Name: Diferansiyel Taramalı florimetri Kullanarak Protein-ligand Etkileşimleri belirlenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 26 s
Description: Öğrenin, diferansiyel taramalı florimetri kullanarak protein-ligand etkileşimlerinin ayrışma sabitini nasıl tahmin edeceğinizi. Bu hızlı yöntem, ilaç keşfi ve protein fonksiyonu çalışmaları için bağlanma afinitesini değerlendirir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma, BBSRC'den (hibe numarası BB/H019685/1 ve BB/E527663/1) Exeter Üniversitesi'ne hibe ile finanse edilmiştir.

(Bir mertebe dahilinde yani) ayrışma sabiti için bir Yaklaşık Değer 1. Belirlenmesi <ol><li> Tablo 1 &#39;de ayrıntılı olarak açıklanan bir karışım hazırlayın. </li><li> Mümkün olan en yüksek konsantrasyonda söz konusu ligandın stokları hazırlanması ve bu daha sonra en altı ile on kez seyreltilmiş hali. Yaklaşık Kd önceki veri bilindiği durumda, en az iki konsantrasyonları yukarıda ve Kd altında olması hedeflenmektedir. </li><li> Bir kısım QPCR plaka sekiz kuyulara karışımı 18 ul. Birinci oyuğuna çözücünün 2 ul ekleyin. Kalan yedi kuyuda olarak her biri ligand seyreltme serisi (adım 1.2) her bir üyesi, 2 ul ekle. </li><li> Tablada QPCR sızdırmazlık yerleştirin. Levhanın iyi bir sızdırmazlık elde etmek için, plakanın ortasında (özel reaktiflerin tabloya bakınız) bir el aplikatörü yerleştirin. Bir tarafa mühür aşağı pürüzsüz, ve daha sonra diğer yarısı üzerinde tekrarplakası. </li><li> Hava kabarcıklarını çıkarmak için iki dakika boyunca 500 xg&#39;de plaka santrifüj. </li><li> Bir StepOne QPCR enstrüman plakası yerleştirin. (Bu 40 dakika boyunca 99 ° C bir rampa ardından 25 ° C&#39;de 2 dakika duraklama, ve daha sonra 2 dakika duraklama sağlar) &quot;Erime eğrisi&quot; seçeneği, ROX filtreleri seçin, ve hızlı rampa hızı seçin. Termal denatürasyon çalıştırın. NOT: bir çalışma gerçekleştirmek için komut dosyaları http online olarak mevcuttur: // <a href="http://www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular">www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular.</a> </li><li> Alet koşmak sonunda, ekranda &quot;Analiz&quot; butonuna tıklayınız. Sonuç dosyayı kaydedin. </li><li> Protein Termal Shift yazılımını açın. <ol><li> Yeni bir çalışma oluşturun; özellikler sekmesinde, bu bir ad verin ve Koşullar sekmesinde, detay ligandlar. </li><li> Deney Dosyaları sekmesinde taşı, ve kaydedilen sonuçlar dosyası (XXX.eds) ithal ve her iyi (şablon fil içeriğini ayarlamakes) yazarlarda mevcuttur. </li><li> Analiz sekmeye geçmek ve &quot;analiz&quot; düğmesine basın. NOT: Bu sonuçları analiz eder. Bu Excel İhracat sekmesini kullanarak daha fazla araştırma için sonuçları ihracat mümkündür. Sonuçlar bir sekme tasvir biçiminde ihraç edilmektedir. Excel&#39;de ihraç dosyasını açın ve hemen Excel formatında kaydetmek için en iyisidir. </li></ol></li><li> Sadece çözücü mevcudiyetinde protein Şekil 1A &#39;de gösterilene benzer bir sonuç verir olduğunu kontrol edin. Sonra, &quot;suret&quot; bölmesinde sonuçlarında gözlenen erime sıcaklıkları inceleyin. Bu artan ligand konsantrasyonu ile erime sıcaklığı belirgin bir artış gösterdiğinden emin olun. Not: erime sıcaklığı, ligand içermeyen protein arasındaki yarım olduğu İdeal olarak, bu (protein tam ligand bağlı olduğunu varsayarak) açık bir maksimum erime sıcaklığı ve yaklaşık Kd sağlayacaktırmaksimum. </li></ol> Ayrışma sabitinin belirlenmesi için 2. Deney hazırlığı <ol><li> Bir ana karışımı olarak Tablo 2&#39;de ayrıntıları verilen bir karışım hazırlayın. </li><li> Son deneyde on kat seyreltilerek on beş farklı konsantrasyonlarda stok ligand hazırlayın. İdeal olarak, konsantrasyonlarının yaklaşık Kd altında ve üstünde büyüklük en az iki sıra içerir ve tahmin edilen Kd konsantrasyonlarını merkezi. Bu iki tarafında başka dört puan ile, tahmini K d büyüklükte bir düzen içinde noktaların yedi odaklanın; bir seçim varsa, doyurarak değerlere daha fazla puanı bulunur. NOT: Gerekli, bu ligand stokları ligand çözünürlüğünün sınırlayıcı çift deneysel konsantrasyonda olduğu deneysel koşullar böyle değiştirmek mümkün değilse. </li><li> Master&#39;ın 120 ul ekleyinana karışımı elverişli bir şekilde sevk için bir rezervuar olarak hareket etmek, U-tabanlı 96 oyuklu bir plaka içerisinde sekiz çukurlara karıştırın. PCR plakasının bir kolonuna 18 ul dağıtılması için 8 kanallı pipet kullanın. Plaka üzerinde 8 x 6 deseninde 48 dolu gözenekli bir toplam elde etmek üzere bir başka beş sütun için tekrarlayın. </li><li> U-tabanlı 96 oyuklu bir plaka içerisinde, ayrı ayrı kuyucuklarına, 20 ligand stokların ul, veya solventin ekleyin. 8 kanallı pipet, aspire sekiz farklı bağlayıcı hisse senetleri (veya çözücü) 2 ul kullanma. Adım 2.3 master karışımı ile dolu PCR plaka bir sütun bu ekleyin. Iki başka sütunlar için aynı sekiz ligand / çözücü stokları ile tekrarlayın. Aspire 2 Geriye kalan sekiz ligandı ya da çözücü stoklarının ul, ve plakanın bir dördüncü sütunda bu ekleyin. Iki başka sütunlar için bu işlemi tekrarlayın. Bu, tüm 16 ligand ve çözücü numuneler için üç nüsha örnekler vereceğim. </li><li> Plaka üzerine yerleştirin QPCR conta (adım 1.4). </li><li> 500 xg&#39;de plaka santrifüjeİki dakika. </li><li> QPCR enstrüman plakası yerleştirin. Adım 1.6 belirtilen parametreleri kullanarak bir termal denatürasyon çalıştırın. </li><li> Alet koşmak sonunda, ekranda &quot;Analiz&quot; butonuna tıklayınız. Sonuç dosyayı kaydedin. </li><li> Protein Termal Shift yazılımını açın. Yeni bir çalışma oluşturun; özellikler sekmesinde, bu bir ad verin ve Koşullar sekmesinde, detay ligandlar. </li><li> Deney Dosyaları sekmesinde taşı, ve kaydedilen sonuçlar dosyası (XXX.eds) ithalat, ve de her içeriğini ayarlayın. NOT: şablon dosyalarını http online olarak mevcuttur: // <a href="http://www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular">www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular.</a> </li><li> Analiz sekmeye geçmek ve &quot;analiz&quot; düğmesine basın. <ol><li> Triplicates olarak sonuçlarını göstermek için ekranın sol tarafındaki menüden &quot;çoğaltır&quot; sekmesini seçin. Kopyaların nasıl sıkı dayalı verilerin güvenilirliğini değerlendirmek. ShoulTriplikat yoksul tekrarlanabilir olduğunu göstermek d yakından ham verileri incelemek. </li><li> Erime sıcaklığını değerlendirmek için Boltzmann&#39;ı veya Türev yöntemleri kullanılarak verileri analiz edin. &quot;Sonuçları Replicatea&quot; sekmesini seçin ve &quot;tarafından Plot:&quot; geçiş, &quot;sonuç arsa Replicatea&quot; in arasındaki düğme &quot;Tm - Boltzmann&quot; ve &quot;Tm - Türev&quot;. Numune için büyük üretkenlik sağlar yöntemini seçin. Excel Export sekmesini kullanarak daha fazla araştırma için sonuçları ihracat. NOT: Birden fazla geçişler göstermek numuneler için, birden fazla eriyik modunda Türev yöntemi kullanmak hemen hemen her zaman en iyisidir. Sonuçlar bir sekme tasvir biçiminde ihraç edilmektedir. Excel&#39;de ihraç dosyasını açın ve hemen Excel formatında kaydetmek için en iyisidir. </li><li> Sonuçların yeniden üretilebilirlik sağlamak için, ayrı bir günde bir tekrarı dahil olmak üzere, en az iki kez deney tekrarlayın. Veri analizi (aşağıya bkz: adım 3) ShouldKd değeri, ilk tahmin etmek için önemli ölçüde farklı olduğunu göstermektedir, yaklaşık Kd değerleri iyi bir dizi sağlamak için (adım 2.2) uygun olarak, ligand konsantrasyonlarının değiştirilmesi. </li></ol> 3. Veri Analizi renatürasyonun altında ayrışma sabiti belirleme <ol><li> Ligand konsantrasyonlarının Excel&#39;de bir tablo ve erime sıcaklığını oluşturun. </li><li> GraphPad Prism yazılımı açın ve bir XY tablo oluşturun. Ligand konsantrasyonu ve sıcaklık sonucu erime için Y sütun için X kolonu kullanılarak, veri girin. NOT: Gösterilen bir örnek Şekil 1B olduğunu. Önceden yüklenmiş denklemler ve SPSS istatistik paketi kullanılarak alternatif talimatları ile bir komut dosyası, http online olarak mevcuttur: // <a href="http://www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular">www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular.