Name: Yüksek çözünürlüklü tek hücre türleri morfoloji ve Glia Drosophila içinde etkileşimlerin hücre çalışmaya uygulama çok renkli FlpOut tekniği (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Keşfedin tek hücre morfolojilerini ve hücre etkileşimlerini Drosophila'da MCFO tekniği ile görselleştirme yöntemini. Bu protokol, gelişim biyolojisi ve sinirbilim araştırmalarında karmaşık dokuları incelemek için uyarlanabilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Arnim Jenett, Aljoscha Nern ve Rubin laboratuvar tavsiye için diğer üyeleri ve yayınlanmamış reaktifler ve Janelia uçmak ışık projesi confocal görüntüleri oluşturmak için takım paylaşım teşekkür ederim. Yazarlar ayrıca el yazması üzerinde yorumlar için Galya laboratuvar üyeleri teşekkür ederiz.

1. hazırlama sinekler çok renkli FlpOut (MCFO) deneyleri için Not: MCFO tekniği sözde Flp aracılı dur kaset eksizyon (FlpOut) değiştirilmiş bir sürümü anlamına gelir. Transgenik MCFO sinekler taşımak bir ısı şok organizatörü (hsp)-Flp recombinase ve farklı gazetecilere UAS altında kontrol. Her gazeteci bir myristoylated (en düşük) süper klasör yeşil flüoresan protein (sfGFP), hangi 10 kopya epitope etiketinin içinde ortak bir omurga oluşur (örn., HA, bayrak veya V5) eklenmiş olan. Elde edilen floresan proteinler olarak adlandırılan &#34; Spagetti Canavarı GFPs &#34; (smGFPs) 14 ve farklı epitope Etiketler karşı belirli antikor kullanılarak algılanabilir.
<ol><li>Çapraz MCFO kaset ve hsp Flp (hsp-Flp; 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA,10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5) ile (bkz. tablo reçetesi) uygun gliyal GAL4 sürücü satırları için uçar .
	<ol><li>Hsp zaten 25 ° C'de etkindir ve kaç hücre bir belirsiz etiketleme için önde gelen rekombinasyon tabi olabilir haçlar 18 ° c sisteminin leakiness önlemek için ayarlayın. 18 ° C'de F1 üretimi elde etmek için yaklaşık 20 gün bekleyin. Sonra ısı (bkz. Adım 2) darbe, 25 ° c ( şekil 3) sinekler korumak.</li>
	</ol></li></ol> 2. Isı şok Not: ekleme siteye bağlı olarak, hsp-Flp verimliliğini farklı olabilir; bu nedenle, en iyi ısı şok zaman optimize edilmiş olması gerekir. Bu iletişim kuralı için bir MCFO sinek hisse senedi içinde hsp-Flp X kromozomu üzerinde takılı beri kullanılmaktadır (Tablo malzemeleri görmek).
<ol><li>Transfer döl haç adım 1.1 (F1 üretimi sinekler, 3-4 gün eski) gıda ve ısı içeren yeni tüpleri içine şok onları bir su banyosu içinde 37 ° C'de. 
	Not: Genç sinekler (1-2 gün eski) ısı şok çok duyarlıdır. 1 veya 2 ile tedavi kaynaklanan ölüm oranı azaltmak için ısı şok gerçekleştirmeden önce gün daha beklemek. Bazı F1 üretimi uçar ısı şok olmadan bir denetim olarak kullanmak.</li>
	<li>Isı şok sırasında stres kaynaklı ölüm oranı azaltmak için gıda ile normal şişeleri sinekli korumak. Kadın ve erkekler ayrı şişeleri koydu.</li>
	<li>Suda bir homojen ısı şok emin olmak için tüm şişe sokmak emin olun. 5-8 dk şok glia hücreleri birçok GAL4 sürücü satırları ile seyrek etiketleme için uygun bir başlangıç noktası olarak kullanmak; şok süresi her sürücü ve deney (daha kısa veya daha uzun ısı şok kez gerekli olabilir) için optimize edilmiş olması gerekir.</li>
	<li>Isı şoktan sonra ısı şoktan sinekler izni vermesi için birkaç dakika için yatay olarak bankta şişeleri yatıyordu. 
	Not: Bu tüpleri değiştirmek gerekli değildir.</li>
	<li>25 ° C'de sinekler korumak ve onları en iyi muhabir ifade için 2 veya daha fazla gün sonra ısı şok incelemek (bkz. Adım 3 ve 4).</li>
</ol> 3. Diseksiyon hazırlık ve çözümleri <ol><li>diseksiyon, günün hazırlamak 200 µL PCR tüpleri taze sabitleştirici çözümde S2 hücre kültür ortamının 180 µL % 20 paraformaldehyde (% 2 PFA çözüm elde etmek için İngiltere'de yılın) 20 µL ile karıştırılarak. Öncesi ve sırasında diseksiyon sabitleştirici çözüm buz üzerinde korumak. 
