Yüksek çözünürlüklü tek hücre türleri morfoloji ve Glia Drosophila içinde etkileşimlerin hücre çalışmaya uygulama çok renkli FlpOut tekniği
October 20th, 2017
Hücre türleri farklı morfoloji görüntülemek ve a değişiklik-in onların komşuları ile etkileşim kurmak. Bu iletişim kuralı tek hücre morfolojisi açıklamaya ve hücre-hücre etkileşim köklü Gal4/UAS ifade sistemi kullanılarak incelemek için açıklar.
Bu tekniğin genel amacı, karmaşık anatomik dokulardaki tek hücre morfolojilerini görselleştirmek ve böylece Drosophila'da hücre hücresi etkileşiminin incelenmesini basitleştirmektir. Bu yöntem, meyve sineğini kullanarak karmaşık morfolojiler ve hücre hücresi etkileşimleri ile ilgili temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, herhangi bir dokuda ve herhangi bir gelişim aşamasında tek hücre morfolojilerinin çalışmasına uyarlanabilmesidir.
Prosedürü göstermek, laboratuvarımızda bir teknisyen olan Anja Kieser olacaktır. MCFO tekniği, standart FlpOut tekniğini aşağıdaki gibi değiştirir. Bir ısı şoku FLP rekombinazı ve farklı muhabirler UAS kontrolü altında kalır, ancak her muhabirin, bir epitop etiketinin kopyalarının eklendiği miristoillenmiş bir süper klasör GFP'nin ortak bir omurgası vardır.
Elde edilen floresan olmayan proteinler spagetti canavarı GFP'leri olarak adlandırılır ve antikorlarla tanımlanır. Eksizyon sayısına bağlı olarak, farklı bir epitop kombinasyonu ifade edilir. HSP promotörü 25 santigrat derecede biraz aktif olduğundan, gerçekten aktif olmadığı 18 santigrat derecede haçlar ayarlayın.
Ardından, F1 neslini elde etmek için yaklaşık 20 gün bekleyin. F1 dişilerini ve erkeklerini ayrı şişelere ayırın. Onları ısı şoku vermek için, önce üç ila dört günlük olduklarında taze gıda şişelerine aktarın.
Genç sinekler ısı şokuna karşı çok hassas olabilir. Ardından, şişeleri 37 santigrat derecelik bir su banyosuna aktarın. Homojen bir ısı şoku sağlamak için derine daldırın.
Glial hücrelerin seyrek etiketlenmesi için, beş ila sekiz dakikalık ısı şoku ile başlayın ve ardından optimize edin. Optimum ısı şoku süresi, hedef hücreleri seyrek olarak etiketleyecektir ve ilişkisi, kullanılan belirli GAL4 sürücüsüne bağlıdır. Isı şokundan sonra, şişeleri soğutmak için birkaç dakika tezgahın üzerine yatay olarak koyun.
Şimdi, sinekleri aynı şişelerde 25 santigrat derecede tutmaya başlayın. İki gün sonra, muhabir ifadesi optimal olacak ve sinekler disseke edilebilir. Hazırlık olarak, buzun üzerine üç derin çöküntü kuyusu koyun.
Bir kuyuyu% 70 etanol, birini PBS ve birini S2 hücre kültürü ortamı ile doldurun. Ardından, soğuk S2 ile siyah silikonla kaplı üç santimetrelik bir diseksiyon kabı yükleyin. Dokuları sağlıklı tutmak için tüm diseksiyonları S2'de gerçekleştirin. Şimdi, sinekleri karbondioksit ile uyuşturun.
Daha sonra, forseps veya bir tüy kullanarak, sinekleri yaklaşık 30 saniye boyunca soğuk% 70 etanole, ardından yaklaşık 30 saniye boyunca soğuk PBS'ye koyun ve ardından soğuk S2'ye aktarın. Böylece, disseke edilecek tüm sinekleri yıkayın. Bir genotipten 10 sinek genellikle yeterlidir. Şimdi, 30 dakika içinde, tüm beyinleri inceleyin.
İlk olarak, kafayı vücudun geri kalanından ayırın ve vücudu atın. Tüm diseksiyon boyunca başınızı kapalı elinizle tutun, aksi takdirde onu yeniden kavramak çok zor olacaktır. Ardından, retinanın hemen altındaki dokuyu kavrayarak bir gözünüzü dışarı çekin.
