzde beş karbondioksit atmosferinde inkübatöre yerleştirin. Hücreler en az 24 saat inkübe edildikten sonra, hücreleri istenen süre boyunca bir hipoksi iş istasyonuna yerleştirin. Ardından, iş istasyonunu uygun fizyolojiye ayarlayın.Bir X fosfat tamponlu salin veya PBS ve tripsini 37 santigrat derece su banyosunda 30 dakika önceden ısıtın. Gerçekleştirilen her kapak bağlama testi için 980 mikrolitre lizis tamponunu 1.5 mikrolitrelik bir santrifüj tüpüne alıkoyun. 10 mikrolitre 100X proteaz inhibitör kokteyli ve 10 mikrolitre 4-benzensülfonil florür hidroklorid, buz üzerinde 980 mikrolitre lizis tamponuna.Her 150 milimetrelik çanaktaki medyayı hipoksi iş istasyonundaki bir atık kabına atın. Ardından, hücreleri üç ila dört mililitre ılık bir X PBS ile yıkayın ve sıvıyı atın. Her yemeğe bir mililitre ılık yüzde 05 tripsin EDTA ekleyin ve bulaşıkları iki dakika veya hücreler artık tabağa yapışmayana kadar bekletin.Bir pipet kullanarak, bir plakanın hücrelerini 1,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Her bir hücre plakasının ayrı bir 1.5 mililitrelik mikro santrifüj tüpüne aktarılması için gerektiği kadar tekrarlayın. Hücreleri peletlemek için mikro santrifüj tüplerini 6000 kez g'de 90 saniye santrifüjleyin.Santrifüjlemeyi takiben, peleti bozmadan bir pipet kullanarak tripsini aspire edin. 200 mikrolitre PBS'yi peletin hemen üzerindeki tüpe nazikçe pipetleyerek hücreleri ılık bir X PBS ile yıkayın. Ardından peleti bozmadan PBS'yi aspire edin.Daha sonra, bir mililitre hazırlanmış lizis tampon çözeltisinden 500 mikrolitreyi ilk hücresel pelet üzerine pipetleyin. Yukarı ve aşağı pipetleyerek peleti tamamen yeniden süspanse edin. Yeniden süspanse edilmiş hücreleri ikinci hücre peleti ile birleştirin ve ikinci peleti yukarı ve aşağı pipetleyerek yeniden süspanse edin.Her numune için tüm peletler birleştirilene ve yeniden askıya alınana kadar bu işlemi tekrarlayın. Daha sonra, lizatı 1.5 litrelik bir mikro santrifüj tüpünde kalan 500 mikrolitre lizis tamponu ile birleştirin. Numuneleri hipoksi iş istasyonundan çıkarın.Numuneleri 1,5 ila iki saat boyunca dört derece santipus'ta döndürerek hafif çalkalama kullanarak hücreleri parçalayın. İnkübasyondan sonra, hücresel kalıntıları gidermek için parçalanmış hücreleri 1200 kez g'de dört santigrat derecede 15 dakika santrifüjleyin. Lizatı yeni bir 1.5 mililitrelik mikro santrifüj tüpüne aktarın ve peleti atın.Western blot analizi için tüm hücre lizat giriş kontrolü olarak kullanılmak üzere süpernatantın bir kısmını ayırın. Kapak bağlama testine hazırlanmak için, boncuk bulamacının toplanmasını kolaylaştırmak için pipetin ucunu çıkarmak için makas kullanın. Her numune için, 50 mikrolitre boş agaroz boncuk kontrol bulamacını ve 50 mikrolitre m7GTP agaroz C10 bağlantılı boncuk bulamacını 1.5 mililitrelik mikro santrifüj tüplerine aktarın.Ardından, bulamacı 30 saniye boyunca 500 kez g'da santrifüjleyerek boncukları peletleyin. Süpernatanı dikkatlice çıkarın ve boncukları 500 mikrolitre TBS'de tekrar askıya alın. Bu adımları tekrarladıktan sonra, boncukları 30 saniye boyunca 500 kez g pelet haline getirin ve süpernatanı çıkarın.Daha sonra, lizatı içeren süpernatanı, boş agaroz boncuklarını içeren 1.5 mililitrelik mikro santrifüj tüpüne aktarın. Hafif çalkalama ile dört santigrat derecede 10 dakika inkübe edin. 10 dakika