</a> </li><li> Analiz sekmesinde, analiz parametresini değiştirmek için seçeneği seçins (Ctrl + T). , Doğru modeli giriniz &quot;Yeni&quot; seçin ve &quot;yeni bir denklem oluşturma&quot; için. &quot;Tek sitesi ligand bağlanma&quot; olarak Tablo 3&#39;te detaylı denklemi yerleştirin. NOT: Bu adımların bir örneği Şekil 1C gösterilmiştir. Denklemleri önceden yüklenmiş ile komut kullanırken, ilgili denklem listede yerine girdi seçilebilir yönlendirilebilir. Bu denkleminin ekte verilmiştir. </li><li> Kutusunda &quot;Başlangıç ​​Değerlere için Kurallar&quot; seçin ve Tablo 3&#39;te ayrıntılı olarak başlangıç ​​değerleri için kurallar girin. </li><li> (Ligand verilmektedir aynı birimlerinde) ve protein nihai konsantrasyona girmek &quot;ile sürekli eşit&quot; olarak, parametre P sınırlandırmaktadır. </li><li> Analizi gerçekleştirmek için Tamam seçeneğini seçin. NOT: Bu adımların bir örneği Şekil 1D gösterilmiştir. Grafik yazılımı veri ve modele uyum gösteren bir figür oluşturur. T örnekleriöz konusu analizler temsilci verileri gösterilmiştir. </li></ol> Kooperatif Modelleri 4. Uydurma Veri Basit bir kooperatif modeli, ya da iki ayrı ayrılma sabitler tanımlanmıştır model seçmesini, bir kooperatif modeli veri sığdırmak için. Birinci yaklaşım, negatif işbirliğinden durumunda tercih edildiği veya ilk araştırma olarak edilir. Ancak, prensipte iki farklı ayrışma sabiteleri 18 modellemek için pozitif bir birliktelik durumlarda daha iyidir. Bu durumda, ardışık modelleme ligand bağlanma ya da ligandların bağlanma ya da bağımsız olarak varsayarak devam edebilir. <ol><li> , &quot;Basit kooperatif modeli&quot; olarak listelenen Tablo 3 denklemlerin birini yerleştirin, adım 3.3 de, Ancak protokolde 3. olarak &quot;iki ligandların Sıralı bağlama&quot; aynı ilk adımları uygulayın, veya 18 &quot;Bağımsız iki ligandların bağlanması&quot;. </li><li> Başlangıç ​​değerleri için ilgili kuralları seçinTablo 3&#39;te bu denklemlerin her biri ile ilişkili. </li><li> Verilere modelin uyum inceleyin. Veri kötü uygun olmalıdır, başka bir model düşünün. NOT: ayrıca dikkatle Protein Termal Shift yazılımıyla (adım 2.9) ile veri erime sıcaklığına takılmasını incelemek önemlidir: bazen iyi sonuçları almak için buraya parametrelerini değiştirmek için gereklidir. K d iki tarafında sınırlı bir veri seti, ya da (özellikle yüksek ligand konsantrasyonlarda) tek bir anormal noktası, ya önemli ölçüde etkileyebilir: Başka bir göz veri noktalarının aralığı ideal ve herhangi bir anormal noktaları olup olmadığını olmadığıdır Sonuçlar. </li><li> Yeniden üretilebilirlik sağlamak için en az iki kez (adım 2.12) deney tekrarlayın. </li></ol> Erime Sıcaklığı İkili kaydırır gösteriliyor Curves 5. Uydurma Veri Bazen, yerine ligand bir derecelendirilmiş cevaptan daha, proteinler olmuşturÖrnek açık bir şekilde bağlanmış, bağlanmamış numune ayrılır bir ikili yanıtı kabul görülmektedir. Bir örnek, temsili sonuçlar (Şekil 4) sağlanır. Bu durumda, erime sıcaklıklarının montaj Kd için iyi bir uyum sağlamaz. <ol><li> Protein Termal Shift yazılım ham veri çıkışı ihracat. Her sıcaklık noktası için, sıfır ligand için ortalama floresan ve en yüksek ligand konsantrasyonlarının hesaplanması. Bu yanında, her bir veri noktasından sonuçları çizelgeye. NOT: Burada oluşturulan hata monte erime sıcaklıklarında hata daha azdır. </li><li> SPSS istatistik paket açın. SPSS bir veri pencerede her bir deney için sıcaklıkları, iki ortalama veri setlerini ve verileri kopyalayın. Değişken sekmesinde, &quot;düşük&quot; olarak ligandsız için ortalama veri kümesi ve &quot;yüksek&quot; olarak en yüksek ligand konsantrasyonu için ortalama veri kümesi ayarlayın. </li><li> Mevcut sözdizimi dosyasını indirinonline olarak http: // <a href="http://www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular">www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular</a> . &quot;Çalıştır → Çalıştır tüm&quot; seçiniz. </li><li> İlgili ligand konsantrasyonlarında, yeni bir Excel çalışma kitabına orantılı bağlı sonuçları kopyalayın. </li><li> Graphpad yazılımını açın ve bir XY tablo oluşturun. Ligand konsantrasyonu ve sıcaklık sonucu erime için Y sütun için X kolonu kullanılarak, veri girin. Analiz sekmesinde, &quot;değişim analizi parametreleri&quot; seçeneğini seçin. , Doğru modeli giriniz &quot;Yeni&quot; seçin ve &quot;yeni bir denklem oluşturma&quot; için. &quot;Erime sıcaklığı ikili vardiya Analizi&quot; olarak listelenen Tablo 3&#39;te verilen denklemi girin. </li><li> &quot;İlk Değerler Kuralları&quot; kutusunu seçin ve Tablo 3&#39;te detaylı başlangıç ​​değerleri için kurallar girmek. &quot;Için Sabit eşit&quot; olarak, parametre P sınırlama ve liga gibi aynı birimlerde (protein nihai konsantrasyonu girinnd) verilmiştir. NOT: 3. bölümde protokol için bu kutucukları doldurulduktan örnekleri Şekil 1C, D gösterilmiştir. </li><li> Iyi bir uyum varsa, sonuçlar sonsuz ligand konsantrasyonunda beklenen sonuca ekstrapolasyonuyla geliştirilebilir. Her bir ligand konsantrasyonu bağlanmış olan oranının model, ligand konsantrasyonu ve en yüksek değeri değeri inceleyin. Bu 0.99 veya daha büyükse, daha fazla analiz sonuçları iyileştirmek mümkün değildir. </li><li> 0,99 oranı daha az ise, ilave bir aşama, en yüksek ligand konsantrasyonu numunede bağlanmamış proteinin etkilerini gidermek için gereklidir. Aşama 5.2 &#39;de, (başka bir hücre kullanılabilir, ve R2&#39;nin Tablo 3&#39;te denkleme uygun şekilde değiştirilmesi) hücre R2 içinde (adım 5.7), en yüksek ligand konsantrasyonu noktasında bağlanmış ligand oranını mal. Yüksek ligand konsantrasyonu sonuçlarının sonra ortalama fazladan bir sütun oluşturun. FirsT hücresi &quot;lıgand konsantrasyonunu sonsuz uyarlanabilme&quot; olarak Tablo 3&#39;te listelenen denklemi kopyalama. Bu sütundaki kalan hücrelere bu formülü kopyalayın. NOT: Bu hesaplama, en yüksek ligand konsantrasyonuna bağlı olmayan proteinin etkisini ortadan kaldırır. Ligand serbest protein ve en yüksek ligand konsantrasyonu arasındaki fark, her bir sıcaklık noktasında tamamen bağlanmış ve bağlanmamış proteinin durumlar arasında beklenen farkı sağlamak için yüksek ligand konsantrasyonu bağlanmış olan oranının tersi ile çarpılır. Bu fark, ilave ya da tam ligand bağlı proteini için beklenen floresan vermek üzere bağlanmamış durumda çıkartılmaktadır. </li><li> Bu yeni sütun ile SPSS veri sayfasında maksimum ligand konsantrasyonu için sütun değiştirin ve veri uydurma tekrarlayın. NOT: - model maksimum konsantrasyon derecesinden bağ bağlanmış olan orantılı bir başka önemli bir değişikliği ortaya çıkardığı takdirde 5.9 tekrar edilmesi gerekebilir 5.7 adımları(Bu durumda eğer, muhtemelen dahil daha yüksek bir ligand konsantrasyonu noktası deneyi tekrar ideal olacaktır) üzerine. </li><li> Protein, bir ikili kaydırma ve görüntüler kooperatif davranışı gösterir durumda, denklem aşama 4,1 olanlar ile ikame edilmelidir aşama 5.5 önerdi. &quot;Top&quot; ve &quot;Bottom&quot; parametreleri sırasıyla 1 ve 0 ile değiştirilmesi gerekir. </li><li> Yeniden üretilebilirlik sağlamak için en az iki kez (adım 2.12) deney tekrarlayın. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Freyer, M. W., Lewis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isothermal+titration+calorimetry%3A+experimental+design%2C+data+analysis%2C+and+probing+macromolecule%2Fligand+binding+and+kinetic+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isothermal titration calorimetry: experimental design, data analysis, and probing macromolecule/ligand binding and kinetic interactions.</a> Methods Cell Biol. 84, 79-113 (2008).</li>
<li>Ladbury, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calorimetry+as+a+tool+for+understanding+biomolecular+interactions+and+an+aid+to+drug+design%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Calorimetry as a tool for understanding biomolecular interactions and an aid to drug design.</a> Biochem Soc Trans. 38, 888-893 (2010).</li>
<li>Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+kinetics+and+affinities+of+protein+interactions+using+a+parallel+real-time+label-free+biosensor%2C+the+Octet%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet.</a> Anal Biochem. 377, 209-217 (2008).</li>
<li>Pantoliano, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density+miniaturized+thermal+shift+assays+as+a+general+strategy+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">High-density miniaturized thermal shift assays as a general strategy for drug discovery.</a> J Biomol Screen. 6, 429-440 (2001).</li>
<li>Senisterra, G., Chau, I., Vedadi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermal+denaturation+assays+in+chemical+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev+Technol%22%5BJournal%5D)">Thermal denaturation assays in chemical biology.</a> Assay Drug Dev Technol. 10, 128-136 (2012).</li>
