Diferansiyel Taramalı florimetri Kullanarak Protein-ligand Etkileşimleri belirlenmesi
13 Eylül 2014
Diferansiyel taramalı florimetri, proteinlerle etkileşimler için küçük molekül kütüphanelerini taramak için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Burada, küçük bir molekül ile protein ortağı arasındaki ayrışma sabitinin bir tahminini sağlamak için bu analizleri genişletmek için basit bir yöntem sunuyoruz.
Bu prosedürün genel amacı, bir protein ligand etkileşimi için ayrışma sabitini tahmin etmektir. Bu, ilk önce proteinin farklı ligand konsantrasyonları ile karışımlarının bir indikatör boya ile birlikte hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, proteinin açılımını izlemek için indikatörün floresansını kaydederken bu numuneleri ısıtmaktır.
Daha sonra, protein açılma eğrileri bir dizi erime sıcaklığına dönüştürülür. Son adım, ayrışma sabitini tahmin etmek için bu verileri uygun bir modele sığdırmaktır. Sonuç olarak, bir proteinin ligandları ile etkileşimini daha iyi anlamak için diferansiyel taramalı florometri kullanılır.
Bu tekniğin izotermal, titrasyon, kalorimetri ve yüzey plazma rezonansı gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, bu yöntemin çoğu enstitüde halihazırda mevcut olan bir cihazda yalnızca makul miktarlarda numune kullanılarak birkaç saat içinde tamamlanabilmesidir. Bu yöntem, ligandların proteinlere afinitesi ve etkileşimlerin göreceli gücü gibi protein kimyası alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler mücadele edecektir çünkü kullanılacak örneklem seçimi ve verilerin analizi hem zor olabilir.
Bu prosedüre başlamadan önce aşağıdaki çözümleri hazırlayın. Bu tabloda ayrıntıları verilen reaktifleri ve mevcut en yüksek konsantrasyonda ilgilenilen ligandın stoklarını ve ayrıca bu konsantrasyonun on kat altı seyreltmesini içeren bir karışım. Önceki verilerden yaklaşık bir ayrışma sabiti biliniyorsa, kd'nin üstünde ve altında en az iki konsantrasyon hazırlayın.
Burada örnek bir tablo gösterilmiştir. Sekiz kuyucuğun her birine 18 mikrolitre karışım ekleyin. A-Q-P-C-R plakasında, kalan yedi oyuğun her birine ilk oyuğa iki mikrolitre çözücü ekleyin, ligand seyreltme serisinin her bir üyesinden iki mikrolitre ekleyin.
Plakanın iyi bir şekilde sızdırmaz hale getirilmesini sağlamak için A-Q-P-C-R contasını plakanın üzerine yerleştirin. Plakanın ortasına bir el aplikatörü yerleştirin, contayı bir tarafa doğru düzleştirin ve ardından plakanın diğer yarısında tekrarlayın. Hava kabarcıklarını gidermek için plakayı iki dakika boyunca 500 kez G'de santrifüjleyin.
Ardından, plakayı birinci basamaklı bir QPCR cihazına yerleştirin. Kayaların filtrelediği erime eğrisi seçeneğini seçin ve hızlı rampa hızını seçin. Cihaz çalışmasının sonunda bir termal denatürasyon çalıştırın.
Ekrandaki analiz et düğmesine tıklayın. Sonuç dosyasını kaydedin. Protein termal kaydırma yazılımını açın.
Özellikler sekmesinde yeni bir etüt oluşturun. Bir ad verin ve koşullar sekmesinde ligandları detaylandırın. Deneme dosyaları sekmesine gidin ve kaydedilen sonuç dosyasını içe aktarın.
Her birinin içeriğini ayarlayın. Analiz sekmesine gidin ve sonuçları analiz etmek için analiz düğmesine basın. Tek başına çözücü varlığındaki proteinin bu şekilde gösterilene benzer bir sonuç verip vermediğini kontrol edin.
Daha sonra, replikasyon ağrısındaki sonuçlarda gözlenen erime sıcaklıklarını inceleyin. Bunun, artan ligand konsantrasyonu ile erime sıcaklığında net bir artış gösterdiğinden emin olun. Bu veriler, ekteki makalede açıklandığı gibi ayrışma sabiti için yaklaşık bir değer sağlamak için kullanılacaktır.