sonra, boş agaroz boncuklarını 30 saniye boyunca 500 kez g'de santrifüjleyerek peletleyin.Santrifüjlemeyi takiben, boncuklara bağlanmayan lizatı, m7GTP agaroz C10'a bağlı boncukları içeren 1,5 mililitrelik mikro santrifüj tüpüne aktarın. Boncukları 500 mikrolitre lizis tamponunda yeniden süspanse ederek, boncukları 30 saniye boyunca 500 zaman g'da santrifüjleyerek ve süpernatanı atarak boş agaroz boncukları yıkayın. Toplam beş yıkama için bunu dört kez tekrarlayın.Boş agaroz boncuklarını bir X SDS-PAGE numune tamponunda yeniden askıya alın. Ve boncukları 95 santigrat derecede 90 saniye kaynatın. Numuneyi 20 santigrat derecede saklayın, hava durumunu gözlemlemek için gelecekteki western blot analizi için, ilgilenilen protein boncuklara spesifik olmayan bir şekilde bağlanır.Lizatı, kapak bağlayıcı proteinleri yakalamak için dört derece celsuis'te bir saat boyunca hafif çalkalama ile m7GTP agaroz C10 bağlantılı boncuklarla inkübe edin. Çalkalamayı takiben, m7GTP agaroz C10 bağlantılı boncukları 30 saniye boyunca 500 kez g'de santrifüjleyerek peletleyin. Süpernatanı attıktan sonra, m7GTP agaroz C10 bağlantılı boncukları daha önce olduğu gibi yıkayın.Boncukları 600 mikrolitre lizis tamponunda tekrar süspanse edin ve GTP'yi bir milimolar nihai konsantrasyona ekleyin. M7GTP agaroz C10 bağlantılı boncukları ve bir milimolar GTP'yi dört santigrat derecede bir saat boyunca hafif çalkalama ile inkübe edin. Bu, m7GTP ile spesifik olmayan bir şekilde etkileşime giren proteinleri ayrıştıracaktır.M7GTP agaroz C10 bağlantılı boncukları 500 zaman g'da 30 saniye santrifüjleyerek peletleyin. Süpernatanı yeni bir 1,5 mililitrelik mikro santrifüj tüpüne aktarın ve 200 mikrolitre dört X SDS-PAGE numune tamponu ekleyin. Boncukları daha önce olduğu gibi yıkadıktan sonra, boncukları bir X SDS-PAGE numune tamponunda tekrar süspanse edin ve 95 santigrat derecede 90 saniye kaynatın.Burada, primer insan renal proksimal tübül epitel hücrelerindeki oksijen dalgalanmalarına yanıt olarak iki ana kap bağlayıcı proteinin tipik bir m7GTP afinite saflaştırmasının temsili western lekeleri gösterilmektedir. Hücre lizatları 24 saat boyunca yüzde sekiz, yüzde beş, yüzde üç veya yüzde bir oksijene maruz bırakıldı. Şeritler, girdi olarak tüm hücre lizatının yüzde 10'unu, m7GTP'nin özgüllüğünü ölçmek için yıkanmış bir GTP'yi ve GTP yıkamasından sonra m7GTP boncuklarına bağlanan proteinleri içerir.En az üç bağımsız deneyden elde edilen veriler, Görüntü J ile ölçüldü ve tüm hücre lizatının yüzde 10'luk girdisine göre nispi yoğunluk birimleri olarak ifade edildi. Sonuçlar, fizyolojik oksijen altında kültürlenen insan hücrelerinin, translasyon için farklı mRNA'ları işe almak için iki kapak bağlayıcı protein kullandığını göstermektedir. Bu videoyu izledikten sonra, düşük oksijen koşullarında kapak bağlayıcı proteinlerin nasıl yakalanacağını iyi anlamış olmalısınız.Bu prosedürü denerken, hücreleri hipoksi iş istasyonunda lizis noktasına kadar tutmayı hatırlamak önemlidir, çünkü oksijen bu translasyon başlatma faktörlerinin biyokimyasal özelliklerini hızla değiştirebilir. Bu prosedürü takiben, düşük oksijen koşulları altında hangi kapak bağlayıcı proteinlerin aktif translasyon ile ilişkili olduğu gibi ek soruları yanıtlamak için polizom fraksiyonasyonu gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir.