<li>Ericsson, U. B., Hallberg, B. M., Detitta, G. T., Dekker, N., Nordlund, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermofluor-based+high-throughput+stability+optimization+of+proteins+for+structural+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies.</a> Anal Biochem. 357, 289-298 (2006).</li>
<li>Lo, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+fluorescence-based+thermal+shift+assays+for+hit+identification+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Evaluation of fluorescence-based thermal shift assays for hit identification in drug discovery.</a> Anal Biochem. 332, 153-159 (2004).</li>
<li>Nettleship, J. E., Brown, J., Groves, M. R., Geerlof, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+protein+characterization+by+mass+spectrometry%2C+thermal+shift+%28ThermoFluor%29+assay%2C+and+multiangle+or+static+light+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Methods for protein characterization by mass spectrometry, thermal shift (ThermoFluor) assay, and multiangle or static light scattering.</a> Methods Mol Biol. 426, 299-318 (2008).</li>
<li>Niesen, F. H., Berglund, H., Vedadi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+differential+scanning+fluorimetry+to+detect+ligand+interactions+that+promote+protein+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The use of differential scanning fluorimetry to detect ligand interactions that promote protein stability.</a> Nat Protoc. 2, 2212-2221 (2007).</li>
<li>Geders, T. W., Gustafson, K., Finzel, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+differential+scanning+fluorimetry+to+optimize+the+purification+and+crystallization+of+PLP-dependent+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+Sect+F+Struct+Biol+Cryst+Commun%22%5BJournal%5D)">Use of differential scanning fluorimetry to optimize the purification and crystallization of PLP-dependent enzymes.</a> Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 68, 596-600 (2012).</li>
<li>Vedadi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+screening+methods+to+identify+ligands+that+promote+protein+stability%2C+protein+crystallization%2C+and+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Chemical screening methods to identify ligands that promote protein stability, protein crystallization, and structure determination.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 103, 15835-15840 (2006).</li>
<li>Davis, B. J., Erlanson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+from+our+mistakes%3A+the+%27unknown+knowns%27+in+fragment+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg+Med+Chem+Lett%22%5BJournal%5D)">Learning from our mistakes: the 'unknown knowns' in fragment screening.</a> Bioorg Med Chem Lett. 23, 2844-2852 (2013).</li>
<li>Larsson, A., Jansson, A., Aberg, A., Nordlund, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficiency+of+hit+generation+and+structural+characterization+in+fragment-based+ligand+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Efficiency of hit generation and structural characterization in fragment-based ligand discovery.</a> Curr Opin Chem Biol. 15, 482-488 (2011).</li>
<li>Scott, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+a+fragment-based+approach+to+target+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem%22%5BJournal%5D)">Using a fragment-based approach to target protein-protein interactions.</a> Chembiochem. 14, 332-342 (2013).</li>
<li>Cimmperman, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+model+of+thermal+stabilization+and+destabilization+of+proteins+by+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">A quantitative model of thermal stabilization and destabilization of proteins by ligands.</a> Biophys. J. 95, 3222-3231 (2008).</li>
<li>Matulis, D., Kranz, J. K., Salemme, F. R., Todd, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamic+stability+of+carbonic+anhydrase%3A+measurements+of+binding+affinity+and+stoichiometry+using+ThermoFluor%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Thermodynamic stability of carbonic anhydrase: measurements of binding affinity and stoichiometry using ThermoFluor.</a> Biochemistry. 44, 5258-5266 (2005).</li>
<li>Zubriene, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+nanomolar+dissociation+constants+by+titration+calorimetry+and+thermal+shift+assay+-+radicicol+binding+to+Hsp90+and+ethoxzolamide+binding+to+CAII%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Measurement of nanomolar dissociation constants by titration calorimetry and thermal shift assay - radicicol binding to Hsp90 and ethoxzolamide binding to CAII.</a> Int J Mol Sci. 10, 2662-2680 (2009).</li>
<li>Weiss, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hill+equation+revisited%3A+uses+and+misuses%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">The Hill equation revisited: uses and misuses.</a> FASEB J. 11, 835-841 (1997).</li>
<li>Cuccui, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+Burkholderia+pseudomallei+K96243+capsular+polysaccharide+I+coding+region%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Characterization of the Burkholderia pseudomallei K96243 capsular polysaccharide I coding region.</a> Infect Immun. 80, 1209-1221 (2012).</li>
<li>DeShazer, D., Waag, D. M., Fritz, D. L., Woods, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+Burkholderia+mallei+polysaccharide+gene+cluster+by+subtractive+hybridization+and+demonstration+that+the+encoded+capsule+is+an+essential+virulence+determinant%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Pathog%22%5BJournal%5D)">Identification of a Burkholderia mallei polysaccharide gene cluster by subtractive hybridization and demonstration that the encoded capsule is an essential virulence determinant.</a> Microb Pathog. 30, 253-269 (2001).</li>
<li>Berman, H., Henrick, K., Nakamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Announcing+the+worldwide+Protein+Data+Bank%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Announcing the worldwide Protein Data Bank.</a> Nat Struct Biol. 10, 980(2003).</li>
<li>Vivoli, M., Ayres, E., Beaumont, E., Isupov, M., Harmer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+WcbI%2C+a+novel+polysaccharide+biosynthesis+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22IUCr+Journal%22%5BJournal%5D)">Structural insights into WcbI, a novel polysaccharide biosynthesis enzyme.</a> IUCr Journal. 1 (1), 28-38 (2014).</li>
<li>Sorrell, F. J., Greenwood, G. K., Birchall, K., Chen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+differential+scanning+fluorimetry+based+high+throughput+screening+assay+for+the+discovery+of+affinity+binders+against+an+anthrax+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Biomed+Anal%22%5BJournal%5D)">Development of a differential scanning fluorimetry based high throughput screening assay for the discovery of affinity binders against an anthrax protein.</a> J Pharm Biomed Anal. 52, 802-808 (2010).</li>
<li>Uniewicz, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+scanning+fluorimetry+measurement+of+protein+stability+changes+upon+binding+to+glycosaminoglycans%3A+a+screening+test+for+binding+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Differential scanning fluorimetry measurement of protein stability changes upon binding to glycosaminoglycans: a screening test for binding specificity.</a> Anal Chem. 82, 3796-3802 (2010).</li>
<li>Wan, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+scanning+fluorimetry+as+secondary+screening+platform+for+small+molecule+inhibitors+of+Bcl-XL%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Differential scanning fluorimetry as secondary screening platform for small molecule inhibitors of Bcl-XL.</a> Cell Cycle. 8, 3943-3952 (2009).</li>
<li>Koropatkin, N. M., Holden, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+structure+of+alpha-D-glucose-1-phosphate+cytidylyltransferase+from+Salmonella+typhi%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Molecular structure of alpha-D-glucose-1-phosphate cytidylyltransferase from Salmonella typhi.</a> J Biol Chem. 279, 44023-44029 (2004).</li>
<li>Paleskava, A., Konevega, A. L., Rodnina, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamics+of+the+GTP-GDP-operated+conformational+switch+of+selenocysteine-specific+translation+factor+SelB%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Thermodynamics of the GTP-GDP-operated conformational switch of selenocysteine-specific translation factor SelB.</a> J Biol Chem. 287, 27906-27912 (2012).</li>
</ol>

Yazarlar açıklayacak hiçbir şeyleri olmadığını beyan ederler.

Diferansiyel tarama fluorimetry proteinleri karakterize ve potansiyel protein ligandları teşhis etmek için güçlü ve çok yönlü bir yöntem olarak gücünü göstermiştir. (Özellikle daha az iyi finanse laboratuvarlarda) protein stabilizasyonu, ilaç keşif ve hızlandırılması kristalleşme 10,23-25 ​​de iyi belgelenmiş başarıları bu bileşiklerin ilk taraması için cazip bir yöntem yaptık. Proteinlerine ilave bileşikler, belirgin bir erime sıcaklığı, 7,9 açıkça doza bağlı bir artış göstermektedir. Ancak, afinite için bileşikleri sıralaması yardımcı olmak için görünür bağlanma sabitleri belirlemek için bu deneylerin sonuçlarını kullanmak için birkaç girişimleri olmuştur. Burada, sistematik bir ligandın varlığında, proteinler için belirgin bir ayrışma sabiti belirlenmesi için bir yöntem sunulmaktadır. Burada sunulan sonuçlar DSF hızlı ve güçlü bir şekilde için ayrışma sabitinin tahminleri sağlayabilir göstermektedirBir protein-lijand kombinasyonu. Gözlemlenen veriler parametrelerin olası değerine ilişkin varsayımlar yapmak için gerek kalmadan, K d hızlı bir belirlenmesini sağlamak üzere piyasada mevcut araçları ile manipüle edilebilir. Yöntem, istenilen protein hem de zaman içinde hasis olma, bazı benzer yöntemlere kıyasla önemli bir avantajı vardır. Burada tarif edilen deney, deney başına (üç kopya halinde tekrarlanan deneylerde yaklaşık 0.4 mg) bir protein 0.13 mg tüketecektir. Bu ortalama bir 40 kDa proteini ile tek bir deney benzer miktarda tüketmek izotermal titrasyon kalorimetri (ITC), olumlu ile karşılaştırır. Bu protokol için gerekli deneylerin tam set deney tek bir set için, hazırlık olmak üzere yaklaşık 4 saat etkilerdi. Yine, bu tür güçlü iken, genellikle en iyi verilerin elde etmek için önemli bir optimizasyon gerektirebilir ITC veya yüzey plazmon rezonansı gibi yöntemlere göre önemli ölçüde daha hızlı olması muhtemeldir. Bizim sonuçlar dikkatli ham verileri incelemek için bir gereklilik olduğunu ortaya koymaktadır, bu verilerin uygun erime sıcaklığını belirlemek için, ve erime sıcaklığı verilerinin uygun ayrışma sabiti belirlemek için. İlk sorun, protein erimesi üretilen ham veri şeklidir. Bazı durumlarda, şekil Şekil 1A gözlenene yaklaşık olmayabilir. Ortak sorunlar ligand düşük sıcaklık değişimleri, yüksek arka floresan ve sıcaklık sıradışı çoklu geçişleri içerir. Düşük sıcaklık geçişi ligandlann bir dizi bağlayıcı görülür. Bu yöntem için, en önemli parametre sıcaklık geçişi ile karşılaştırıldığında, Tm ölçüm hatasıdır. , Üçlü Ölçümlerin standart sapması bağlanmamış ve tam bağlı protein arasındaki erime sıcaklık geçişinin% 10'unu yok olduğunda veri genellikle gayet iyi takılabilir. Deneyimlerimiz bu nerede böyle tempıcaklık kaymalar, tek tek veri noktalan son derece hassas ise sadece 2 ° C, bu ayar, verilerin yerleştirilmesi için yeterli olabilir bulunmaktadır. İkinci bir konu alışılmadık eğrileri şekillenir. Ligan bağlama proteininin açılımı modları etkiler gibi bu, genellikle, serbest protein ve ligand bağlı şekilde farklılık gösterir. Bu durumda, kullanıcı, veri erime sıcaklığı ve ayrışma sabiti belirlemek için kullanılacak olan modellerin uygun dikkate alınarak kullanılabilen olmadığını değerlendirmelidir. Başka bir genel sorun, proteine ​​bir kofaktör eklenmesi (örneğin, heksokinaz örneğimizde MgCI2), en güvenilir veri elde etmek için gerekli olmasıdır. Bizim deneyim ilk okutmalarında iyi sonuçları elde etmek esastır aşamasında deneyde tüm olası faktörlerin dikkatli dikkate olmuştur. Ayrıca alternatif teorik tedaviler bu verilerin 15,17 özelliklerini ortaya çıkarabilir. Son olarak, bu C edilen bazı proteinler için nadir değildirontain doğal olarak yüksek eşiğe göstermek için hidrofobik bölgeler maruz bırakılmıştır. Başka yerde yoğun 6,9 gözden geçirilmiş, bu problemlere çözümler vardır. Özel olarak, kullanıcı (örneğin, Şekil 4) ve türevlerinin kullanılması durumunda, birden fazla erir modellenmelidir olup Boltzmann veya türevi modelleri kullanmak için olmadığını değerlendirmelidir. Açılımı termal modelleme iki yöntem Boltzmann yöntemi tutmasına eğrisine düzenli bir sigmoid şekli varsayarak, Boltzmann denklemi deneysel verilere uygun farklı. Bunun aksine, yöntem, her türev noktası (Şekil 1A 'da alt panel) deneysel veriler birinci türevi alır ve en birinci türevinin noktası olarak erime sıcaklığı dikkate alır. 3 ° C - türevi Yöntem genel olarak, yaklaşık 2 ile daha yüksek bir erime sıcaklığına döndürür. Çoğu protein, daha tutarlı döndürüriki yöntemden biri için sonucu (yani, üçlü deney için erime sıcaklığının standart hatası daha düşüktür). Bu genellikle iyice eğrisi açılma proteinin tam bir şekli ile ilgili olup, bu deneysel her durumda en iyi yöntemi belirlemek için gereklidir. Türevi modeli kullanıldığında, birden fazla erime olayları dikkate almak da önemlidir. Bazı veriler açıkça çoklu geçişler için kanıt göstermek ve bu durumlarda sonuçlar, bu birden fazla erime olayları modellenmiştir olmadığını yorumlamak daha kolay olması muhtemeldir. Bu protokolün bağlamında, ligand eklenmesi bir protein tersi (en termal kırılgan subdomain stabilize ederek, örneğin) bir tek geçiş birden fazla erime geçişleri sahip kaydırmaya veya neden olabilir genellikle böyledir. Bu nedenle ham veri kullanmak için iyi olacak hangi yaklaşım dikkate alınarak önce birlikte incelendiğinde olduğunu savunmaktadır. M takibenBireysel erime sıcaklıklarının odelling, başka sorunları protokol bölümünde sunulan modeller bu uydurma ortaya çıkabilir. Bu analiz, çoğunlukla gözlenen veri ve modelin arasındaki tutarsızlıkları vurgular gibi dikkatle, bir logaritmik ölçek kullanarak ayrışma sabiti denkleme uyum incelemek için zorunludur (e .g., Şekil 3). Elde edilen sonuçlar genel olarak sağlam iken, yorumlanması bakım verilerden daha iyi sonuçlar elde etmek için fırsat ve en anlama sahiptir. Bu verilerin gündeme belirli bir konu DSF de, birliktelik gösterebilir proteinler, ya da birden fazla bağlayıcı olaylara konulmalıdır yorumudur. Bu, şimdiye kadar sadece çok özel bağlama etkinlikleri (örneğin, WcbM, boyut dışlama kromatografisi ile, bir multimer olarak işlev gören en homologu 26 bir multimer olan protein, [bir veri sahip olmaları beklenir proteinler bu olguyu gözlemledikgösterilmiştir]). Bu günün tüm açık DSF denatürasyondan gözlenen olumsuz kooperativiteye enzim sonuçta olumsuz bir birliktelik göstereceğini belirtir ki değil: ziyade, bu yöntemleri daha geniş bir yelpazede kullanarak daha fazla iyice incelenmesi gerekir karmaşık bağlayıcı bir göstergesi olabilir. Bu tür proteinlerin daha kapsamlı çalışmaların ilginç etkilerini tespit etmek olasıdır ki, bize düşündürmektedir. Bu yöntemi kullanarak ayrışma sabiti için verilen değerler, genel olarak, izotermal titrasyon kalorimetrisi ve yüzey plazmon rezonansı gibi yöntemler tarafından sağlananlar gibi aynı mertebededir. Ancak, gözlenen mutlak değerleri, bu yöntemler kullanılarak gözlemlenen daha sıklıkla yüksektir. Bu, en azından kısmen ayrışma sabiti ligandı ile proteinin erime sıcaklığında görülmektedir gerçeğinin bir sonucudur. Bu Kd fizyolojik sıcaklıklarda daha yüksektir. Dissociation, sabit denklemler ile reaksiyonun sıcaklığı ile ilgili olup: <img alt="Denklem 1" src="/files/ftp_upload/51809/51809eq1.jpg"> [1] <img alt="Denklem 2" src="/files/ftp_upload/51809/51809eq2.jpg"> [2] (C θ standart referans konsantrasyonunu, Δ G reaksiyonun Gibbs serbest enerjisi değişim r, R, molar gaz sabitidir, Δ H reaksiyonda entalpi değişimi ve Δ S reaksiyonunda değişim entropi .) Bu yöntemin ölçülebilir aralığında ayrışma sabitleri ile reaksiyonları, genellikle olumsuz bir Δ Rg sahip olacak ve bu nedenle denkleme sıcaklığındaki bir artışın etkisi [1] ayrışma sabiti arttırılması olacaktır. Her iki Gibbs serbest enerjisini oluşturan Δ H ve Δ S terimler (denklemi [2]) sıcaklık vardıre göre 27 ve ayrışma sabitinin üzerindeki etki, bu sıcaklık bağımlılıkları büyüklüğü ve işareti bağlıdır ve zorunlu olarak etkileşim bağlı olacaktır. Sonuç olarak, bu yöntemle belirlenen ayrılma sabitleri oda sıcaklığında çalışmasına yöntemlerle belirlenen zaman daha yüksek olduğu beklenmedik bir durum değildir. Sıcaklık bağımlılık da, tabii ki, fizyolojik sıcaklıkta daha düşük sıcaklıklarda ayrışma sabiti temin etme eğilimindedir birçok yöntem, bir sorun teşkil etmektedir. Bu ITC farklı olarak, etiketlenmiş bir yöntem olduğu DSF yöntemin diğer bir sorun teşkil etmektedir. (SYPRO Turuncu) kullanılan flüoresan etiket hidrofobiktir ve bu nedenle bazı durumlarda proteinlerin hidrofobik ligandlan ile rekabet edebilir. Sonuç olarak, bazı durumlarda, elde edilen ayrışma sabiti yapay bağlı etiket ile rekabete yükseltilecek muhtemeldir. Bununla birlikte, çeşitli ligandların karşılaştırma (birincil kullanım içinDSF), afinite ile fark bileşiklerin sıralamasını etkiler için yeterince büyük olması olası değildir. Bu yöntemin olası bir dezavantajı, elde edilebilir tespit sınırıdır. Prensip olarak, doğru protein konsantrasyonunun% 50'den daha düşük olduğu, ve bu aralıkta daha değerleri şüpheli doğruluk olması muhtemeldir için Kd değerini ölçmek mümkün olmamalıdır. Aralığın bu sonunda algılama sınırı protein ve boya konsantrasyonlarının azaltılması ile biraz uzatılabilir iken, cihazın, söz konusu protein konsantrasyonundaki azalma daha da engeller. Benzer şekilde, duyarlılık üst ucu ligandın çözünürlükleri tarafından belirlenir. Kd için matematiksel olarak sağlam bir tahmininin elde edilmesi için, yaklaşık olarak bir ligand konsantrasyonu gerektirmektedir ligand-bağlı biçimde de mevcut olan protein,% 90 veri elde edilmesi için çok önemlidirly on kat K d (hayır birliktelik varsayarak). Saptama sınırı bu sebeple, ilgili tampon içinde ligandın çözünürlüğüne onda biri olacaktır. Bu yöntem algılama sınırları tipik olarak protein ve ligand bağlı mM 1 uM ila yaklaşık 1 ila 100 arasında olacağı anlamına gelir. Sonuç olarak, diferansiyel tarama fluorimetry proteinlerin geniş bir aralığına uygulanabilirdir çok yönlü bir tekniktir. Burada yer alan yöntem kullanılarak, hızla ve ucuz bir şekilde farklı ligandlar için bir proteinin afinitesini belirlemek mümkündür. Bu durum özellikle küçük laboratuvarlarda, protein saflaştırma ve istikrar uygulama, metagenomes enzimlerin işlevini veya spesifisitesini ortaya çıkması için büyük bir potansiyele sahiptir ve ilaç keşfi.