	Dikkat: PFA toksik ve bakımı ile ele alınması gerekir. 
	Not: S2 hücre kültür ortamının 160 µL % 20 paraformaldehyde (PFA) % 2 çözüm yerine % 4 İngiltere'de yılın çözüm hazırlamak için 200 µL PCR tüp içinde 40 µL karıştırın.</li>
	<li>Bir PCR tüp genotip başına en fazla 8-10 beyin tüp başına en iyi boyama sonucu almak için kullanın.</li>
	<li>Hazırlamak yetişkin beyin yıkama çözüm: %0.5 sığır serum albümin, % 0.5 PBS Triton X-100. 
	Not: boyama üzerinde % 1'i içeren bir çözüm bağlı olarak Triton X-100 gerekli olabilir. Triton X-100 daha yüksek bir konsantrasyon antikor doku içine nüfuz artırır ve içten içe doku (Örneğin, sinaptik bölgelerde yetişkin Drosophila beyin) yalan leke bölgelere gereklidir.</li>
	<li>Engelleme çözüm hazırlamak: % 3 normal keçi serum, % 3 normal eşek serum ve % 0,5 PBS Triton X-100.</li>
	<li>Yetişkin beyin yıkama çözüm ve engelleme çözüm 4 ° C'de birkaç hafta saklanabilir.</li>
	<li>Buzda derin depresyon wells cam levha koymak ve her doldurmak aşağıdaki çözümleri ile iyi: bir % 70 etanol, bir PBS ve S2 hücre kültür orta ile bir.</li>
</ol> 4. Yetişkin beyin diseksiyon <ol><li>3 cm çanak bir stereomicroscope sahnesinde anatomi konumlandırın ve soğuk S2 hücre kültür orta ile doldurun. Doku diseksiyon işlem sırasında sağlıklı kalmasını sağlamak için bu ortamda tüm diseksiyonlarının kuralları. 
	Not: Siyah Silikon (görüntülerde) iyi bir arka plan kontrast sağlayan birkaç milimetre ile kaplı bir diseksiyon tabak kullanın ve forseps diseksiyon sırasında korumak.</li>
	<li>CO 2 ile istenen genotip sinekler anestezi.</li>
	<li>İle forseps, kanatları tarafından sinek kapmak ve soğuk % 70 etanol için 30 yıkayın sonra soğuk PBS için ek 30 ile s s.</li>
	<li>S2 hücre kültür orta ile dolu derin depresyon iyi içine anında transfer.</li>
	<li>Aynı genotip tüm sinekler için aynı işlemi tekrarlayın ve doku korur diseksiyon kadar soğuk S2 hücre kültürü ortamında proje. 
	Not: yaklaşık 30 dk. bir zaman diliminde S2 hücre kültür orta uzun kuluçka zamanlarında disseke sinekler sayısı doku zarar verebilir sadece anestezi.</li>
	<li>Anında Forseps ile kapmak ve S2 hücre kültür Orta hızlı bir stereomicroscope altında daldırın.</li>
	<li>Kafa vücudun geri kalanından ayırmak. Cesedi atmak ve S2 hücre kültürü ortamında batık kafa tutmak. Baş Forseps ile diseksiyon süresi boyunca tutmak son derece önemlidir. Baş yüzmek başlarsa, o dokuya zarar vermeden almak zor olacak.</li>
	<li>Her zaman en az bir Forseps ile kafa tutarak bir göz çekerek diseksiyon başlar. Forseps ucu önlemek için sadece retina altında doku zarar veriyor emin olun. Diğer gözü çekin ve beyin görünene kadar manikür kaldırma başlar.</li>
	Doku temiz görünene kadar <li>tüm trakeal doku ve kütikül beyin çevresinde çıkarın. Beyin en iyi boyama sonuçları için etrafında tüm trakeal doku kaldırdığınızdan emin olun; dokular şimdi sabit ve lekeli hazır.</li>
	<li>Soğuk S2 disseke beyinlerinde hücre kültür Orta İngiltere'de yılın çözümde fiksasyon adım zaman için aktarmadan önce korumak.</li>
</ol> 5. Yetişkin beyin boyama < ol> <li>Oda sıcaklığında (RT) İngiltere'de yılın çözüm içine bir P10 pipet ile izole beyin transfer. Doku hasarı önlemek için hiç beyin sonra diseksiyon aktarmak için forseps kullanın. 200 µL PCR tüpleri bir nutator üzerinde tüm adımları gerçekleştirin.</li>
	<li>Tüm adımları, P200 pipet ile eski çözüm atılmadan önce beyin tüpün dibinde yerleşmek izin vermek için. Doku aspirating olmadan süpernatant kaldırmayı deneyin. Doku ışık pozlama korumak.</li>
	<li>Tamir %2 200 µL beyinlerinde PFA S2 hücre kültür orta 1 h için veya % 4 İngiltere'de yılın 30 dakika. Fiksasyon kez tekrarlanabilirlik artırmak için örnek arasında aynı devam.</li>
	3 (veya daha fazla) ile 15 dakika her 200 µL yetişkin beyninin çözüm, yıkama yıkar sonra <li>engellemek için 30 dakika çözüm engelleme 200 µL kurcalayarak. Çözüm kapatmaktır uzun kuluçka süreleri mümkün.</li>