Bu çözeltiler, ayrışma sabitini, bu tabloda detaylandırıldığı gibi bir ana karışımı ve on kat seyreltilecek olan 15 farklı konsantrasyonda ligand stoklarını belirleme prosedürü için gereklidir. Son deneyde. İdeal olarak, tahmini kd'nin üstünde ve altında en az iki büyüklük sırası olan ligand konsantrasyonlarını dahil edin ve konsantrasyonları tahmini kd üzerinde ortalayın.
Burada örnek bir seyreltme serisi gösterilmiştir. Tahmini KD'nin büyüklük sırası içindeki yedi noktaya odaklanın ve bunun her iki tarafında dört nokta daha var. Bir seçenek varsa, doygun olan değerlere daha fazla puan ekleyin.
Ana karışımın uygun şekilde dağıtılması için bir rezervuar görevi görmesi için U tabanlı 96 oyuklu bir plakadaki sekiz oyuğun her birine 120 mikrolitre ana karışım ekleyin. Ardından, 18 mikrolitre ana karışımı bir PCR plakasının bir sütununa dağıtmak için sekiz kanallı bir pipet kullanın. Plaka üzerinde altıya sekiz desende toplam 48 dolu kuyu vermek için beş sütun daha tekrarlayın.
Daha sonra, sekiz kuyucuğun her birine 20 mikrolitre ligand sapı veya çözücü ekleyin. Başka bir U tabanlı 96 oyuklu plakada, sekiz kanallı bir pipet kullanarak, sekiz farklı ligand stoğu veya çözücüden iki mikrolitre aspire edin ve bunları, ana karışımla doldurulmuş PCR plakasının bir sütununa ekleyin. Aynı sekiz ligand veya çözücü stoğu ile tekrarlayın.
Diğer iki sütun için, kalan sekiz ligand veya çözücü stoğundan iki mikrolitre aspire edin ve bunları plakadaki dördüncü bir sütuna ekleyin. Bunu iki sütun daha için tekrarlayın. Bu, 16 ligand ve çözücü örneğinin tümü için üçlü örnekler verecektir.
A-Q-P-C-R contasını plakanın üzerine yerleştirin. Plakayı iki dakika boyunca 500 kez G'de santrifüjleyin. Plakayı QPCR cihazına yerleştirin ve cihaz çalışmasının sonunda daha önce belirtilen parametreleri kullanarak bir termal denatürasyon çalıştırın.
Ekrandaki analiz et düğmesine tıklayın. Sonuç dosyasını kaydedin. Protein termal kaydırma yazılımını açın.
Özellikler sekmesinde yeni bir etüt oluşturun. Buna bir ad verin ve koşullar sekmesinde ligandları detaylandırın. Deneme dosyaları sekmesine gidin, kaydedilen sonuç dosyasını içe aktarın ve her birinin içeriğini ayarlayın.
Analiz sekmesine gidin ve analiz düğmesine basın. Sonuçları göstermek için ekranın sol tarafındaki menüden çoğaltmalar sekmesini seçin. Üçlü olarak.
Üçlülerin ne kadar sıkı olduğuna bağlı olarak verilerin güvenilirliğini değerlendirin. Üçlüler zayıf tekrarlanabilirlik göstermelidir. Ham verileri yakından inceleyin.
Verileri hem boltman hem de türev yöntemlerini kullanarak analiz edin. Erime sıcaklığını değerlendirmek için, sonuçları çoğalt sekmesini seçin ve sonuçları çoğaltma grafiğinde, grafiği tm, boltzmann ve TM türevi arasında düğme ile değiştirin. Numune için daha fazla tekrarlanabilirlik sağlayan yöntemi seçin.
Çoklu geçişler gösteren numuneler için, türev yöntemini çoklu eriyik modunda kullanmak neredeyse her zaman en iyisidir. Dışa aktar sekmesini kullanarak Excel ile daha fazla araştırma için sonuçları dışa aktarın. Bu analize, Excel'de ligand konsantrasyonları ve erime sıcaklığının bir tablosunu oluşturarak başlayın.
GraphPad prizma yazılımını açın ve bir XY tablosu oluşturun. Ligand konsantrasyonları için X sütununu ve erime sıcaklığı sonuçları için Y sütununu kullanarak verileri girin. Analiz sekmesinde, doğrusal olmayan regresyon eğrisi sığdırma seçeneğini belirleyin.
Doğru modeli girmek için yeni'yi seçin ve yeni denklem oluşturun. Uygun denklemi tek bölge ligand bağlaması olarak ekleyin. Başlangıç değerleri için kurallar kutusunu seçin ve başlangıç değerleri için kuralları girin.
Proteinin nihai konsantrasyonuna girmek için P parametresini sabit eşit olarak sınırlayın. Analizi gerçekleştirmek için analiz et'i, verileri işbirlikçi bir modele sığdırmak için ek analizi veya verileri eğrilere sığdırmak için analiz et'i seçin. Erime sıcaklığındaki ikili değişimlerin gösterilmesi, ekteki protokol metninde açıklanmıştır.
Bu yöntem, hekzokinazın glikoz ile etkileşimini ölçmek için kullanıldı. İlk ekran, 0.2 ila 1.7 milimolar arasında olası bir KD önerir. Daha büyük bir ekranın sonuçları, 1.2 artı veya eksi 0.1 milimolar KD ile tek bir bağlanma olayı için modele iyi bir uyum gösterir, varsayılan HETO SQUA L transferaz WCBM, GTP'ye bağlanmada güçlü bir termal kayma gösterir.
İlk ekran, 200 ila 500 mikromolar arasında bir KD önerdi. Ayrıntılı bir deney, 120 artı veya eksi 20 mikromolar belirgin bir KD önerir. Bununla birlikte, X ekseni için logaritmik bir ölçek kullanıldığında, model ile aynı verilerin işbirlikçi bir modelle veri analizi arasında önemli bir tutarsızlık vardır, bu da WCBM'nin GTPA'ya bağlanmasında anti işbirlikçi olduğunu ima eder, varsayılan GSYİH 60 ile oldukça olağandışı bir sonuç gözlenir, oxy Beta D mano, Heur iki oh, ACE WCBI.
Ligand olmadan ve yüksek ligand konsantrasyonlarında, basit bir monofazik erime modeli gözlenir. Bununla birlikte, ara ligand konsantrasyonlarında, iki farklı erime zirvesi gözlenir. İki tepe seti arasındaki geçiş, bifazik erimenin modellenmesinin tüm konsantrasyon aralığı boyunca doza bağlıdır.
Ligandın bir oranının toplamı olarak, serbest ve yüksek ligand sonuçları verilere iyi bir uyum sağlar. Bu uyum, yüksek ligand konsantrasyonu için gözlemlenen sonucun tam doluluğa ekstrapolasyonu ile iyileştirilir. Ligand'a bağlı WCBI oranı için elde edilen veriler, basit bir bağlama modeline mükemmel bir uyum göstermektedir.
58 artı veya eksi iki mikromolar KD ile Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, uygun şekilde yapılırsa tekrarlar da dahil olmak üzere dört veya beş saat içinde yapılabilir. Sıcaklık bağımlılığı ve STA geometrisi gibi ek soruları yanıtlamak için tiptop ven floresan ve izotermal titrasyon kalorimetrisi gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, diferansiyel tarama gribi kullanarak bir etkileşimin ayrışma sabiti için bir tahminin nasıl belirleneceğini iyi anlamış olmalısınız.
Genel Bakış
Bu makale, protein-ligand etkileşimlerinin ayrışma sabiti tahmininde diferansiyel taramalı fluorimetri kullanımını sunmaktadır. Bu teknik, araştırmacıların proteinlerle küçük molekül etkileşimlerini verimli bir şekilde analiz etmelerine olanak tanır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Biyokimya
- Protein Kimyası
- Analitik Kimya
Arka Plan
- Diferansiyel taramalı fluorimetri, protein-ligand etkileşimlerini taramakta kullanılan bir yöntemdir.
- Bu teknik, bağlanma afinitelerinin hızlı bir değerlendirmesini sağlar.
- Izotermal titrasyon kalorimetrisi gibi geleneksel yöntemlere göre avantajlıdır.
- Bu etkileşimler hakkında anlayış, ilaç keşfi ve protein fonksiyon çalışmaları için kritik öneme sahiptir.
Çalışmanın Amacı
- Protein-ligand etkileşimlerinin ayrışma sabiti tahmin etmek.
- Bu yöntemi kullanan yeni araştırmacılar için basit bir protokol sağlamak.
- Protein-ligand bağlanma dinamiklerinin anlaşılmasını artırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Bir gösterge boyası ile protein-ligand karışımlarının hazırlanması.
- Protein açılımını izlemek için floresans kaydedilirken numunelerin ısıtılması.
- Açılım eğrilerinin erime sıcaklıklarına dönüştürülmesi.
- Ayrışma sabiti tahmin etmek için verilerin bir modele uyarlanması.
Ana Sonuçlar
- Yöntem, orta miktarlarda numune kullanarak hızlı analiz imkanı sunar.