Bütün proteinler, diğer çok büyük moleküllerin basit iyon diğer moleküllerin çeşitli bir yelpazede değişen afinitelere sahip, bağlayacaktır. Birçok durumda, proteinler (örneğin, kinaz ATP bağlanma) normal fonksiyon parçası olarak küçük moleküllü ortaklara bağlanmaktadırlar. Diğer etkileşimleri fonksiyonu ile ilişkili olabilir, ancak araçları (kristalleşme başarısını yükseltir, veya çözelti içinde proteinlerin muhafazasına yardımcı olacak şekilde proteinleri stabilize örneğin küçük molekül) deneysel olarak yararlıdırlar; önleyicileri olarak hareket eden ve böylece enzimin aktivitesini modüle edebilen aktif alanlarının ve proteinlerin allosterik sitelere bağlanan küçük moleküller iken. Ortak protein molekülleri için afinitesini belirlemek için kullanılabilecek teknikler, geniş bir yelpazede bulunmaktadır. Izotermal titrasyon kalorimetre 1 bu tepkiler üzerine zengin bilgiler sunmaktadır yaygın olarak etiket ücretsiz, bir &quot;altın standart&quot; olarak görülüyor ve fırsatları sınırlıdırDeney rtifacts. Ancak, enstrümantasyon ve deneysel set-up otomasyon duyarlılığı son gelişmelere rağmen, hala protein gereksinimi açısından nispeten pahalı en iyi düşük-orta verim olmasıdır, ve orta ile etkileşimleri en uygundur yüksek afinite (Kd 100 uM ila 10 nM) 2&#39;dir. Böyle kayn veya iki tabakalı enterforemetre 3 teklif daha throughputs ve hassasiyet elde etmiş gibi diğer etiket ücretsiz yöntemler 100 Da gibi düşük küçük moleküllerin tespit. Ancak, bu yöntemler için yüksek verimlilik araçları nispeten pahalı, ilgili projelerin sürekli bir verimlilik olacak, sadece nerede haklı, ve pek çok akademik laboratuvarlara erişilemez olması muhtemel olan. Diferansiyel tarama fluorimetry (DSF veya thermofluor) birinci ilaç keşfi için bir yöntem olarak 2001 4&#39;te tarif edilmiştir. Bu metho olarakd, proteinleri bir floresan boya ile kuluçkalanır (başlangıçta naftalen-sülfonik boyalar kullanılmıştır), proteinlerin hidrofobik bölgelerine bağlanması üzerine flüoresanını değiştirir edilmektedir. Protein boya Numune daha sonra ısıtılır ve ısı arttıkça floresan izlenir. Proteinin, açılma ve proteinin hidrofobik parçaları maruz kalma sıcaklığı (Şekil 1A) bir fonksiyonu olarak floresansta bir karakteristik örneğini ortaya çıkarmaktadır. Deney, herhangi bir ticari kantitatif PCR cihazda küçük hacimlerde gerçekleştirilebilir ve bu nedenle tek bir deneyde, bir numune aynı anda çok sayıda (enstrüman modeline bağlı olarak, genellikle 48, 96 ya da 384 örnekleri,) test edilebilir. Deneyler genellikle örnekleri 5 yüksek kapasiteli analiz etme olanağı sağlayan bir saat civarında gerçekleştirilebilir. Metodolojiye daha fazla iyileştirmeler, daha iyi spektral özellikleri 6,7 ile boyaların benimsenmesini gördük </sup&gt;, genel veri analizi için araçlar ve ilk tarama 8,9 protokolleri önerdi. Yöntemin uygulama yelpazesi hazırlanması ve proteinlerin 10 depolanması için en iyi koşulları oluşturulması ve kristalleşme 11 yardım için potansiyel bağlanma ortakları belirlenmesi üzerine özel bir odaklanma ile, genişletilmiştir. Yöntemin, nispeten yüksek miktarda protein, görece düşük maliyetli bir (~ 2 reaksiyon başına ug) ve zayıf bağlanma molekülleri okuyan uygulanabilirliği Akademik bağlamda, özellikle 12-14, DSF parçası bazında ilaç tasarımı için değerli bir araç yaptı. Protein-ligand etkileşimleri okuyan DSF geniş uygulama olmasına rağmen, az sayıda çalışma bu çalışmalardan ayrılma sabitlerinin belirlenmesini tarif etmişlerdir. Ancak, bu seyrek veri veya bazı durumlarda e takılmalıdır birçok parametre ile, proteinin açılımı anlatan detaylı denklem üretmek eğilimi var7,15-17 stimated. Bu yöntemler, örneğin olağandışı geçişleri gösteren sıkı bağlayıcı bileşikler, ya da proteinler olarak, zor durumlarda özellikle önemlidir. Ancak, birçok laboratuvarlar için, bu ayrıntılı analizler rutin kullanım için çok zahmetlidir. Bu nedenle, farklı senaryolar için alternatif tedaviler öneriyoruz, ve bu farklı protein-ligand etkileşimleri kaynaklanan veri sığdırmak için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. Bizim yöntem ısmarlama veri analiz yazılımı mevcut olduğu için StepOne QPCR enstrümanı kullanır; bu, veri analizi hızlandırır iken, diğer cihazlarla elde edilen sonuçlar, daha önce yayınlanmış yöntemler kullanılarak 9 işlenebilir ve aynı alt analizi gerçekleştirilebilir.

<table><tbody><tr><td>StepOne gerçek zamanlı PCR cihazı</td><td>Life Technologies</td><td>4376357</td><td>DSF, diğer birçok cihazla birlikte gerçekleştirilebilir. StepOne cihazı, veri analizi için çok uygun bir yazılıma sahiptir.</td></tr><tr><td>Protein termal kaydırma yazılımı v1.0</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>4466037</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Hızlı optik 48 kuyulu plakalar&nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>4375816</td><td></td></tr><tr><td>Optik sızdırmazlık bandı&nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>4375323</td><td>Bio-rad parça no. 223-9444 alternatif bir tedarikçidir</td></tr><tr><td>U tabanlı 96 oyuklu plakalar</td><td>Fisher</td><td>11521943</td><td></td></tr><tr><td>SYPRO Turuncu</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>S6650</td><td>Daha küçük hacimli bir tedarikçi için Sigma parça no. S5692'yi kullanın</td></tr><tr><td>SPSS istatistik sürüm 20</td><td>IBM</td><td></td><td>Diğer istatistik paketleri de benzer işlevler sağlayacaktır</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 6.02</td><td>GraphPad</td><td></td><td>Diğer istatistik paketleri de benzer işlevsellik sağlayacaktır</td></tr><tr><td>El aplikatörü (PA1)</td><td>3M</td><td>75-3454-4264-6</td><td></td></tr><tr><td>Saccharomyces cerevisiae'den hekzokinaz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H5000</td><td></td></tr><tr><td>Glikoz</td><td>Fisher bilimsel</td><td>10141520</td><td></td></tr></tbody></table>

diferansiyel taramalı florimetri kullanarak protein-ligand etkileşimleri belirlenmesi

Determination of Protein-ligand Interactions Using Differential Scanning Fluorimetry

Yöntem çok çeşitli henüz protein arasındaki ayrışma sabiti belirlenmesi ve küçük molekülleri etkileşim için kullanılabilir. Ancak bunların çoğu uzman ekipmana ihtiyaç ve genellikle etkili güvenilir deneyler kurmak ve verileri analiz etmek için bir uzmanlık derecesi gerektirir. Diferansiyel tarama fluorimetry (DSF) artan ya da fizyolojik ortakları belirlemek için ya da vurma çıkarılması için küçük moleküller için etkileşen proteinlerin başlangıç ​​taranması için güçlü bir yöntem olarak kullanılmaktadır. Bu teknik, nicel PCR için uygun olan ve en enstrümantasyon kurumlarda kullanılabilir böylece uygun bir PCR makinesi sadece gerektirmesi avantajına sahiptir; protokollerin mükemmel bir aralık zaten mevcuttur; ve yöntemin birden fazla kullanım için literatürde güçlü örneği yoktur. Geçmiş çalışma DSF verilerinden ayrışma sabitleri hesaplarken çeşitli araçları önerdi, ancak bu matematiksel talep ediyorlar. Burada, demlenmeyeonstrate DSF deney verileri orta düzeyde bir miktarının sapma sabitlerini hesaplamak için bir yönteme ilişkindir. Bu veriler, tipik olarak toplanmış ve bir gün içerisinde analiz edilebilir. Biz basit bir bağlama olaylardan toplanan verileri sığdırmak için nasıl kullanılabileceğini farklı model göstermek ve kooperatif bağlanma veya bağlama bağımsız siteler mevcut nerede. Son olarak, biz standart modeller geçerli değildir bir durumda veri analizi bir örnek sunuyoruz. Bu yöntemler, ticari olarak temin edilebilen kontrol proteinleriyle ilgili toplanan verilerin, ve araştırma programı iki protein ile gösterilmiştir. Genel olarak, bizim yöntem araştırmacılar hızla DSF kullanarak protein-ligand etkileşimleri içine daha fazla fikir edinmek için basit bir yol sağlar.