	<li>Beyni bir yetişkin beyninin çözüm toplam hacmi çok 200 µL yıkama seyreltilmiş birincil antikorlar ile 4 ° C'de gecede Incubate. 
	Not: Kuluçka kez kullanılan antikor türüne bağlı olarak değişebilir. Uzun incubations gerekli olabilir.
	<ol><li>Üç MCFO işaretleri etiketleme için kuluçkaya ile beyin anti-HA (1:500), Anti-bayrak (DYKDDDDK epitope) 1: (100) ve anti-V5 birincil antikorlar.</li>
		<li>Birincil Birleşik-doğrudan antikorlar normal birincil + ikincil kasanın yerine kullanılan (örn., anti-V5:DyLight 549 (1: 200)). Bu durumda, Birleşik-doğrudan antikor ikincil antikor tedavisi. 
		Not: her genotip için biraz beyin boyama özgüllüğü doğrulamak için denetim tutun. Birincil antikor kuluçka atlayabilir ve doğrudan bir sonraki adıma geçin.</li>
	</ol></li> <li>1 h için 3 kez doku yetişkin beyin yıkama çözüm (Adım 3.3) 200 µL içinde yıkayın ve onları yetişkin beyninin çözüm gecede 4'te yıkama seyreltilmiş ikincil fluorophore-conjugates/birincil Birleşik-doğrudan antikorlar ile kuluçkaya ° C veya 200 µL toplam hacmine RT, 4 h için Not: uygun antikorlar örnekleri: AlexaFluor 488 (1:250), anti-V5:DyLight 549 (1: 200) ve DyLight 647 (1: 100)-Birleşik antikorlar.</li>
	<li>Beynim 1s yetişkin beyin yıkama çözüm, 200 µL PBS gecede 4 ° C'de veya 1-2 h RT için son bir makinaya ardından 200 µL içinde 3 kez yıkayın; PBS son yıkama adımda Triton X-100 herhangi bir iz kaldırır ve için gereklidir En iyi boyama sonuçları. Montaj orta beyinlerinde bir anti-fade ajan ile cam coverslips mount.</li>
</ol> 6. Beyin görüntüleme için montaj <ol><li>Trim görüntüleme bir spacer uygun boyutu makas kullanarak. Yüksek çözünürlüklü mikroskopi için numune ve görüntüleme spacer iki cam coverslips arasında sandviç. 
	Not: Görüntüleme çubukları ince (0,12 mm kalınlığında) olan örneklerin sıkıştırma olmadan montaj sağlayan bu peel ve stick cam coverslips ya da mikroskop slaytlara yapışkanlı çubukları.</li>
	<li>Kullanma forseps, yapışkanlı liner bir yüzeyden kaldırmak ve RONDELA, yapışkanlı yüzü aşağı, bir cam coverslip (22 mm x 60 mm) yüzey üzerinde geçerlidir. Montaj orta 10 µL uygulamak için yeni bir cam coverslip.</li>
	<li>İle bir P10 pipet, transfer beyin 200 µL tüpünden montaj orta damla yanında coverslip. Dokular ile birlikte, çözüm beyni korumak için bazı PBS transfer.</li>
	<li>İle bir P10 pipet, PBS miktarını sınırlamak çalışıyor montaj orta damla için PBS beyin taşıyın. Numuneler montaj orta coverslip görüntüleme rondela ile aktarmak. Numune karşılamak için yeterli montaj medya kullanın.</li>
	<li>Diğer yapışkan liner rondela üst taraftan kaldırın ve cam coverslip örnekler üzerine ekleyin. Bir pens ucu ile mühürlemek için yapışkan alan üzerinde hafif bir basınç uygulayın. Hemen bağlı doku görüntü veya daha sonraki analizler için-20 ° C'de slaytları depolama.</li>
</ol> 7. Görüntü alma <ol><li>confocal floresan görüntüleri bir 40 X confocal mikroskop kullanarak edinme yığını (NA = 1.2, su daldırma) amaç veya 63 X (NA 1.4, yağı daldırma =) amaç (piksel boyutları 1024 x 1024 xy düzlemde; = İki confocal bölümleri arasındaki uzaklığı 0,5 µm =). Dedektör kazanç ve böyle bir şekilde doymuş piksel ve sıfır piksel değerlerini görüntüleri mevcut her kanaldaki uzaklığı ayarlamak; Bu bilgi kaybını önler ve Dedektör tam dinamik aralığının sağlar. 
	Not: 3D görüntüleme zaman alıcı olduğu için ölçümler paralel farklı yerlerde birden fazla örnekleri tarayarak otomatikleştirilebilir. Buharlaşma ile su daldırma amaç önlemek için özel yağ daldırma orta Kırılma indisi n ile kullanın 1.33 =.</li>
	<li>Confocal yığınlar için maksimum yoğunluk projeksiyon, kanal renk ve parlaklık ayarı değişiklikleri işlemek ve herhangi bir standart resim analiz yazılımı kullanarak kontrast (Tablo malzemeleri görmek).</li>
</ol>

