Diferansiyel Taramalı Kalorimetre - Protein Antigen Termal İstikrar ve Yapısının Değerlendirilmesi Bir Yöntem

Bu prosedürün genel amacı, diferansiyel tarama kalorimetrisi kullanarak endüstriyel bir ortamda proteinlerin termal stabilitesini ve yapısal konformasyonunu değerlendirmektir. Diferansiyel taramalı kalorimetri, sıcaklığın bir fonksiyonu olarak numunelerin molar ısı kapasitesini ölçer ve proteinlerin termal stabilitesini ve yapısal konformasyonunu değerlendirmek için başarıyla kullanılmıştır. Bu nispeten basit prosedür, diğer biyofiziksel yöntemlerde olduğu gibi yapısal sarmallığa veya içsel floroforlara bağlı değildir.

Bu tekniğin bir başka avantajı, proteinlerin üçüncül yapısını stabilize eden etkileşimi bozmak için gereken termal geçiş sıcaklığını ve enerjiyi doğrudan ölçmesidir. Açılma entrokalpisi ile birlikte kullanıldığında, termal geçiş sıcaklığı, biyolojik ürünler için üretim süreçlerinin partiden partiye tutarlılığını izlemek için yararlı bir parametre olarak hizmet edebilir. Bu yöntemin görsel gösterimi, yeni kullanıcılara kritik adımlarda etkili bir şekilde yardımcı olmak için etkileşimli bir ortam görevi görebilir.

Başlamak için diferansiyel taramalı kalorimetreyi açın. Ardından sisteme nitrojen verin. Bu, numunelerin kaynamasını bastırmak için hücrelerdeki basıncı artıracak ve yüksek sıcaklıklarda kabarcık oluşumunu önleyecektir.

Hücreyi oluşturan malzemeye bağlı olarak, hücreye zarar vermemek için nitrojen gazı kaynağının basıncını üreticinin tavsiye ettiği basınca göre ayarlayın. Tüm temizlik maddesi rezervuarlarının gerekli hacme kadar doldurulduğundan emin olun. Gerekli temizlik maddeleri, hücreyi yıkamak için deterjan ve her numune çalışmasından sonra hücreyi temizlemek için su içerir.

Deneyden önce numunenin bütünlüğünü korumak için numune tutma bölmesinin sıcaklığını uygun bir değere, tercihen beş santigrat dereceye ayarlayın. Çözeltiler arasındaki tek farkın protein olduğundan emin olmak için numuneyi tampona karşı dengelemek önemlidir. Bu nedenle, ısı kapasitesinde gözlenen fark, proteine doğru bir şekilde bağlanabilir.

Lowry yöntemi gibi uygun bir protein konsantrasyonu belirleme yöntemi kullanarak protein numunesinin konsantrasyonunu belirleyin. Bu protokolde kullanılan cihaz için tercih edilen çalışma aralığı mililitre başına 0,5 ila bir miligram proteindir. Numuneyi, deney için referans olarak kullanılacak tampona karşı diyalize edin.

Hacim yanlışlığına neden olabilecek mikro kabarcıklardan kurtulmak için numunenin ve referans tamponunun gazını vakumda alın. Laminer akışlı bir biyo-muhafaza kabininde çalışırken, numuneleri ilgili tamponlarına çiftler halinde 96 kuyucuklu plakalara yüklemek için bir mikropipet ve steril uçlar kullanın. Numune ölçümünden önce cihazın uygunluğunu doğrulamak için tampon-tampon taramaları yapmak için ilk iki kuyucuk çiftini tamponla doldurun.

Hücreleri temizlemek için su taraması için son iki kuyu çiftini suyla doldurun. Ardından 96 kuyulu plakayı sızdırmazlık filmi ile örtün. Numune kontaminasyonunu önlemek için plakayı biyogüvenlik kabininden çıkarmadan önce kuyucukların uygun şekilde kapatıldığından emin olun.

Son olarak, plakayı numune tutma bölmesine uygun yönde yerleştirin. Edinme yazılımını kullanarak, numune bilgilerini plakanın yüklenme sırasına göre girin. Varsa protein konsantrasyonlarını girin.