Diferansiyel taramalı florimetri, proteinlerle etkileşimler için küçük molekül kütüphanelerini taramak için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Burada, küçük bir molekül ile protein ortağı arasındaki ayrışma sabitinin bir tahminini sağlamak için bu analizleri genişletmek için basit bir yöntem sunuyoruz.

Diferansiyel Taramalı florimetri Kullanarak Protein-ligand Etkileşimleri belirlenmesi

A wide range of methods are currently available for determining the dissociation constant between a protein and interacting small molecules. However, most ...

Bu prosedürün genel amacı, bir protein ligand etkileşimi için ayrışma sabitini tahmin etmektir. Bu, ilk önce proteinin farklı ligand konsantrasyonları ile karışımlarının bir indikatör boya ile birlikte hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, proteinin açılımını izlemek için indikatörün floresansını kaydederken bu numuneleri ısıtmaktır.Daha sonra, protein açılma eğrileri bir dizi erime sıcaklığına dönüştürülür. Son adım, ayrışma sabitini tahmin etmek için bu verileri uygun bir modele sığdırmaktır. Sonuç olarak, bir proteinin ligandları ile etkileşimini daha iyi anlamak için diferansiyel taramalı florometri kullanılır.Bu tekniğin izotermal, titrasyon, kalorimetri ve yüzey plazma rezonansı gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, bu yöntemin çoğu enstitüde halihazırda mevcut olan bir cihazda yalnızca makul miktarlarda numune kullanılarak birkaç saat içinde tamamlanabilmesidir. Bu yöntem, ligandların proteinlere afinitesi ve etkileşimlerin göreceli gücü gibi protein kimyası alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler mücadele edecektir çünkü kullanılacak örneklem seçimi ve verilerin analizi hem zor olabilir.Bu prosedüre başlamadan önce aşağıdaki çözümleri hazırlayın. Bu tabloda ayrıntıları verilen reaktifleri ve mevcut en yüksek konsantrasyonda ilgilenilen ligandın stoklarını ve ayrıca bu konsantrasyonun on kat altı seyreltmesini içeren bir karışım. Önceki verilerden yaklaşık bir ayrışma sabiti biliniyorsa, kd'nin üstünde ve altında en az iki konsantrasyon hazırlayın.Burada örnek bir tablo gösterilmiştir. Sekiz kuyucuğun her birine 18 mikrolitre karışım ekleyin. A-Q-P-C-R plakasında, kalan yedi oyuğun her birine ilk oyuğa iki mikrolitre çözücü ekleyin, ligand seyreltme serisinin her bir üyesinden iki mikrolitre ekleyin.Plakanın iyi bir şekilde sızdırmaz hale getirilmesini sağlamak için A-Q-P-C-R contasını plakanın üzerine yerleştirin. Plakanın ortasına bir el aplikatörü yerleştirin, contayı bir tarafa doğru düzleştirin ve ardından plakanın diğer yarısında tekrarlayın. Hava kabarcıklarını gidermek için plakayı iki dakika boyunca 500 kez G'de santrifüjleyin.Ardından, plakayı birinci basamaklı bir QPCR cihazına yerleştirin. Kayaların filtrelediği erime eğrisi seçeneğini seçin ve hızlı rampa hızını seçin. Cihaz çalışmasının sonunda bir termal denatürasyon çalıştırın.Ekrandaki analiz et düğmesine tıklayın. Sonuç dosyasını kaydedin. Protein termal kaydırma yazılımını açın.Özellikler sekmesinde yeni bir etüt oluşturun. Bir ad verin ve koşullar sekmesinde ligandları detaylandırın. Deneme dosyaları sekmesine gidin ve kaydedilen sonuç dosyasını içe aktarın.Her birinin içeriğini ayarlayın. Analiz sekmesine gidin ve sonuçları analiz etmek için analiz düğmesine basın. Tek başına çözücü varlığındaki proteinin bu şekilde gösterilene benzer bir sonuç verip vermediğini kontrol edin.Daha sonra, replikasyon ağrısındaki sonuçlarda gözlenen erime sıcaklıklarını inceleyin. Bunun, artan ligand konsantrasyonu ile erime sıcaklığında net bir artış gösterdiğinden emin olun. Bu veriler, ekteki makalede açıklandığı gibi ayrışma sabiti için yaklaşık bir değer sağlamak için kullanılacaktır.Bu çözeltiler, ayrışma sabitini, bu tabloda detaylandırıldığı gibi bir ana karışımı ve on kat seyreltilecek olan 15 farklı konsantrasyonda ligand stoklarını belirleme prosedürü için gereklidir. Son deneyde. İdeal olarak, tahmini kd'nin üstünde ve altında en az iki büyüklük sırası olan ligand konsantrasyonlarını dahil edin ve konsantrasyonları tahmini kd üzerinde ortalayın.Burada örnek bir seyreltme serisi gösterilmiştir. Tahmini KD'nin büyüklük sırası içindeki yedi noktaya odaklanın ve bunun her iki tarafında dört nokta daha var. Bir seçenek varsa, doygun olan değerlere daha fazla puan ekleyin.Ana karışımın uygun şekilde dağıtılması için bir rezervuar görevi görmesi için U tabanlı 96 oyuklu bir plakadaki sekiz oyuğun her birine 120 mikrolitre ana karışım ekleyin. Ardından, 18 mikrolitre ana karışımı bir PCR plakasının bir sütununa dağıtmak için sekiz kanallı bir pipet kullanın. Plaka üzerinde altıya sekiz desende toplam 48 dolu kuyu vermek için beş sütun daha tekrarlayın.Daha sonra, sekiz kuyucuğun her birine 20 mikrolitre ligand sapı veya çözücü ekleyin. Başka bir U tabanlı 96 oyuklu plakada, sekiz kanallı bir pipet kullanarak, sekiz farklı ligand stoğu veya çözücüden iki mikrolitre aspire edin ve bunları, ana karışımla doldurulmuş PCR plakasının bir sütununa ekleyin. Aynı sekiz ligand veya çözücü stoğu ile tekrarlayın.Diğer iki sütun için, kalan sekiz ligand veya çözücü stoğundan iki mikrolitre aspire edin ve bunları plakadaki dördüncü bir sütuna ekleyin. Bunu iki sütun daha için tekrarlayın. Bu, 16 ligand ve çözücü örneğinin tümü için üçlü örnekler verecektir.A-Q-P-C-R contasını plakanın üzerine yerleştirin. Plakayı iki dakika boyunca 500 kez G'de santrifüjleyin. Plakayı QPCR cihazına yerleştirin ve cihaz çalışmasının sonunda daha önce belirtilen parametreleri kullanarak bir termal denatürasyon çalıştırın.Ekrandaki analiz et düğmesine tıklayın. Sonuç dosyasını kaydedin. Protein termal kaydırma yazılımını açın.Özellikler sekmesinde yeni bir etüt oluşturun. Buna bir ad verin ve koşullar sekmesinde ligandları detaylandırın. Deneme dosyaları sekmesine gidin, kaydedilen sonuç dosyasını içe aktarın ve her birinin içeriğini ayarlayın.Analiz sekmesine gidin ve analiz düğmesine basın. Sonuçları göstermek için ekranın sol tarafındaki menüden çoğaltmalar sekmesini seçin. Üçlü olarak.Üçlülerin ne kadar sıkı olduğuna bağlı olarak verilerin güvenilirliğini değerlendirin. Üçlüler zayıf tekrarlanabilirlik göstermelidir. Ham verileri yakından inceleyin.Verileri hem boltman hem de türev yöntemlerini kullanarak analiz edin. Erime sıcaklığını değerlendirmek için, sonuçları çoğalt sekmesini seçin ve sonuçları çoğaltma grafiğinde, grafiği tm, boltzmann ve TM türevi arasında düğme ile değiştirin. Numune için daha fazla tekrarlanabilirlik sağlayan yöntemi seçin.Çoklu geçişler gösteren numuneler için, türev yöntemini çoklu eriyik modunda kullanmak neredeyse her zaman en iyisidir. Dışa aktar sekmesini kullanarak Excel ile daha fazla araştırma için sonuçları dışa aktarın. Bu analize, Excel'de ligand konsantrasyonları ve erime sıcaklığının bir tablosunu oluşturarak başlayın.GraphPad prizma yazılımını açın ve bir XY tablosu oluşturun. Ligand konsantrasyonları için X sütununu ve erime sıcaklığı sonuçları için Y sütununu kullanarak verileri girin. Analiz sekmesinde, doğrusal olmayan regresyon eğrisi sığdırma seçeneğini belirleyin.Doğru modeli girmek için yeni'yi seçin ve yeni denklem oluşturun. Uygun denklemi tek bölge ligand bağlaması olarak ekleyin. Başlangıç değerleri için kurallar kutusunu seçin ve başlangıç değerleri için kuralları girin.Proteinin nihai konsantrasyonuna girmek için P parametresini sabit eşit olarak sınırlayın. Analizi gerçekleştirmek için analiz et'i, verileri işbirlikçi bir modele sığdırmak için ek analizi veya verileri eğrilere sığdırmak için analiz et'i seçin. Erime sıcaklığındaki ikili değişimlerin gösterilmesi, ekteki protokol metninde açıklanmıştır.Bu yöntem, hekzokinazın glikoz ile etkileşimini ölçmek için kullanıldı. İlk ekran, 0.2 ila 1.7 milimolar arasında olası bir KD önerir. Daha büyük bir ekranın sonuçları, 1.2 artı veya eksi 0.1 milimolar KD ile tek bir bağlanma olayı için modele iyi bir uyum gösterir, varsayılan HETO SQUA L transferaz WCBM, GTP'ye bağlanmada güçlü bir termal kayma gösterir.İlk ekran, 200 ila 500 mikromolar arasında bir KD önerdi. Ayrıntılı bir deney, 120 artı veya eksi 20 mikromolar belirgin bir KD önerir. Bununla birlikte, X ekseni için logaritmik bir ölçek kullanıldığında, model ile aynı verilerin işbirlikçi bir modelle veri analizi arasında önemli bir tutarsızlık vardır, bu da WCBM'nin GTPA'ya bağlanmasında anti işbirlikçi olduğunu ima eder, varsayılan GSYİH 60 ile oldukça olağandışı bir sonuç gözlenir, oxy Beta D mano, Heur iki oh, ACE WCBI.Ligand olmadan ve yüksek ligand konsantrasyonlarında, basit bir monofazik erime modeli gözlenir. Bununla birlikte, ara ligand konsantrasyonlarında, iki farklı erime zirvesi gözlenir. İki tepe seti arasındaki geçiş, bifazik erimenin modellenmesinin tüm konsantrasyon aralığı boyunca doza bağlıdır.Ligandın bir oranının toplamı olarak, serbest ve yüksek ligand sonuçları verilere iyi bir uyum sağlar. Bu uyum, yüksek ligand konsantrasyonu için gözlemlenen sonucun tam doluluğa ekstrapolasyonu ile iyileştirilir. Ligand'a bağlı WCBI oranı için elde edilen veriler, basit bir bağlama modeline mükemmel bir uyum göstermektedir.58 artı veya eksi iki mikromolar KD ile Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik, uygun şekilde yapılırsa tekrarlar da dahil olmak üzere dört veya beş saat içinde yapılabilir. Sıcaklık bağımlılığı ve STA geometrisi gibi ek soruları yanıtlamak için tiptop ven floresan ve izotermal titrasyon kalorimetrisi gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, diferansiyel tarama gribi kullanarak bir etkileşimin ayrışma sabiti için bir tahminin nasıl belirleneceğini iyi anlamış olmalısınız.

