Yöntem HCN1 ve TRIP8b arasında protein-protein etkileşimi küçük molekül önleyicilerinin tespit edilmesi için

Bu prosedürün genel amacı, TRIP8b ve HCN kanalları arasındaki etkileşimi bozabilen küçük molekülleri tanımlamaktır. Bu yöntem, depresyon için yeni tedavilere dönüştürülebilecek aday molekülleri tanımlar. Bu tekniğin ana avantajı, yüksek verimli bir şekilde tamamlanabilmesidir.

Bu tekniğin, majör depresif bozukluk için yeni bir tedavinin geliştirilmesi için etkileri vardır, çünkü laboratuvarımız TRIP8b'nin HCN'ye bağlanmasının bozulmasının terapötik fayda sağlayabileceğini göstermiştir. Bu yöntem depresyon göz önünde bulundurularak geliştirilmiş olsa da, TRIP8b ve HCN arasındaki etkileşimi bozmak, kronik ağrı gibi diğer bozukluklarda terapötik fayda sağlayabilir. Bu protokolün görsel gösterimi önemlidir, çünkü Northwestern Üniversitesi'nin yüksek verimli analiz laboratuvarı gibi açık tesislerde temel ve translasyonel araştırmaları ilerletmek için otomatik yüksek verimli araçların kullanılmasının faydalarını göstermektedir.

TRIP8b 241-602 protein fragmanını saflaştırdıktan ve metin protokolüne göre pozitif bir kontrol ile protein protein etkileşimlerini inceledikten sonra, TRIP8b ve HCN1-FITC'nin alikotlarını çözün ve buz üzerinde tutun. 20 mililitre 2 mikromolar TRIP8b ve 50 nanomolar HCN1-FITC hazırlamak için FP Buffer'ı kullanın. Daha sonra, düşük bağlayıcı 384 kuyulu siyah mikrotitre plakasının her bir oyuğuna 25 mikrolitre karışım dağıtın.

Kütüphane taraması için, 40 mikromollük bir nihai konsantrasyon için 3 ila 22 arasındaki sütunların her birine 100 nanolitre bileşik dağıtmak için akustik bir sıvı işleyici kullanın. Negatif kontroller olarak sütun 1 ve 23'ün her bir kuyucuğuna 100 nanolitre DMSO dağıtın. 100 nanolitre etiketlenmemiş HCN1 peptidini, 10 mikromollük bir nihai konsantrasyon ile pozitif kontroller olarak sütun 2 ve 24'ün her bir oyuğuna dağıtın.

Plakaları oda sıcaklığında iki saat inkübe edin. Bir plaka okuyucu kullanarak floresan polarizasyonunu ölçün. Alternatif olarak, plakalar okumadan önce 4 santigrat derecede 16 saat saklanabilir.

Aşağıdaki denklemi kullanarak, XN'nin sinyale karşılık gelen normalleştirilmiş yüzde inhibisyon olduğu yüzde inhibisyon yüzdesini hesaplayın: X.X pozitif, pozitif kontrol kuyularından gelen ortalama sinyaldir ve X negatif, negatif kontrol kuyularından gelen ortalama sinyaldir. %50'nin üzerinde inhibisyona sahip Hits'i doğrulamak için, FP tamponunda 20 mililitre 2 mikromolar TRIP8b ve 50 nanomolar HCN1 TAMRA'dan oluşan bir ana karışım hazırlayın. 25 mikrolitre ana karışımı siyah 384 kuyulu bir mikrotitre plakasının her bir oyuğuna dağıtın.

Daha sonra, her bir aktif bileşiğin iki kat seri seyreltilmesini içeren bir plakadan 100 nanolitre bileşiği ilgili kuyucuklara ekleyin. Negatif kontrol kuyuları için 100 nanolitre DMSO ekleyin. Pozitif bir kontrol için, 200 mikromol ila 0.1 mikromol arasında değişen nihai konsantrasyonlara sahip 100 nanolitre seri olarak seyreltilmiş etiketlenmemiş HCN1 peptidi ekleyin.

Plakayı oda sıcaklığında iki saat veya 4 santigrat derecede 16 saat inkübe edin. Bir plaka okuyucu kullanarak floresan polarizasyonunu ölçün. 4 parametreli doğrusal olmayan regresyon modeli kullanarak her bir bileşiğin konsantrasyona bağlı FP verilerini uydurarak IC50 değerlerini hesaplayın.