<ol><li>Freeman, M. R., Doherty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+cell+biology+in+Drosophila+and+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glial cell biology in Drosophila and vertebrates.</a> Trends Neurosci. 29 (2), 82-90 (2006).</li>
<li>Stork, T., Bernardos, R., Freeman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+glial+cell+development+and+function+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Analysis of glial cell development and function in Drosophila.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2012 (1), 1-17 (2012).</li>
<li>Corty, M. M., Freeman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology+in+neuroscience%3A+Architects+in+neural+circuit+design%3A+Glia+control+neuron+numbers+and+connectivity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell biology in neuroscience: Architects in neural circuit design: Glia control neuron numbers and connectivity.</a> J Cell Biol. 203 (3), 395-405 (2013).</li>
<li>Hidalgo, A., Kato, K., Sutcliffe, B., McIlroy, G., Bishop, S., Alahmed, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trophic+neuron-glia+interactions+and+cell+number+adjustments+in+the+fruit+fly%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Trophic neuron-glia interactions and cell number adjustments in the fruit fly.</a> Glia. 59 (9), 1296-1303 (2011).</li>
<li>Liu, J., Speder, P., Brand, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+brain+development+and+homeostasis+by+local+and+systemic+insulin+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Obes+Metab%22%5BJournal%5D)">Control of brain development and homeostasis by local and systemic insulin signalling.</a> Diabetes Obes Metab. 16, Suppl 1. 16-20 (2014).</li>
<li>Kurant, E., Axelrod, S., Leaman, D., Gaul, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Six-microns-under+acts+upstream+of+Draper+in+the+glial+phagocytosis+of+apoptotic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Six-microns-under acts upstream of Draper in the glial phagocytosis of apoptotic neurons.</a> Cell. 133 (3), 498-509 (2008).</li>
<li>Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mystery+and+magic+of+glia%3A+a+perspective+on+their+roles+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease.</a> Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).</li>
<li>Edenfeld, G., Stork, T., Klambt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuron-glia+interaction+in+the+insect+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Neuron-glia interaction in the insect nervous system.</a> Curr Opin Neurobiol. 15 (1), 34-39 (2005).</li>
<li>Oland, L. A., Tolbert, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Key+interactions+between+neurons+and+glial+cells+during+neural+development+in+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Entomol%22%5BJournal%5D)">Key interactions between neurons and glial cells during neural development in insects.</a> Annu Rev Entomol. 48, 89-110 (2003).</li>
<li>Stork, T., Sheehan, A., Tasdemir-Yilmaz, O. E., Freeman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuron-glia+interactions+through+the+Heartless+FGF+receptor+signaling+pathway+mediate+morphogenesis+of+Drosophila+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neuron-glia interactions through the Heartless FGF receptor signaling pathway mediate morphogenesis of Drosophila astrocytes.</a> Neuron. 83 (2), 388-403 (2014).</li>
<li>Zwarts, L., Van Eijs, F., Callaerts, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glia+in+Drosophila+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Physiol+A+Neuroethol+Sens+Neural+Behav+Physiol%22%5BJournal%5D)">Glia in Drosophila behavior.</a> J Comp Physiol A Neuroethol Sens Neural Behav Physiol. 201 (9), 879-893 (2015).</li>
<li>Nern, A., Pfeiffer, B. D., Svoboda, K., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+new+site-specific+recombinases+for+use+in+manipulating+animal+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Multiple new site-specific recombinases for use in manipulating animal genomes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (34), 14198-14203 (2011).</li>
<li>Nern, A., Pfeiffer, B. D., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+tools+for+multicolor+stochastic+labeling+reveal+diverse+stereotyped+cell+arrangements+in+the+fly+visual+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Optimized tools for multicolor stochastic labeling reveal diverse stereotyped cell arrangements in the fly visual system.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (22), E2967-E2976 (2015).</li>
<li>Viswanathan, S., Williams, M. E., Bloss, E. B., Stasevich, T. J., Speer, C. M., Nern, A., Pfeiffer, B. D., Hooks, B. M., Li, W. P., English, B. P., Tian, T., Henry, G. L., Macklin, J. J., Patel, R., Gerfen, C. R., Zhuang, X., Wang, Y., Rubin, G. M., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-performance+probes+for+light+and+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">High-performance probes for light and electron microscopy.</a> Nat Methods. 12 (6), 568-576 (2015).</li>
<li>Livet, J., Weissman, T. A., Kang, H., Draft, R. W., Lu, J., Bennis, R. A., Sanes, J. R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).</li>
<li>Hampel, S., Chung, P., McKellar, C. E., Hall, D., Looger, L. L., Simpson, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Brainbow%3A+A+recombinase-based+fluorescence+labeling+technique+to+subdivide+neural+expression+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Drosophila Brainbow: A recombinase-based fluorescence labeling technique to subdivide neural expression patterns.</a> Nat Methods. 8 (3), 253-259 (2011).</li>
<li>Hadjieconomou, D., Rotkopf, S., Alexandre, C., Bell, D. M., Dickson, B. J., Salecker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flybow%3A+Genetic+multicolor+cell+labeling+for+neural+circuit+analysis+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Flybow: Genetic multicolor cell labeling for neural circuit analysis in Drosophila melanogaster.</a> Nat Methods. 8 (3), 260-266 (2011).</li>
<li>Kremer, M. C., Jung, C., Batelli, S., Rubin, G. M., Gaul, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glia+of+the+adult+Drosophila+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">The glia of the adult Drosophila nervous system.</a> Glia. 65 (4), 606-638 (2017).</li>
</ol>