analysis-cap-binding-proteins-human-cells-exposed-to-physiological

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Söz konusu modelde oksidatif fosforilasyon analizi ile birlikte Saponin-permeabilize elyaf hazırlama, mitokondriyal fonksiyon bütünleştirici değerlendirme sağlar. Mitokondriyal solunum fizyolojik ve patolojik durumlar mitokondriyal etkileşimleri, morfolojisi ve biyokimya da dahil olmak üzere çeşitli düzenleyici etkileri yansıtabilir.

Söz konusu modelde Saponin permeabilize Kardiyak Elyaf Oksidatif Fosforilasyon Değerlendirmesi

Burada kültürlerin hipoksik durumunu değerlendirmek için, hücre kültürleri ve basit testler hipoksi ikna etmek için basit yöntemler öneriyoruz.

Hücre Kültürü ve Hipoksi Test İndüksiyon

Kaynak:Elettra Leo1, Luiza H.D. Cardoso1, Sabine Schmitt1, Erich Gnaiger11Oroboros EnstrümanlarıBu video, canlı ve geçirgen memeli hücrelerinde mitokondriyal solunumu değerlendirmek için oksijen akışının nasıl kullanıldığını açıklamaktadır. Farklı solunum durumlarını karakterize etmek için digitonin, metabolik substratlar, ADP, bir ayırıcı ve bir inhibitörün sıralı kullanımını gösterir. Ortaya çıkan oksijen akışı profili, tanımlanmış koşullar altında mitokondriyal fonksiyonu ve enerji...

Canlı ve geçirgen hücrelerde mitokondriyal solunumu değerlendirmek için oksijen akısı ölçümleri

Bu görüntüleme kullanılarak hipoksi küresel RNA sentez analizi için bir tekniği açıklar. RNA tıklayın-kimya etiketleme önceden hipoksi altında gerçekleştirilen ve tek hücre düzeyinde küresel RNA değişikliklerin görselleştirme sağlar olmamıştır. Bu yaklaşım, küresel RNA sentezinde hücreden hücreye değişiklik doğrudan görselleştirme sağlayan, mevcut ortalama RNA tekniklerinin tamamlar.

Ününüz Aşağıdaki Tek Hücre Düzeyinde Küresel RNA Sentezi Analizi

Burada bir co-immunoprecipitation protokol hipoksik koşullarda endojen nükleer proteinler arasındaki protein-protein etkileşimler çalışmaya açıklar. Bu yöntem gösteri transkripsiyon faktörleri ve hipoksi, transkripsiyon Co düzenleyiciler arasındaki etkileşimler için uygundur.

Co-immunoprecipitation tahlil hipoksik koşullarda kültürlü hücrelerden endojen nükleer proteinler kullanarak

Biz insan makrofajlar proteomik imzaları elde edilir ve bu düşük oksijen çevre makrofaj polarizasyon üzerindeki etkisinin belirlenmesi için geçerli bir iletişim kuralı mevcut.

Düşük oksijen ortamı altında insan makrofaj polarizasyon proteomik analizi

Burada, kalp duvarında emici spektroskopisi gerçekleştirmek için perfkullanılmış kalplerinde intra ventrikül optik kateter kullanmanın bir yöntemini tanıtıyoruz. Elde edilen veriler, doku oksijen geriliminin yanı sıra substrat kullanımı ve membran potansiyeli ile aynı anda bu her yerde yapılan hazırlıkta kardiyak performans önlemleri ile ilgili güçlü bilgiler sağlar.

Perfkullanılmış Mammalin kalpleri transmural absorbance spektroskopisi kullanarak hücresel metabolizmayı Izleme için kalp içi yan ateş ışık kateter

Burada, memeli hücrelerinde moleküler oksijen tüketme yeteneklerinden bağımsız olarak mitokondriyal fonksiyonu doğrudan ölçmek için bir tahlil derlemesi sunuyoruz.

Memelilerde Mitokondriyal Fonksiyonu Ölçmek için Oksijenden Bağımsız Tahliller

Bu protokol, oksijen teslimatı için tasarlanmış hiyerarşik olarak gözenekli UiO-66 nanopartiküllerinin sentezini, hemoglobin kapsüllenmesini ve yüzey PEGilasyonunu detaylandırır. Bu yöntem, kusur mühendisliğini zorlanma destekli biortogonal konjugasyon ile birleştirerek biyomedikal uygulamalara uygun yüksek geçirgenlikli ve fizyolojik olarak stabil taşıyıcılar üretir.

Hiyerarşik olarak gözenekli UiO-66 nanopartiküllerinde oksijen dağıtımı uygulamaları için sentez, hemoglobin kapsülasyonu ve biortogonal PEGilasyon

Bu protokol, etkili bir şekilde, taze izole edilmiş beşeri villöz sitotrofoblastlar siRNA transfekte gözeneklendirilmesinin kullanılarak bu hücrelerde DNA-protein kompleksleri tanımlanması için bir yöntem tarif eder. Transfekte edilen hücreler, Western Blot ile izlenebilir ve EMSA 4-günlük kültür döneminde analiz eder.

Taze izole edilmiş insan Villöz sitotrofoblastlar ilgili siRNA transfeksiyonu ve EMSA analizi

Keşfedin, agaroz bağlı m7GTP kap analogu kullanarak hipoksik koşullarda insan hücrelerinde kap-bağlayıcı proteinleri yakalama yöntemini. Bu teknik, kanser biyolojisinde çeviri kontrolünü anlamak için yeni oksijen düzenlenmiş faktörleri belirlemeye yardımcı olur.

Fizyolojik Oksijen Koşullarına Maruz İnsan hücrelerinde Cap-bağlayıcı proteinlerin analizi

Daha fazla video keşfet