Yüksek çözünürlüklü tek hücre türleri morfoloji ve Glia Drosophila içinde etkileşimlerin hücre çalışmaya uygulama çok renkli FlpOut tekniği

Bu tekniğin genel amacı, karmaşık anatomik dokulardaki tek hücre morfolojilerini görselleştirmek ve böylece Drosophila'da hücre hücresi etkileşiminin incelenmesini basitleştirmektir. Bu yöntem, meyve sineğini kullanarak karmaşık morfolojiler ve hücre hücresi etkileşimleri ile ilgili temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, herhangi bir dokuda ve herhangi bir gelişim aşamasında tek hücre morfolojilerinin çalışmasına uyarlanabilmesidir.

Prosedürü göstermek, laboratuvarımızda bir teknisyen olan Anja Kieser olacaktır. MCFO tekniği, standart FlpOut tekniğini aşağıdaki gibi değiştirir. Bir ısı şoku FLP rekombinazı ve farklı muhabirler UAS kontrolü altında kalır, ancak her muhabirin, bir epitop etiketinin kopyalarının eklendiği miristoillenmiş bir süper klasör GFP'nin ortak bir omurgası vardır.

Elde edilen floresan olmayan proteinler spagetti canavarı GFP'leri olarak adlandırılır ve antikorlarla tanımlanır. Eksizyon sayısına bağlı olarak, farklı bir epitop kombinasyonu ifade edilir. HSP promotörü 25 santigrat derecede biraz aktif olduğundan, gerçekten aktif olmadığı 18 santigrat derecede haçlar ayarlayın.

Ardından, F1 neslini elde etmek için yaklaşık 20 gün bekleyin. F1 dişilerini ve erkeklerini ayrı şişelere ayırın. Onları ısı şoku vermek için, önce üç ila dört günlük olduklarında taze gıda şişelerine aktarın.

Genç sinekler ısı şokuna karşı çok hassas olabilir. Ardından, şişeleri 37 santigrat derecelik bir su banyosuna aktarın. Homojen bir ısı şoku sağlamak için derine daldırın.

Glial hücrelerin seyrek etiketlenmesi için, beş ila sekiz dakikalık ısı şoku ile başlayın ve ardından optimize edin. Optimum ısı şoku süresi, hedef hücreleri seyrek olarak etiketleyecektir ve ilişkisi, kullanılan belirli GAL4 sürücüsüne bağlıdır. Isı şokundan sonra, şişeleri soğutmak için birkaç dakika tezgahın üzerine yatay olarak koyun.

Şimdi, sinekleri aynı şişelerde 25 santigrat derecede tutmaya başlayın. İki gün sonra, muhabir ifadesi optimal olacak ve sinekler disseke edilebilir. Hazırlık olarak, buzun üzerine üç derin çöküntü kuyusu koyun.

Bir kuyuyu% 70 etanol, birini PBS ve birini S2 hücre kültürü ortamı ile doldurun. Ardından, soğuk S2 ile siyah silikonla kaplı üç santimetrelik bir diseksiyon kabı yükleyin. Dokuları sağlıklı tutmak için tüm diseksiyonları S2'de gerçekleştirin. Şimdi, sinekleri karbondioksit ile uyuşturun.

Daha sonra, forseps veya bir tüy kullanarak, sinekleri yaklaşık 30 saniye boyunca soğuk% 70 etanole, ardından yaklaşık 30 saniye boyunca soğuk PBS'ye koyun ve ardından soğuk S2'ye aktarın. Böylece, disseke edilecek tüm sinekleri yıkayın. Bir genotipten 10 sinek genellikle yeterlidir. Şimdi, 30 dakika içinde, tüm beyinleri inceleyin.

İlk olarak, kafayı vücudun geri kalanından ayırın ve vücudu atın. Tüm diseksiyon boyunca başınızı kapalı elinizle tutun, aksi takdirde onu yeniden kavramak çok zor olacaktır. Ardından, retinanın hemen altındaki dokuyu kavrayarak bir gözünüzü dışarı çekin.

Sonra diğer gözü çekin ve böylece beyni ve çevresindeki dokuları açığa çıkarın. Ardından, beyin dokusu temiz görünene kadar beynin etrafındaki tüm trakeal dokuyu ve kalan kütikülü çıkarın. Optimal boyama sonuçları için tüm trakea dokusu çıkarılmalıdır.