Hiçbiri-in belgili tanımlık yazar rakip veya çakışan ilgi alanlarına sahip.

Bu iletişim kuralı bir doku yüksek çözünürlükte ilgi içinde farklı hücre türleri morfolojisi çalışmaya kolay ve etkin bir yöntem açıklanır. MCFO tekniği ile farklı epitope etiketleri ile birden fazla gazetecilere çok renkli Stokastik (Şekil 2) etiketleme için birlikte kullanılır. Benzer şekilde Brainbow/Flybow15,16,17gibi diğer yöntemleri, MCFO hücre-hücre etkileşim çalışmaları için hücre kenarlıkla...

Glia, sinir sistemi (NS), Sigara nöronal hücre nüfusu uzun nöronlar için statik bir çerçeve sağlamak sayıyorlar ve bu nedenle ayrıntılı olarak incelenmiştir değil. Ancak, insanlar, glia hücreleri NS (~ %90) büyük çoğunluğu teşkil ve astrocytes, oligodendrocytes, microglia ve Schwann hücreleri de dahil olmak üzere, birkaç farklı kategoride toplanır. Drosophilaiçinde glia hücreleri NS yaklaşık yüzde 10'u oluşturmaktadır. Çoğu intriguingly konularda, kendi türleri morfoloji ve işlevleri omurgalılar1,2' bulunanlara benzer. Kendi türleri Morfoloji epiteli, ensheathing ve astrocyte benzeri hücreler oluşturan kan - beyin bariyerini (BBB) içerir.
Drosophila merkezi sinir sistemi (MSS) aşağıdaki temel yapıdan oluşur: nöronal hücre organları; içeren korteksin bölgeleri Sinaptik bağlantıları liman neuropils; farklı neuropiles bağlanan küçük ve büyük axon yolları; duyu organları ve kaslar MSS (şekil 1) ile bağlanan periferik sinirler. Glia anatomik yapılarla ilişkili bulunur: korteks glia (CG) kortikal bölgelerde astrocyte benzeri glia (ALG) ve neuropile bölgelerinde, ensheathing glia ensheathing glia (EG) ayrıca merkezi axon yolları ve çevre birimi ile ilişkili vardır sinirler (EGN) ve son olarak, iki sayfa benzeri glia, perineurial glia (PG) ve subperineurial (SPG), hangi birlikte tüm NS (Şekil 2) kapsayan bir bitişik katman oluşturur.
Önceki çalışmalarda bu glia göstermiştir NS; gelişiminde önemli rol oynarlar Onlar için sistemik dolaşımdaki İnsülin benzeri peptidler tepki nöronal hücre sayıları izlemek, nöronlar, astrocyte-nöron laktat Servisi gibi trofik destek sağlamak ve ölen nöronlar fagositoz3,4 tarafından ortadan kaldırmak , 5 , 6. olgun NS glia BBB korumak, nörotransmitter kadar almak ve iyonik homeostazı korumak, NS, büyük bağışıklık hücreleri olarak hareket beri makrofajlar BBB ihlal ve sinirsel aktivite yanı sıra hayvan davranışları6 modüle , 7 , 8 , 9 , 10 , 11.
Olup farklı gliyal alt türlerinden özel işlevleri gerçekleştirmek önemli bir açık soru kalır. Ancak, glia, özellikle, Yetişkin, sistematik bir genom geniş analizi uygun genetik araçlar onların manipülasyon için eksikliği ile engel olmuştur. Burada, cep şekilleri karmaşık hücre-hücre etkileşimleri çalışmaya verimli ve kolay karakterizasyonu sağlayan bir yöntem sunulur. Bu teknik yetişkin Drosophila beyinde farklı gliyal türlerinden morfolojisi karakterize etmek için uygulanan, ancak kullanılan belirli GAL4 sürücüsüne bağlı olarak bu nöronların12,13 çalışmaya adapte , herhangi bir hücre birbirine karışmasının ve prensipte herhangi bir gelişim aşamalarında herhangi bir doku.