Sonra diğer gözü çekin ve böylece beyni ve çevresindeki dokuları açığa çıkarın. Ardından, beyin dokusu temiz görünene kadar beynin etrafındaki tüm trakeal dokuyu ve kalan kütikülü çıkarın. Optimal boyama sonuçları için tüm trakea dokusu çıkarılmalıdır.
Beyni fiksasyona hazırlamak için gereken tek şey budur. Diseke edilmiş beyinleri soğuk S2'de tutarken tüm beyinleri parçalara ayırmaya devam edin. Optimum boyama için mikrosantrifüj tüpü başına 10'a kadar beyin hazırlamaya çalışın. İzole edilmiş beyinleri bir P10 pipet ucu kullanarak fiksatif solüsyon içeren 200 mikrolitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
Beyinleri asla forseps kullanarak tutmayın. Işıktan korunan dokuları inkübe edin. Çözelti transferleri sırasında beyinleri aspire etmekten kaçının.
Fiksatifi çıkarmak için, yıkama solüsyonu ile üç veya daha fazla 15 dakikalık yıkama kullanın. Daha sonra dokuları 30 dakika veya daha uzun süre bloke edici solüsyonla bloke edin. Daha sonra, bloke etme solüsyonunu yıkama solüsyonunda seyreltilmiş primer antikorlarla değiştirin ve beyinleri gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.
Birincil antikorları çıkarmak için, yıkama solüsyonunda üç adet bir saatlik yıkama kullanın. Daha sonra, yıkama çözeltisine ikincil florofor konjuge antikorları ekleyin ve beyinleri gece boyunca dört santigrat derecede veya oda sıcaklığında dört saat boyunca inkübe edin. Bağlanmamış antikorları tamamen yıkamak için, yıkama solüsyonunda bir saatlik üç yıkama ve ardından PBS ile daha uzun bir yıkama yapın.
Sonra beyinleri monte edin. Hayal eden bir ara parça ile iki kapak fişi hazırlayın. Ara parçaya ve ekstra kapak kızağında, solmaya karşı önleyici bir madde ile 10 mikrolitre montaj ortamı uygulayın.
Daha sonra, bir P10 pipeti kullanarak, beyinleri kapak fişine aktarın ve bunları bir miktar PBS ile birlikte ortamın yanına bırakın. Dokunun kurumasına izin vermeyin. Şimdi, beyinleri pipeti kullanarak dikkatlice montaj ortamına taşıyın ve son olarak onları ara parçadaki ortama taşıyın ve forseps ile düzenleyin.
Ardından, ara parçalardaki yapışkan astarı çıkarın ve bir kapak fişi takın. Kapak kızağını forseps kullanarak biraz bastırarak sabitleyin ve hemen görüntülemeye devam edin veya slaytları daha sonra analiz etmek üzere eksi 20 santigrat derecede saklayın. Açıklanan yöntemler kullanılarak, üç farklı membran etiketli raportör, FRT bölgeleri ile çevrili transkripsiyonel sonlandırıcılar tarafından sessiz tutulur.
Hayvanlar ısı şoku verildiğinde, FLP rekombinaz eksprese edildi ve sonlandırıcılar rastgele çıkarıldı, bu da farklı raportör kombinasyonlarının ifadesine yol açtı. Genel olarak, farklı raportör kombinasyonları yedi farklı renk sağlar, bu nedenle çoklu tek hücre morfolojileri ayrı ayrı görselleştirilebilir ve incelenebilir. EG-GAL4 ve ALG-GAL4 ile çeşitli ısı şoku süreleri test edildi.
Tek hücre etiketlemesi beynin anten lob bölgesinde analiz edildi. EG-GAL4 sürücüsü, tümü anten lobunun yüzeyinde kaplanmış olan glial hücrelerin kılıflanmasında ifade edildi. Karşılaştırıldığında, ALG-GAL4 tarafından hedeflenen astrosit benzeri glia, anten lobunun çoğunlukla örtüşmeyen alanlarını kapladı.
Bu videoyu izledikten sonra, çözeltideki tek hücrelerin nasıl etiketleneceğini iyi anlamış olmalısınız. Drosophila kullanarak karmaşık ve anatomik ilişkilerini anlamak için ve prensip olarak ve ikili sistem GAL4 UIS'nin uygulanabileceği model organizmada. Bu prosedürü ilk kez denerken, en iyi sonuçları elde etmek için önce ısı şoku süresini optimize etmeyi ve boyama protokolünün tek adımlarını mümkün olduğunca takip etmeyi hatırlamak önemlidir.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu protokol, Drosophila'da Gal4/UAS ekspresyon sistemini kullanarak tek hücre morfolojilerini görselleştirmek ve hücre-hücre etkileşimlerini araştırmak için bir yöntem belirlemektedir. Teknik, karmaşık anatomik dokuların çalışmasını basitleştirir ve çeşitli dokular ve gelişim aşamaları için uyarlanabilir olabilir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Hücre Biyolojisi
- Gelişimsel Biyoloji
Arka Plan
- Hücreler çeşitli morfolojiler ve etkileşimler sergiler.