Aksi takdirde, veri analizinden önce konsantrasyonu analiz yazılımına girin. Her numune taramasından önce hücrenin deterjanla temizlenmesini sağlayan seçeneği seçin. Hücrelerde deterjan kalıntısı kalmadığından emin olmak için temizliğin ardından birden fazla suyla durulama adımı yapılmalıdır.

Deneyin başlangıç sıcaklığını, örneğe bağlı olarak değişebilen 20 santigrat dereceye ayarlayın. Bilinen proteinler için önceden belirlenmiş bir başlangıç sıcaklığı kullanılabilirken, bilinmeyen numuneler için daha düşük bir başlangıç sıcaklığı uygulanabilir. Ardından deneyin son sıcaklığını ayarlayın.

Nihai sıcaklık, numunenin önceden bilinmesine bağlı olarak da değişebilir. Ardından, deneyin tarama hızını ayarlayın. Açılma kinetiğini değerlendirmek için bilinmeyen numunelerin farklı tarama hızlarında taranması tavsiye edilir.

Termal geçişin tersine çevrilebilirliğini incelemek için numuneleri yeniden taramak için toplama yazılımını kurun. İkinci tarama için elde edilen entalpi, ilk taramadan elde edilen entalpi değerinin en az% 80'i ise, bir proteinin açılması tersine çevrilebilir olarak kabul edilir. Kalorimetre hücresinin bütünlüğünü korumak için deney sonrası termostatı 10 santigrat dereceye ayarlayın.

Denemeyi yürütmeden önce deneme kurulum parametrelerinin doğru olduğunu doğrulayın. Her şey yerindeyse, deneyi başlatın. Denemeyi takiben, metin protokolünde açıklandığı gibi veri analizi gerçekleştirin.

Analiz için, temel çıkarma manuel olarak gerçekleştirilir. Bu adımdaki tutarlılık, karşılaştırılabilir sonuçlar elde etmek için çok önemlidir. Burada, tampon ve su taramaları dahil olmak üzere deneysel bir çalışmanın temsili bir ham verileri gösterilmektedir.

Analiz edilen numuneler, doğal ve detoksifiye edilmiş durumlarında toksinlerdir. Numune taramaları, her numune için erime sıcaklığı ve entalpi değerlerini elde etmek için ayrı ayrı işlenir. Doğal durum için, erime sıcaklığı 55.55 santigrat derecedir ve toksinin entalpisi mol başına 3.157 kez 10 ila beşinci kaloridir.

Tersine, toksinin detoksifiye edilmiş halde erime sıcaklığı 81.21 santigrat derecedir ve entalpi 3.656 kez mol başına 10 ila beşinci kaloridir. Toksinin işlenmiş verilerinin doğal ve detoksifiye durumlarında üst üste bindirilmesi, detoksifiye edilmiş numunenin, erime sıcaklığı değerlerine göre doğal durumuna göre termal olarak daha kararlı olduğunu gösterir. Ayrıca, detoksifikasyon sürecinin, toksinin üçüncül yapısında yapısal değişiklikler getirdiğini gösterir.

Bu prosedürü denerken, hücrenin ve şırınganın çapraz kontaminasyonunu önlemek için yeterli miktarda deterjan ve su sağlamayı unutmamak önemlidir, çünkü berraklıkları doğru sonuçlar için çok önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, proteinlerin termal stabilitesini ve konformasyonunu değerlendirmek için bir yöntem olarak diferansiyel taramalı kalorimetriyi iyi bir şekilde anlayacaksınız. Ayrıca, ortaya çıkan termal çalışmalardan anlamlı kesintiler yapabileceksiniz.

Bu prosedürü takiben, açılma sırasında ikincil yapılarda meydana gelen değişikliklerle ilgili ek soruları yanıtlamak için dairesel dikroizm gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir. Aynı ürünün bir dizi için toplanan veriler, proses değişikliklerinin, formülasyonun ve depolama koşullarının aşı üretimi için protein antijenlerinin yapı konformasyonu üzerindeki etkisini incelemek için ampirik temeller oluşturmak için kullanılmıştır.