HIS etiketli TRIP8b ve GST etiketli HCN1 füzyon proteinlerinin her biri bir alikot çözün ve buz üzerinde tutun. Test edilecek her bileşik için tahlil tamponunda 1 mililitre 200 nanomolar HIS TRIP8b ve 20 nanomol GST-HCN1C40 hazırlayın. Her bir bileşiği üç kopya halinde test etmek için A'dan N'ye kadar olan sıraların her sırası başına üç oyuğa 7 mikrolitre HIS-TRIP8b GST-HCN1C40 karışımı eklemek için 16 kanallı bir pipet kullanın.

Sıvıların her bir kuyucuğun dibinde olduğundan emin olmak ve kabarcıkları gidermek için plakayı kısaca santrifüjleyin. Daha sonra, A satırında 200 mikromollük bir nihai konsantrasyon elde etmek ve L satırında 0.1 mikromol ile bitirmek için test edilecek Hit bileşiklerini plakaya dağıtın.Aynı hacimde DMSO'yu M satırına ekleyin.Daha sonra etiketlenmemiş HCN1 peptidini 10 mikromollük bir nihai konsantrasyona dağıtın N satırına yerleştirin.Plakayı iki dakika çalkalayın ve oda sıcaklığında 2.5 saat inkübe edin. Tahlil tamponu kullanarak, Anti-GST alıcı boncuklarını 1 ila 50 arasında seyreltin.

16 kanallı bir pipetle, plakanın her bir oyuğuna 3,5 mikrolitre seyreltilmiş alıcı boncuk ekleyin ve kabarcık oluşturmamak için hafifçe pipetleyerek karıştırın. Plakayı karanlıkta oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Nikel Şelat donör boncuklarını, karışımı ışığa maruz bırakmadan test tamponu ile 1 ila 50 arasında seyreltin.

Plakanın her bir oyuğuna 3,5 mikrolitre seyreltilmiş donör boncuk ekleyin ve hava kabarcıklarını önleyerek hafifçe karıştırın. Plakayı kapatın ve karanlıkta oda sıcaklığında 1,5 saat inkübe edin. Ardından, burada listelenen ölçüm parametreleriyle plakayı okumak için bir plaka okuyucu kullanın.

Son olarak, 4 parametreli doğrusal olmayan regresyon modeli kullanarak her bir bileşik için verileri uydurarak IC50 değerlerini hesaplayın. HCN1 ile etkileşimi değerlendirmek için TAMRA TRIP8b, sabit bir HCN1 TAMRA konsantrasyonuna titre edildi. Bu grafik, TRIP8b konsantrasyonu arttıkça, daha fazla HCN1 TAMRA molekülünün bağlandığını ve polarizasyonun arttığını göstermektedir.

Bu deneyde, etiketlenmemiş HCN1, sabit bir TRIP8b ve HCN1 TAMRA konsantrasyonuna titre edildiğinde, etiketli peptit yer değiştirdi ve sinyal azaldı. Yüksek verimli bir tarama, grafikte tek noktalarla temsil edilen her bir bileşiğin yüzde inhibisyonunu gösterir. Bu ekranın sonuçları, pozitif ve negatif kontrollerle çizilir ve her bir bileşiğin testin iki çalışması boyunca ortalama yüzde inhibisyonu belirlenir.

% 50'den fazla inhibisyon gösteren bileşikler daha sonra bu deneyde doğrulandı. X ve Y koordinatları, testin iki çalışmasında yüzde inhibisyon ile belirlendi. Bu deneyde, HCN1C40, alıcı boncuklarını bağlayan bir uç terminal GST etiketi içerir.

TRIP8b'nin TPR alanlarının ve HCN1'in C terminal tripeptitinin etkileşimi, Singlet oksijen üretmek için donör boncuğu 680 nanometre dalga boyunda ışıkla uyarır. Son olarak, bu grafikte gösterildiği gibi, isabet bileşiği NUCC-5953'ün artan konsantrasyonlarının sabit bir TRIP8b konsantrasyonuna titrasyonu ve HCN1C40 TRIP8b HCN1 etkileşiminin inhibisyonunu arttırmıştır. Yüksek verimli taramaya başlamadan önce, boncuk bazlı yakınlık analizlerinde protein preparatını ve floresan polarizasyonunu doğrulayın.

Proteinin yüksek saflıkta olduğundan emin olun. Birden fazla donma çözülme döngüsünden kaçınmak için proteini ayırın. Taze DMSO ve Triton dahil olmak üzere yüksek kaliteli reaktiflerin kullanılması önemlidir.

DMSO ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman uygun kişisel koruyucu ekipman giymek gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın. Bu prosedürü takiben, isabet eden bileşiklerin hücrelerde aktiviteye sahip olup olmadığını belirlemek için elektrofizyoloji ve akış sitometrisi gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, floresan polarizasyon tabanlı bir tahlil ile yüksek verimli bir ekranın nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız.