Diferansiyel Taramalı florimetri Kullanarak Protein-ligand Etkileşimleri belirlenmesi

Bu prosedürün genel amacı, bir protein ligand etkileşimi için ayrışma sabitini tahmin etmektir. Bu, ilk önce proteinin farklı ligand konsantrasyonları ile karışımlarının bir indikatör boya ile birlikte hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, proteinin açılımını izlemek için indikatörün floresansını kaydederken bu numuneleri ısıtmaktır.

Daha sonra, protein açılma eğrileri bir dizi erime sıcaklığına dönüştürülür. Son adım, ayrışma sabitini tahmin etmek için bu verileri uygun bir modele sığdırmaktır. Sonuç olarak, bir proteinin ligandları ile etkileşimini daha iyi anlamak için diferansiyel taramalı florometri kullanılır.

Bu tekniğin izotermal, titrasyon, kalorimetri ve yüzey plazma rezonansı gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, bu yöntemin çoğu enstitüde halihazırda mevcut olan bir cihazda yalnızca makul miktarlarda numune kullanılarak birkaç saat içinde tamamlanabilmesidir. Bu yöntem, ligandların proteinlere afinitesi ve etkileşimlerin göreceli gücü gibi protein kimyası alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler mücadele edecektir çünkü kullanılacak örneklem seçimi ve verilerin analizi hem zor olabilir.

Bu prosedüre başlamadan önce aşağıdaki çözümleri hazırlayın. Bu tabloda ayrıntıları verilen reaktifleri ve mevcut en yüksek konsantrasyonda ilgilenilen ligandın stoklarını ve ayrıca bu konsantrasyonun on kat altı seyreltmesini içeren bir karışım. Önceki verilerden yaklaşık bir ayrışma sabiti biliniyorsa, kd'nin üstünde ve altında en az iki konsantrasyon hazırlayın.

Burada örnek bir tablo gösterilmiştir. Sekiz kuyucuğun her birine 18 mikrolitre karışım ekleyin. A-Q-P-C-R plakasında, kalan yedi oyuğun her birine ilk oyuğa iki mikrolitre çözücü ekleyin, ligand seyreltme serisinin her bir üyesinden iki mikrolitre ekleyin.

Plakanın iyi bir şekilde sızdırmaz hale getirilmesini sağlamak için A-Q-P-C-R contasını plakanın üzerine yerleştirin. Plakanın ortasına bir el aplikatörü yerleştirin, contayı bir tarafa doğru düzleştirin ve ardından plakanın diğer yarısında tekrarlayın. Hava kabarcıklarını gidermek için plakayı iki dakika boyunca 500 kez G'de santrifüjleyin.

Ardından, plakayı birinci basamaklı bir QPCR cihazına yerleştirin. Kayaların filtrelediği erime eğrisi seçeneğini seçin ve hızlı rampa hızını seçin. Cihaz çalışmasının sonunda bir termal denatürasyon çalıştırın.

Ekrandaki analiz et düğmesine tıklayın. Sonuç dosyasını kaydedin. Protein termal kaydırma yazılımını açın.

Özellikler sekmesinde yeni bir etüt oluşturun. Bir ad verin ve koşullar sekmesinde ligandları detaylandırın. Deneme dosyaları sekmesine gidin ve kaydedilen sonuç dosyasını içe aktarın.

Her birinin içeriğini ayarlayın. Analiz sekmesine gidin ve sonuçları analiz etmek için analiz düğmesine basın. Tek başına çözücü varlığındaki proteinin bu şekilde gösterilene benzer bir sonuç verip vermediğini kontrol edin.

Daha sonra, replikasyon ağrısındaki sonuçlarda gözlenen erime sıcaklıklarını inceleyin. Bunun, artan ligand konsantrasyonu ile erime sıcaklığında net bir artış gösterdiğinden emin olun. Bu veriler, ekteki makalede açıklandığı gibi ayrışma sabiti için yaklaşık bir değer sağlamak için kullanılacaktır.

Bu çözeltiler, ayrışma sabitini, bu tabloda detaylandırıldığı gibi bir ana karışımı ve on kat seyreltilecek olan 15 farklı konsantrasyonda ligand stoklarını belirleme prosedürü için gereklidir. Son deneyde. İdeal olarak, tahmini kd'nin üstünde ve altında en az iki büyüklük sırası olan ligand konsantrasyonlarını dahil edin ve konsantrasyonları tahmini kd üzerinde ortalayın.

Burada örnek bir seyreltme serisi gösterilmiştir. Tahmini KD'nin büyüklük sırası içindeki yedi noktaya odaklanın ve bunun her iki tarafında dört nokta daha var. Bir seçenek varsa, doygun olan değerlere daha fazla puan ekleyin.

Ana karışımın uygun şekilde dağıtılması için bir rezervuar görevi görmesi için U tabanlı 96 oyuklu bir plakadaki sekiz oyuğun her birine 120 mikrolitre ana karışım ekleyin. Ardından, 18 mikrolitre ana karışımı bir PCR plakasının bir sütununa dağıtmak için sekiz kanallı bir pipet kullanın. Plaka üzerinde altıya sekiz desende toplam 48 dolu kuyu vermek için beş sütun daha tekrarlayın.

Daha sonra, sekiz kuyucuğun her birine 20 mikrolitre ligand sapı veya çözücü ekleyin. Başka bir U tabanlı 96 oyuklu plakada, sekiz kanallı bir pipet kullanarak, sekiz farklı ligand stoğu veya çözücüden iki mikrolitre aspire edin ve bunları, ana karışımla doldurulmuş PCR plakasının bir sütununa ekleyin. Aynı sekiz ligand veya çözücü stoğu ile tekrarlayın.

Diğer iki sütun için, kalan sekiz ligand veya çözücü stoğundan iki mikrolitre aspire edin ve bunları plakadaki dördüncü bir sütuna ekleyin. Bunu iki sütun daha için tekrarlayın. Bu, 16 ligand ve çözücü örneğinin tümü için üçlü örnekler verecektir.

A-Q-P-C-R contasını plakanın üzerine yerleştirin. Plakayı iki dakika boyunca 500 kez G'de santrifüjleyin. Plakayı QPCR cihazına yerleştirin ve cihaz çalışmasının sonunda daha önce belirtilen parametreleri kullanarak bir termal denatürasyon çalıştırın.

Ekrandaki analiz et düğmesine tıklayın. Sonuç dosyasını kaydedin. Protein termal kaydırma yazılımını açın.

Özellikler sekmesinde yeni bir etüt oluşturun. Buna bir ad verin ve koşullar sekmesinde ligandları detaylandırın. Deneme dosyaları sekmesine gidin, kaydedilen sonuç dosyasını içe aktarın ve her birinin içeriğini ayarlayın.

Analiz sekmesine gidin ve analiz düğmesine basın. Sonuçları göstermek için ekranın sol tarafındaki menüden çoğaltmalar sekmesini seçin. Üçlü olarak.

Üçlülerin ne kadar sıkı olduğuna bağlı olarak verilerin güvenilirliğini değerlendirin. Üçlüler zayıf tekrarlanabilirlik göstermelidir. Ham verileri yakından inceleyin.

Verileri hem boltman hem de türev yöntemlerini kullanarak analiz edin. Erime sıcaklığını değerlendirmek için, sonuçları çoğalt sekmesini seçin ve sonuçları çoğaltma grafiğinde, grafiği tm, boltzmann ve TM türevi arasında düğme ile değiştirin. Numune için daha fazla tekrarlanabilirlik sağlayan yöntemi seçin.

Çoklu geçişler gösteren numuneler için, türev yöntemini çoklu eriyik modunda kullanmak neredeyse her zaman en iyisidir. Dışa aktar sekmesini kullanarak Excel ile daha fazla araştırma için sonuçları dışa aktarın. Bu analize, Excel'de ligand konsantrasyonları ve erime sıcaklığının bir tablosunu oluşturarak başlayın.

GraphPad prizma yazılımını açın ve bir XY tablosu oluşturun. Ligand konsantrasyonları için X sütununu ve erime sıcaklığı sonuçları için Y sütununu kullanarak verileri girin. Analiz sekmesinde, doğrusal olmayan regresyon eğrisi sığdırma seçeneğini belirleyin.

Doğru modeli girmek için yeni'yi seçin ve yeni denklem oluşturun. Uygun denklemi tek bölge ligand bağlaması olarak ekleyin. Başlangıç değerleri için kurallar kutusunu seçin ve başlangıç değerleri için kuralları girin.

Proteinin nihai konsantrasyonuna girmek için P parametresini sabit eşit olarak sınırlayın. Analizi gerçekleştirmek için analiz et'i, verileri işbirlikçi bir modele sığdırmak için ek analizi veya verileri eğrilere sığdırmak için analiz et'i seçin. Erime sıcaklığındaki ikili değişimlerin gösterilmesi, ekteki protokol metninde açıklanmıştır.

Bu yöntem, hekzokinazın glikoz ile etkileşimini ölçmek için kullanıldı. İlk ekran, 0.2 ila 1.7 milimolar arasında olası bir KD önerir. Daha büyük bir ekranın sonuçları, 1.2 artı veya eksi 0.1 milimolar KD ile tek bir bağlanma olayı için modele iyi bir uyum gösterir, varsayılan HETO SQUA L transferaz WCBM, GTP'ye bağlanmada güçlü bir termal kayma gösterir.

İlk ekran, 200 ila 500 mikromolar arasında bir KD önerdi. Ayrıntılı bir deney, 120 artı veya eksi 20 mikromolar belirgin bir KD önerir. Bununla birlikte, X ekseni için logaritmik bir ölçek kullanıldığında, model ile aynı verilerin işbirlikçi bir modelle veri analizi arasında önemli bir tutarsızlık vardır, bu da WCBM'nin GTPA'ya bağlanmasında anti işbirlikçi olduğunu ima eder, varsayılan GSYİH 60 ile oldukça olağandışı bir sonuç gözlenir, oxy Beta D mano, Heur iki oh, ACE WCBI.

Ligand olmadan ve yüksek ligand konsantrasyonlarında, basit bir monofazik erime modeli gözlenir. Bununla birlikte, ara ligand konsantrasyonlarında, iki farklı erime zirvesi gözlenir. İki tepe seti arasındaki geçiş, bifazik erimenin modellenmesinin tüm konsantrasyon aralığı boyunca doza bağlıdır.

Ligandın bir oranının toplamı olarak, serbest ve yüksek ligand sonuçları verilere iyi bir uyum sağlar. Bu uyum, yüksek ligand konsantrasyonu için gözlemlenen sonucun tam doluluğa ekstrapolasyonu ile iyileştirilir. Ligand'a bağlı WCBI oranı için elde edilen veriler, basit bir bağlama modeline mükemmel bir uyum göstermektedir.

58 artı veya eksi iki mikromolar KD ile Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, uygun şekilde yapılırsa tekrarlar da dahil olmak üzere dört veya beş saat içinde yapılabilir. Sıcaklık bağımlılığı ve STA geometrisi gibi ek soruları yanıtlamak için tiptop ven floresan ve izotermal titrasyon kalorimetrisi gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, diferansiyel tarama gribi kullanarak bir etkileşimin ayrışma sabiti için bir tahminin nasıl belirleneceğini iyi anlamış olmalısınız.