<table><tbody><tr><td>Su banyosu</td><td>Hibe</td><td>GD100</td><td></td></tr><tr><td>PCR tüpleri</td><td>Sarstedt</td><td>72.737.002</td><td></td></tr><tr><td>Forseps</td><td>Dumont</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon kabı 30 mm x 12 mmm</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>70543-30</td><td>Cam diseksiyon kabı</td></tr><tr><td>Pyrex 3 Depresyon Cam Spot Plakası</td><td>Corning</td><td>7223-34</td><td>Cam diseksiyon plakaları</td></tr><tr><td>Sylgard Black</td><td>SYLGARD, Sigma-Aldrich</td><td>805998</td><td>odun kömürü ile ev yapımı</td></tr><tr><td>ExpressFive S2 hücre kültürü ortamı</td><td>Invitrogen</td><td>10486-025</td><td></td></tr><tr><td>%20 PFA</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>15713</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Roth</td><td>3051.3</td><td></td></tr><tr><td>Normal keçi serumu</td><td>Jackson Laboratuvarları</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Normal eşek serumu</td><td>Jackson Laboratuvarları</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümin</td><td>Sigma</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>Tavşan HA-tag</td><td>Hücre Sinyali</td><td>C29F4</td><td>Birincil antikor, seyreltme 1:500</td></tr><tr><td>Sıçan BAYRAK etiketi</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP1-06712</td><td>Birincil antikor, seyreltme 1:100</td></tr><tr><td>Fare V5-etiketi:DyLight 549</td><td>AdSerotec</td><td>0411</td><td>Konjuge antikor, seyreltme 1:200</td></tr><tr><td>anti-tavşan AlexaFluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11034</td><td>İkincil antikor, seyreltme 1:250</td></tr><tr><td>anti-sıçan DyLight 647</td><td>Jackson Laboratuvarları</td><td>712-605-153</td><td>İkincil antikor, seyreltme 1:100</td></tr><tr><td>Vecta Shield</td><td>Vektör Laboratuvarları</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>SlowFate Gold</td><td>Invitrogen</td><td>S36937</td><td></td></tr><tr><td>Güvenli Conta Ara Parçası</td><td>Grace Biolabs</td><td></td><td>Sipariş için şirketle iletişime geçin</td></tr><tr><td>Mikroskop kapak camı 22 X 60 mm</td><td>Marienfeld</td><td>101152</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop kapak camı 22 x 22 mm</td><td>Roth</td><td>H874</td><td></td></tr><tr><td>Stereo Mikroskop, Leica MZ6</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Konfokal lazer tarama mikroskobu LSM710</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Immersol</td><td>Zeiss</td><td>518 F</td><td>Floresan mikroskobu için daldırma yağı, halojensiz</td></tr><tr><td>Immersol</td><td>Zeiss</td><td>W 2010</td><td>Suya daldırma objektifleri için daldırma sıvısı, halojensiz</td></tr><tr><td>R56F03-GAL4 (EG)</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>39157</td><td>GAL4 sürücüsü</td></tr><tr><td>R86E01-GAL4 (ALG)</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>45914</td><td>GAL4 sürücüsü</td></tr><tr><td>hspFlpPestOpt; UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-flag, uas-frt-stop-FRT-myr-smGFP-V5</td><td>Bloomington Stok Merkezi</td><td>64085</td><td>UAS muhabiri (https://bdscweb.webtest.iu.edu/stock/misc/mcfo.php)</td></tr><tr><td>Fiji (Resim J)</td><td></td><td></td><td>Görüntü analiz yazılımı</td></tr><tr><td>Otomatik tarama için</td> <td>Çok Zamanlı Makro</td><td>Zeiss</td><td></td> Yazılımı</tr></tbody></table>

yüksek çözünürlüklü tek hücre türleri morfoloji ve glia drosophila içinde etkileşimlerin hücre çalışmaya uygulama çok renkli flpout tekniği

Application of MultiColor FlpOut Technique to Study High Resolution Single Cell Morphologies and Cell Interactions of Glia in Drosophila

Hücreler farklı türleri morfoloji ve karmaşık anatomik ilişkileri görüntüler. Hücreleri onların komşuları ile nasıl etkileşimde bulunur? Etkileşimleri hücre tipleri arasında ya da belirli bir türün içinde farklı mıdır? Ne tür uzamsal kuralları takip ettiler? Böyle temel soru vivo yanıtları defa yüksek çözünürlüklü tek hücre etiketleme araçları eksikliği ile engel olmuştur. Burada, bir çok renkli FlpOut (MCFO) tekniği ile tek hücreleri hedef için detaylı bir protokol sağlanır. Bu yöntem iki FRT siteleri (FRT-dur-FRT) tarafından çevrili bir transkripsiyon Sonlandırıcı sessiz tutulduğu üç farklı şekilde etiketlenmiş gazetecilere (HA, bayrak ve V5) UAS kontrol altında kullanır. Isı şok nabzı rastgele tek tek hücreleri FRT-dur-FRT kaset kaldıran bir ısı şok kaynaklı Flp recombinase, ifadesi indükler: ifade yalnızca aynı zamanda bir GAL4 sürücü hızlı hücrelerinde oluşur. Bu farklı renkli hücreleri tek hücre türleri Morfoloji görselleştirme sağlar yüksek çözünürlükte bir belli bir hücre türü bir dizi yol açar. Örnek olarak, MCFO teknik türleri Morfoloji yetişkin Drosophila beyinde farklı gliyal türlerinden görselleştirmek için belirli gliyal GAL4 sürücüleri ile kombine edilebilir.

Bu bölümde yetişkin Drosophila beyinde MCFO tekniği kullanılarak elde sonuçları örnekleri gösterilmektedir. Şekil 3 yönteminin şematik gösterir. Üç farklı membran öğesini gazetecilere (en düşük myr-smGFP-HA, en düşük myr-smGFP-bayrak ve en düşük myr-smGFP-V5) UAS kontrol altında iki FRT siteleri (FRT-dur-FRT) tarafından çevrili bir transkripsiyon Sonlandırıcı tarafından sessiz tutulur. Isı şok nabzı rastgele tek tek hücreleri FRT-d...

Hücre türleri farklı morfoloji görüntülemek ve a değişiklik-in onların komşuları ile etkileşim kurmak. Bu iletişim kuralı tek hücre morfolojisi açıklamaya ve hücre-hücre etkileşim köklü Gal4/UAS ifade sistemi kullanılarak incelemek için açıklar.

Yüksek çözünürlüklü tek hücre türleri morfoloji ve Glia Drosophila içinde etkileşimlerin hücre çalışmaya uygulama çok renkli FlpOut tekniği

Cells display different morphologies and complex anatomical relationships. How do cells interact with their neighbors? Do the interactions differ between ...

Bu tekniğin genel amacı, karmaşık anatomik dokulardaki tek hücre morfolojilerini görselleştirerek Drosophila'daki hücreler arası etkileşimlerin incelenmesini kolaylaştırmaktır. Bu yöntem, meyve sineği kullanılarak karmaşık morfolojiler ve hücreler arası etkileşimlerle ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, herhangi bir dokuda ve herhangi bir gelişim evresindeki tek hücre morfolojilerinin çalışılmasına uyarlanabilmesidir.Prosedürü laboratuvarımızda teknisyen olan Anja Kieser uygulamalı olarak gösterecektir. MCFO tekniği, standart FlpOut tekniğini şu şekilde modifiye eder: Isı şoku FLP rekombinazı ve farklı raporörler UAS kontrolü altında kalmaya devam eder, ancak her raporör, epitop etiket kopyalarının yerleştirildiği miristoile edilmiş bir superfolder GFP'den oluşan ortak bir omurgaya sahiptir.Elde edilen floresan olmayan proteinlere spagetti canavarı GFP'ler adı verilir ve antikorlarla tanımlanırlar. Eksizyon sayısına bağlı olarak, farklı epitop kombinasyonları eksprese edilir. HSP promotörü 25 °C'de hafifçe aktif olduğundan, çaprazlamaları promotörün tamamen inaktif olduğu 18 °C'de gerçekleştirin.Ardından, F1 neslini elde etmek için y

application-multicolor-flpout-technique-to-study-high-resolution

Research

JoVE Journal

Behavior

Davranış

Biz sinek larvaları konfokal mikroskobu ile floresan boyalar kullanarak canlı bir roman Tersyüz doku hazırlanması Glia nöromüsküler sinapsların yapısal özellikleri nitelendirdi. Biz HRP için flüoresan primer antikor ile canlı nöron terminalleri etiketli ve floresan Dextrans perisynaptic alan görüntülendi.

Canlı görselleştirme Drosophila</emFloresan Boyalar> Glial nöromüsküler Kavşağı

Burada, glial hücreler göç GFP etiketli glial hücreler ile eşleştirilmiş canlı mikroskobik analizi ile gelişmekte olan Drosophila göz içine incelemek için bir protokol açıklar.