determination-protein-ligand-interactions-using-differential-scanning

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu videoda, florofor etiketli Shwachman-elmas sendromu (SBDS) proteini ile uzama faktörü benzeri 1 GTPaz (EFL1) arasındaki etkileşimleri incelemek için floresan anizotropi tekniğini açıklıyoruz. SBDS proteinlerinin kademeli olarak artan EFL1 konsantrasyonları ile inkübe edilmesinde, iki protein arasında başarılı bir etkileşime işaret eden anizotropide sabit bir artış gözlenir.

Protein-Protein Etkileşimlerinin Floresan Anizotropi Tabanlı Tespiti

Bu video, bir biyomolekül ve bir ligand arasındaki etkileşimi incelemek için kullanılan bir teknik olan diferansiyel taramalı kalorimetriyi göstermektedir. Bir DNA aptamer ve bir termolabil ligandın bağlanması, numuneye tekrarlanan ısıtma ve soğutma döngüleri uygulanarak ve termodinamik analiz için taramalar elde edilerek incelenir.

DNA Aptamer-Terponabil Ligand Etkileşimini İncelemek için Diferansiyel Taramalı Kalorimetri

Burada protokolleri Bio-tabaka interferometrisi ile protein-protein etkileşimleri kinetik analizleri tarif eder. Hücresel enerji metabolizmasında yer alır F tipi ATP sintaz, bakteriler kendi ε alt birimi ile inhibe edilebilir. Biz, ε inhibitör C-terminal alanı ile katalitik kompleksinin etkileşimleri incelemek için Bio-tabaka interferometre adapte edilmiştir.

Protein-protein etkileşimleri ve Allosterik Ligand Etkileri Kinetiği Ölçüm Bio-katman Interferometri

Protein etkileşimleri bir hücrenin işlevi merkezinde yer alıyor. Kalorimetre ve spektroskopik teknikleri yaygın onları karakterize etmek için kullanılır. Burada Shwachman-Diamond Sendromu (SBD'ler) mutasyona uğramış protein ve Uzama faktörü benzeri 1 GTPaz (EFL1) arasındaki etkileşimi incelemek için bir araç olarak floresan anizotropi açıklar.

Protein-protein etkileşimleri çalışmak için aracı olarak floresan Anizotropi

Burada, pH modülasyonuna dayalı etiketsiz bir yöntem kullanarak protein-fosfoinositid etkileşimlerini incelemek için bir mikroakışkan platform bağlamında desteklenen bir lipid çift katmanı sunmaktayız.

PIP-on-a-chip: Protein-fosfoinositid Etkileşimlerinin Etiketsiz Bir Çalışması

Biz hızlı katlanır ve etkileşimleri ile thermolabile ligandlar diferansiyel tarama Kalorimetre kullanarak bağlama biyomoleküler karakterizasyonu için bir iletişim kuralı mevcut.

Biyomoleküler DSC profilleri ile hızlı bir şekilde katlanır ve etkileşimleri bağlama karakterize etmek için Thermolabile ligandlar ölçme

Ligand Assay'ın Diferansiyel Radyal Kılcal Etkisi (DRaCALA), orfeome kütüphanesi kullanarak bir organizmanın küçük ligand bağlayıcı proteinlerini tanımlamak için kullanılabilir.

Ligand Tahlilinin Diferansiyel Radyal Kılcal Etkisi ile Küçük Ligandların Bağlayıcı Proteinlerinin Tanımlanması (DRaCALA)

Hedef proteinin erime sıcaklığındaki değişiklikleri izlemek(yani,termal kayma tahlili, TSA), birkaç yüz bileşik parça kütüphanelerini taramak için etkili bir yöntemdir. İç triptofan floresanını ve parça taraması için hafif geri saçılmaları izlemek için robotik destekli nano-Diferansiyel Tarama Florüreti (nano-DSF) uygulayan bir TSA protokolü sunuyoruz.

Parça Bazlı Kurşun Keşfinde Tarama için Nano-Diferansiyel Tarama Florüretrisi

Bu protokol, bileşikler ve protein molekülleri arasındaki bağlanmayı tespit etmek için benzersiz bir yöntemi tanımlar ve minimum protein numune kaybı ve yüksek veri doğruluğu avantajları sunar.

Diferansiyel Taramalı Floresan ile CD40 Protein-Umbelliferon Etkileşiminin Tespiti

Bu protokol, Faz ve Diferansiyel Girişim Kontrast ilkeleri ve pratik uygulamalar (DIC) Mikroskopi...

Faz Kontrast ve Diferansiyel Girişim Kontrast (DIC) Mikroskopi

Öğrenin, diferansiyel taramalı florimetri kullanarak protein-ligand etkileşimlerinin ayrışma sabitini nasıl tahmin edeceğinizi. Bu hızlı yöntem, ilaç keşfi ve protein fonksiyonu çalışmaları için bağlanma afinitesini değerlendirir.

Diferansiyel Taramalı florimetri Kullanarak Protein-ligand Etkileşimleri belirlenmesi

Daha fazla video keşfet