Basit Bir adım Yetişkin Tüm montaj Hazırlama Diseksiyon Protokolü Drosophila Brain

Bu protokolün genel amacı, yetişkin Drosophila beyinleri için basit bir adımlı diseksiyon prosedürünü tanımlamaktır, bu da tüm montaj analizi için uygun iyi korunmuş morfolojiye sahip beyinleri hızlı bir şekilde üretebilir. Bu yöntem, sinirbilim ve genetik alanlarındaki soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu, beyin devrelerinin ince haritalandırılmasını, nöronların genetik manipülasyonlarının etkilerinin incelenmesini ve genlerin fonksiyonel karakterizasyonunu içerir.

Bu tekniğin temel avantajı, öğrenmesi kolay bir prosedür içermesidir. İyi korunmuş morfolojiye sahip yetişkin bir sinek beynini 10 saniyeden daha kısa sürede incelemeyi kolaylaştırabilir. Bu yöntemin video gösterimi çok önemlidir, çünkü sinek kafasını çevreleyen dış iskeleti koparmak için forsepsleri serbest bırakırken gerekli momentumu kontrol etmek beceri ve pratik gerektirir.

Bu küçük, sinir bozucu meyve sinekleri bize biyolojik ilkeler hakkında çok şey öğretti. Ayrıca Alzheimer hastalığı ve Parkinson hastalığı gibi insan hastalıklarının nedenlerini ve tedavilerini bulmamıza da yardımcı olabilirler. 1.2 X büyütmeye ayarlanmış bir diseksiyon mikroskobu kullanarak, anestezi uygulanmış bir sineği hareketsiz hale getirin ve karın yukarı bakacak şekilde soğuk diseksiyon solüsyonuna daldırın.

Forsepsleri diseksiyon plakasına göre 160 ila 170 derecelik bir açıda tutun ve ardından sineğin karnına küçük bir kuvvet uygulayın. Bu, sineği hareketsiz hale getirmeli, başı 15 ila 25 derece geriye doğru zorlamalı ve hortumu yukarı doğru uzatmalıdır. Bu manevradan sonra, hortumun altındaki kütikülün yumuşak yarı saydam bir bölgesi belirginleşmelidir.

Büyütmeyi artırın ve odak düzlemini bu bölgeye ayarlayın. Baskın eli kullanarak, bir çift diseksiyon forseps alın ve uçları kapatmak için baskı uygulayın. Forsepsleri, sineği kısıtlayan forsepslere dik olarak yerleştirin.

Forsepsin kapalı uçlarını, kütikülün yumuşak yarı saydam bölgesinden delin, beyne değecek kadar derine nüfuz etmemeye dikkat edin. Sonra hızlı bir şekilde, ama istikrarlı bir şekilde, forsepsleri serbest bırakın, böylece noktalar açılır ve sinek kafasının dış iskeletini koparır. Dış iskeleti ve baş kılıfıyla ilişkili göz ve trakeanın çoğunu beyin dokusundan tek bir hareketle nazikçe çıkarmak için forseps uçlarının serbest bırakılmasından elde edilen momentumu kullanın.

Sağlam bir beyin artık görünür olmalıdır. Forsepsleri kullanarak, beyaz fibröz trakeal doku gibi kalan aksesuar dokuları, beyni uygun şekilde çekmemeye veya zarar vermemeye dikkat ederek dikkatlice çıkarın. Disseke edilmiş beyin örneklerini ilişkili gövdelerle birlikte 40 ila 60 dakika boyunca buz üzerinde yaklaşık bir mililitre% 4 paraformaldehit içine yerleştirin.

Paraformaldehiti çıkarın ve ardından beyinleri aspire etmemeye dikkat ederek çözeltiyi üç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek numuneleri bir mililitre bir X PBS ile durulayın. Daha sonra, PBS'yi çıkarın ve ardından her biri beş dakika boyunca bir mililitre bir X PBT ile beş kez nütasyon ile yıkayın. Uygun seyreltmede ilgilenilen birincil antikoru ekleyin.

Daha sonra numuneleri gece boyunca dört santigrat derecede nütasyon ile inkübe edin. Birincil antikoru çıkarın ve numuneleri bir mililitre bir X PBT ile beş kez yıkayın, her yıkamada beş ila 10 dakika boyunca nütasyon ile yıkayın. Yıkanmış örneklere uygun seyreltme ve inkübasyon süresinde ikincil antikor ekleyin.

Bunu takiben, numuneleri altı kez bir mililitre bir X PBT'de 10 dakika boyunca her biri nütasyon ile yıkayın. Bu adım, spesifik olarak bağlanmamış herhangi bir ikincil antikoru çıkarmak için kritik öneme sahiptir. Numuneleri, mililitre DAPI başına bir miligram bir ila 10.000 seyreltmede, bir mililitre bir X PBT çözeltisinde 30 ila 60 dakika boyunca nütasyon ile inkübe edin.