Beyni fiksasyona hazırlamak için gereken tek şey budur. Diseke edilmiş beyinleri soğuk S2'de tutarken tüm beyinleri parçalara ayırmaya devam edin. Optimum boyama için mikrosantrifüj tüpü başına 10'a kadar beyin hazırlamaya çalışın. İzole edilmiş beyinleri bir P10 pipet ucu kullanarak fiksatif solüsyon içeren 200 mikrolitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.

Beyinleri asla forseps kullanarak tutmayın. Işıktan korunan dokuları inkübe edin. Çözelti transferleri sırasında beyinleri aspire etmekten kaçının.

Fiksatifi çıkarmak için, yıkama solüsyonu ile üç veya daha fazla 15 dakikalık yıkama kullanın. Daha sonra dokuları 30 dakika veya daha uzun süre bloke edici solüsyonla bloke edin. Daha sonra, bloke etme solüsyonunu yıkama solüsyonunda seyreltilmiş primer antikorlarla değiştirin ve beyinleri gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.

Birincil antikorları çıkarmak için, yıkama solüsyonunda üç adet bir saatlik yıkama kullanın. Daha sonra, yıkama çözeltisine ikincil florofor konjuge antikorları ekleyin ve beyinleri gece boyunca dört santigrat derecede veya oda sıcaklığında dört saat boyunca inkübe edin. Bağlanmamış antikorları tamamen yıkamak için, yıkama solüsyonunda bir saatlik üç yıkama ve ardından PBS ile daha uzun bir yıkama yapın.

Sonra beyinleri monte edin. Hayal eden bir ara parça ile iki kapak fişi hazırlayın. Ara parçaya ve ekstra kapak kızağında, solmaya karşı önleyici bir madde ile 10 mikrolitre montaj ortamı uygulayın.

Daha sonra, bir P10 pipeti kullanarak, beyinleri kapak fişine aktarın ve bunları bir miktar PBS ile birlikte ortamın yanına bırakın. Dokunun kurumasına izin vermeyin. Şimdi, beyinleri pipeti kullanarak dikkatlice montaj ortamına taşıyın ve son olarak onları ara parçadaki ortama taşıyın ve forseps ile düzenleyin.

Ardından, ara parçalardaki yapışkan astarı çıkarın ve bir kapak fişi takın. Kapak kızağını forseps kullanarak biraz bastırarak sabitleyin ve hemen görüntülemeye devam edin veya slaytları daha sonra analiz etmek üzere eksi 20 santigrat derecede saklayın. Açıklanan yöntemler kullanılarak, üç farklı membran etiketli raportör, FRT bölgeleri ile çevrili transkripsiyonel sonlandırıcılar tarafından sessiz tutulur.

Hayvanlar ısı şoku verildiğinde, FLP rekombinaz eksprese edildi ve sonlandırıcılar rastgele çıkarıldı, bu da farklı raportör kombinasyonlarının ifadesine yol açtı. Genel olarak, farklı raportör kombinasyonları yedi farklı renk sağlar, bu nedenle çoklu tek hücre morfolojileri ayrı ayrı görselleştirilebilir ve incelenebilir. EG-GAL4 ve ALG-GAL4 ile çeşitli ısı şoku süreleri test edildi.

Tek hücre etiketlemesi beynin anten lob bölgesinde analiz edildi. EG-GAL4 sürücüsü, tümü anten lobunun yüzeyinde kaplanmış olan glial hücrelerin kılıflanmasında ifade edildi. Karşılaştırıldığında, ALG-GAL4 tarafından hedeflenen astrosit benzeri glia, anten lobunun çoğunlukla örtüşmeyen alanlarını kapladı.

Bu videoyu izledikten sonra, çözeltideki tek hücrelerin nasıl etiketleneceğini iyi anlamış olmalısınız. Drosophila kullanarak karmaşık ve anatomik ilişkilerini anlamak için ve prensip olarak ve ikili sistem GAL4 UIS'nin uygulanabileceği model organizmada. Bu prosedürü ilk kez denerken, en iyi sonuçları elde etmek için önce ısı şoku süresini optimize etmeyi ve boyama protokolünün tek adımlarını mümkün olduğunca takip etmeyi hatırlamak önemlidir.