Drosophila Göz hayali Disk Glial Hücre Göç Canlı Görüntüleme

Drosophila hemocytes gelişmekte olan embriyonun bütünlüğü içinde dağılırlar . Bu protokol, floresan etiketli hemocytes embriyoları kullanılarak bu göçler montaj ve görüntü nasıl gösteriyor.

Uygulamalarda Canlı Görüntüleme Drosophila melanogaster Embriyonik Hemocyte Göçler

Tek Drosophila Ommatidium Diseksiyon ve Görüntüleme

Bu video, glial hücrelerin tek hücreli görüntülenmesi için transgenik bir Drosophila beyninin immünofloresan boyamasını göstermektedir. Beyin, glial spesifik bir rekombinaz sisteminin kontrolü altında farklı antijenik epitop kombinasyonları ile kaynaşmış zar hedefli proteinleri eksprese eder. İzole ve sabit beyinler, antijenik epitoplara özgü primer antikorlarla boyanır, ardından florofor konjuge sekonder antikorlar gelir. Bu etiketleme, çeşitli beyin bölgelerinde farklı glial hücre alt...

Glial Hücrelerin Tek Hücreli Görüntülenmesi için Drosophila Beyinlerinin İmmünofloresan Boyaması

Biz, merkezi sinir sistemi içinde tek nöron etiketlenmesine yönelik bir yöntem (CNS)...

Merkez Sinir Sistemi Tek Hücreler Etiketleme<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Bu protokol, dokunulmamış larva beyin bağlamında canlı hücre görüntüleme yapmak için kullanılan akıcı bir yöntem göstermektedir. Canlı hücre görüntüleme yaklaşımları sürekli daha önce gözardı mekanizmaları ortaya çıkarılması, asimetrik nöral kök hücre bölünmeleri çalışmanın yanı sıra diğer nörolojik ve gelişimsel süreçleri için paha biçilmezdir.

Canlı Görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva nöroblastomun

Bu iletişim kuralı diseksiyon ve yetişkin Drosophila melanogaster immunostaining açıklar beyin dokuları. Özellikle, bu iletişim kuralı doğru nöronal gelişim birçok yönlerini temel genel prensipler ortaya çıkarmak için kullanılabilecek örnek nöronal alt kümeleri olarak Drosophila mantar beden ve photoreceptor nöronlar kullanımı vurgulamaktadır.

Diseksiyon ve mantar vücut immünfloresan boyama ve yetişkin Drosophila melanogaster beynindeki nöronlar Photoreceptor

Erken Drosophila embriyosunda, birçok organel hareketlidir. Prensip olarak, belirli floresan problar aracılığıyla canlı olarak görüntülenebilirler, ancak yumurta kabuğu embriyoya doğrudan uygulamayı önler. Bu protokol, bu tür probların mikroenjeksiyon yoluyla nasıl tanıtılacağını ve daha sonra parçacık  görüntü velosimetrisi yoluyla toplu organel hareketinin nasıl analiz edileceğini açıklar.

Drosophila Embriyolarında Lipid İçeren Organellerin Sitoiskelete Bağımlı Ticaretinin Görselleştirilmesi

Burada, fotoreseptör membran proteinlerinin lokalizasyonu ve eGFP floresan kullanılarak Drosophila bileşik gözünde retinal dejenerasyonun değerlendirilmesi için non-invaziv yöntemler tanımlanmıştır.

eGFP Etiketli Proteinler Kullanarak Drosophila Fotoreseptör Hücrelerinde Membran Protein Kaçakçılığının İncelenmesi

Genişleme Destekli Yinelemeli Floresan In Situ Hibridizasyon (EASI-FISH), kalın dokuda birden fazla genin ekspresyonunu tespit etmek için genleşme mikroskobunu floresan in situ hibridizasyon (FISH) ile birleştiren sağlam bir tekniktir. Bu protokol, yöntemdeki son gelişmeleri ve bozulmamış Drosophila merkezi sinir sistemini etiketlemek için adaptasyonunu özetlemektedir.

Genişleme Destekli Yinelemeli Floresan In Situ Hibridizasyon Kullanılarak Sağlam Drosophila Beyindeki Gen Ekspresyonunun Multipleks Tespiti

Keşfedin tek hücre morfolojilerini ve hücre etkileşimlerini Drosophila'da MCFO tekniği ile görselleştirme yöntemini. Bu protokol, gelişim biyolojisi ve sinirbilim araştırmalarında karmaşık dokuları incelemek için uyarlanabilir.

Yüksek çözünürlüklü tek hücre türleri morfoloji ve Glia Drosophila içinde etkileşimlerin hücre çalışmaya uygulama çok renkli FlpOut tekniği (Video) | JoVE Journal

Yüksek çözünürlüklü tek hücre türleri morfoloji ve Glia Drosophila içinde etkileşimlerin hücre çalışmaya uygulama çok renkli FlpOut tekniği

Daha fazla video keşfet