Son olarak, bir mililitre bir X PBS ekleyerek ve ardından çözeltiyi üç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek numuneleri durulayın. Bir montaj kızağına bir kapak sürgüsü yerleştirin. Kesik uçlu bir pipet kullanarak, beyinleri bir X PBS solüsyonunda lamel üzerine aktarın.

Sonra, forseps kullanarak beyinleri vücutlardan ayırın. Beyin dokusunun etrafındaki sıvıyı çıkarmak için ince bir pipet ucu kullanın. Ardından, 20 ila 40 mikrolitre solmaya karşı dayanıklı montaj ortamı ekleyin.

Viskoz ortamı dışa doğru değiştirirken beyinleri nazikçe yayın. Bir taraftan başlayarak, beynin baloncuklarla temasını en aza indirmeye özen göstererek numunelerin üzerine ikinci bir lamel yavaşça indirin. Fişlerin çökmesine izin verin ve ardından bir laboratuvar mendili kullanarak fişlerin kenarındaki fazla sıvıyı çıkarın.

Lamel çiftini geçici olarak montaj kızağına takmak için küçük bir bant parçası kullanın. Numuneleri görüntülemek için bileşik bir floresan veya konfokal mikroskop kullanın. Bu görüntüler aynı yetişkin Drosophila'nın ön ve arka görünümlerini göstermektedir.

Hücre çekirdekleri DAPI boyama ile görüntülendi ve nöronlar bir pan nöronal markör ve anti-ELAV antikorları kullanılarak işaretlendi. Dopaminerjik veya DA nöronları, anti-TH antikor boyası ile ortaya çıkarıldı. Tüm görüntü kanalları için beynin her iki tarafı arasında benzer yoğunluk seviyeleri görüldü.

Beynin ön ve arka kısımlarının büyütülmüş görünümleri, DA nöronal kümelerinin ayrıntılı olarak incelenmesine olanak tanır. Eşleştirilmiş anterior medial küme anterior görüntülerde, eşleştirilmiş posterior medial ve eşleştirilmiş posterior lateral kümeler ise beynin arka tarafında görülebilir. Bu nöronların nicelleştirilmesi, üç günlük erkek w1118 suş sineklerinin tipik olarak tüm beyindeki PPM kümesinde 27 DA nöronuna, yarım küre başına PPL kümesinde 16 ve yarım küre başına PAL kümesinde beş DA nöronuna sahip olduğunu ortaya koydu.

PAM clusters. 3D her birinde ortalama 97 DA nöronu görüldü PAL ve PAM kümelerinin rekonstrüksiyonu, PAM kümesindeki DA nöronlarının, PAL gibi diğer kümelerdekilere göre nispeten küçük boyutlara ve daha zayıf TH lekelenmesine sahip olduğunu gösterdi. Giderek artan bir şekilde, daha fazla çalışma, daha yüksek beyin fonksiyonlarının altında yatan moleküler yolları ve nöronal devreleri incelemek ve insan beyni hastalıklarını modellemek için yetişkin sinek beyinlerine odaklanmaktadır.

Bu tür beyin temelli çalışmalarda, iyi korunmuş morfolojiye sahip beyin örneklerinin verimli bir şekilde hazırlanması gerekecektir. Bu, özellikle büyük ölçekli beyin tabanlı ekranlarda önemli olabilir. Bu yöntem için ilk olarak forsepste sinek tutmak için mücadele ederken aklıma geldi.

Çoğu Drosophila araştırmacısının kullandığı keskin uçlu forseps yerine, Shebna künt uçlu forsepsleri denedi ve beyinleri incelemenin daha kolay olduğunu buldu. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde yapılırsa 10 saniyeden daha kısa sürede yapılabilir. Bir keresinde, sadece bir günde bir deney için altı farklı genotipten yaklaşık 100 beyni inceledim.

Bu diseksiyon prosedürü basit görünse de, önce dağıtılabilir sineklerle pratik yapmak önemlidir. Araştırmacı ayrıca sinek beynini tahrip etmeden forsepsleri konumlandırmakla da mücadele edebilir. Diseke edilen beyinler, RNA, in situ hibridizasyon ve beyin dokusundan protein ve RNA örneğinin çıkarılması gibi diğer çalışmalar için kullanılabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, iyi korunmuş morfolojiye sahip sinek beyinlerini inceleyebilmelisiniz. Bu prosedürü daha basit ve daha hızlı hale getirmek için iyileştirmelerin geliştirilebileceğini tahmin ediyoruz. Bu, gelecekte büyük ölçekli çalışmalar için potansiyel olarak otomatik hale gelebilir.

Paraformaldehit ve keskin diseksiyon forsepsleri ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini unutmayın. Sabitleyici solüsyonları kullanırken eldiven giymek gibi önlemler alın ve diseksiyon tamamlandıktan hemen sonra forsepsleri bir kenara koymadan önce kapatın.