- Sonuçlar, artan ligand konsantrasyonu ile erime sıcaklığında net bir artış gösterir.
- Verilerin güvenilirliğini değerlendirmek için üçlü örnekler kullanılarak analiz edilebilir.
- Teknik, ligand afinitesi ve etkileşim gücü hakkında bilgiler sağlar.
Sonuçlar
- Diferansiyel taramalı fluorimetri, protein-ligand etkileşimlerini incelemek için etkili bir araçtır.
- Yöntem erişilebilirdir ve birkaç saat içinde gerçekleştirilebilir.
- Daha karmaşık tekniklere güvenilir bir alternatif sunar.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Differential scanning fluorimetry (DSF) enables rapid, accessible estimation of protein-ligand dissociation constants using widely available qPCR instrumentation, reducing reliance on specialized biophysical equipment. This approach supports early-stage target validation by providing quantitative affinity data that informs hit triage and lead optimization decisions. By delivering binding insights within a single workday, DSF enhances predictive confidence in discovery pipelines and mitigates mechanistic ambiguity before committing resources to downstream assays.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through quantitative measurement of ligand-induced thermal shifts, clarifying binding affinity and stoichiometry.
- Operational Value: Supports functional target validation by detecting cooperative or independent binding sites using derivative analysis of melting curves.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by estimating dissociation constants from moderate data sets, allowing rapid comparison of ligand series for go/no-go decisions.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream workflows by generating reproducible melting temperature readouts across ligand concentration gradients.
- Quantitative Output: Delivers dissociation constant estimates via nonlinear regression fitting of thermal shift data, enabling standardized compound evaluation.
- Scalability: Leverages existing qPCR infrastructure for high-throughput compatibility, allowing triplicate measurements across 16 ligand concentrations in a single plate.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects early binding data to preclinical validation by identifying ligands with dose-dependent thermal shifts, such as GTP binding to WCBM transferase.
- Mechanistic De-risking: Reveals atypical binding behaviors (e.g., anti-cooperativity in WCBM-GTP or biphasic melting in WCBI) that inform target suitability before animal studies.
- Biomarker Alignment: Supports translational biomarker development by quantifying ligand occupancy effects on protein stability, as demonstrated in WCBI ligand-binding assays.
Pipeline & Workflow Integration
DSF fits within the discovery continuum from initial hit identification through lead optimization, providing affinity data that bridges primary screening and mechanistic follow-up.
- Discovery Biology: Tests target engagement hypotheses by measuring ligand-induced stabilization, supporting pathway clarification and target de-risking.
- Screening: Enables assay readiness through reproducible melting temperature measurements, with reliability assessed via triplicate sampling and derivative method selection.
- Analytics: Generates dissociation constant estimates via nonlinear regression of ligand concentration versus melting temperature, facilitating affinity ranking and SAR analysis.
- Translational Research: Links binding affinity to functional outcomes by modeling ligand-bound and free protein populations, as seen in WCBI occupancy calculations.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability across projects, requiring only protein, ligand, dye, and qPCR hardware, with minimal sample consumption.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target-ligand interactions by reducing mechanistic ambiguity through model-based dissociation constant estimation.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization via triplicate sampling, melt curve analysis, and software-driven baseline correction.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling rapid affinity screening prior to investment in low-throughput techniques like ITC or SPR.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by quantifying ligand affinity ranges (e.g., hexokinase-glucose KD 1.2±0.1 mM; WCBM-GTP KD 120±20 µM) to prioritize chemotypes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein handling, ligand solubility, and dye selection to avoid artifacts in thermal shift measurements.
- Dependent on access to qPCR instruments with melt curve capability and compatible analysis software (e.g., Protein Thermal Shift, GraphPad Prism).
- Necessitates cross-team standardization of ligand dilution schemes, replicate acceptance criteria, and model selection (single-site vs. cooperative) for consistent data interpretation.
- Involves adaptation considerations for proteins with complex unfolding (e.g., multi-domain or membrane proteins) where baseline transitions may obscure ligand-specific shifts.
- Limited by the assumption of two-state unfolding; data showing biphasic or non-standard melting (e.g., WCBI) require alternative modeling approaches as described in the protocol.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:29
Determination of an Approximate Value for the Dissociation Constant
4:32
Experimental Set-up for Determining the Dissociation Constant
8:55
Data Analysis to Determine the Dissociation Constant Under Thermal Denaturation
10:15
Results: Differential Scanning Fluorimetry Measures Protein-ligand Interactions
12:40
Conclusion