- Bu etkileşimleri anlamak gelişimsel biyoloji için kritik öneme sahiptir.
- Gal4/UAS sistemi gen ekspresyonu çalışmaları için çok yönlü bir araçtır.
- Drosophila bu tür çalışmalar için etkili bir model organizma olarak hizmet eder.
Çalışmanın Amacı
- Karmaşık dokulardaki tek hücre morfolojilerini görselleştirmek.
- Gelişimsel bağlamda hücre-hücre etkileşimlerini araştırmak.
- Yöntemi çeşitli dokular ve aşamalar için uyarlamaktır.
Kullanılan Yöntemler
- MCFO tekniği FlpOut tekniğini modifiye eder.
- Isı şoku FLP rekombinaz ve UAS kontrollü raportörleri kullanır.
- Epitop etiketli miristoilen süper katlanmış GFP kullanır.
- Bir laboratuvar teknisyeni tarafından gösterilmiştir.
Ana Sonuçlar
- Tek hücre morfolojilerinin başarılı bir şekilde görselleştirilmesi.
- Hücre-hücre etkileşimleri hakkında daha iyi anlama sağlar.
- Tekniğin farklı dokularda uyarlanabilirliği.
- Çeşitli gelişim aşamalarında uygulama potansiyeli.
Sonuçlar
- Yöntem karmaşık hücresel etkileşimlere dair içgörüler sağlar.
- Gelişimsel biyoloji araştırmalarında geniş çapta uygulanabilir.
- Gelecekteki çalışmalar bu tekniği daha derin bir anlama kavuşturmak için kullanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Understanding glial cell morphology and interaction patterns in vivo is critical for de-risking neurobiological target hypotheses and informing preclinical model selection. The MultiColor FlpOut (MCFO) technique enables high-resolution single-cell labeling in complex tissues, supporting mechanistic de-risking by clarifying cellular architecture and spatial relationships. This capability enhances predictive confidence in target validation efforts within discovery neuroscience programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of glial subtype morphology and spatial organization to support target hypothesis testing.
- Operational Value: Provides a reproducible method for visualizing single-cell architectures in intact neural tissue.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitatively distinguishable single-cell labels for morphological screening and interaction mapping.
- Operational Value: Produces standardized, sparse labeling compatible with imaging-based assay readouts.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant system modeling by enabling detailed glial phenotyping in Drosophila models of neural function.
- Operational Value: Facilitates continuity from discovery morphology assessment to preclinical validation workflows.
Pipeline & Workflow Integration
The MCFO technique integrates into early discovery workflows by enabling hypothesis-driven assessment of glial cell structure and interaction, informing target selection and model relevance prior to lead identification stages.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking through high-resolution visualization of glial morphologies and spatial patterning in vivo.
- Screening: Enables standardized, sparse single-cell labeling for imaging-based phenotypic screening of glial architecture.
- Analytics: Generates multi-color readouts that allow quantitative comparison of cell shape, territory, and interaction patterns across conditions.
- Translational Research: Connects discovery-stage morphology data to preclinical models by establishing glial phenotypic benchmarks.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable labeling platform applicable across neural tissues and developmental stages in Drosophila.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in glial target validation through direct visualization of single-cell morphology and interaction.
- Operational Value: Ensures reproducibility and standardization via controlled heat-shock induction and sparse labeling optimization.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing morphological confidence in target relevance and model fidelity.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of glial targets based on validated structural and spatial phenotypes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Drosophila genetics, GAL4/UAS systems, and heat-shock inducible Flp recombinase protocols.
- Dependent on access to fluorescence microscopy and antibody-based detection for epitope-tagged reporters (HA, FLAG, V5).
- Necessitates optimization of heat-shock duration to achieve sparse labeling for specific GAL4 drivers.
- Involves standardized dissection, fixation, and immunostaining workflows to preserve tissue integrity and signal quality.
- Limited to epitope-tag detection rather than live fluorescence, requiring fixed-tissue processing and immunostaining steps.
