Alginat Boncuklarda Memeli Hücre Kapsüllenmesinin Basit Bir Karıştırılmış Geminin Kullanımı

Bu videoda, aljinat boncuklarındaki pankreas adacıkları gibi memeli hücrelerini basit bir karıştırılmış kap kullanarak hareketsiz hale getirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Yöntemin prensibi, su ve yağ emülsiyonu ile aljinat damlacıkları oluşturmak ve ardından aljinat damlacıklarının iç jelleşmesidir. Prosedürün ilk adımı, aljinat hücreleri ve kalsiyum karbonat içeren sulu bir fazın bir mineral yağ organik fazında dağıtıldığı bir emülsiyon üretmekten oluşur.

İkinci adım, sulu faza hızla ayrılan asetik asit gibi yağda çözünür bir asit ekleyerek emülsiyonu asitleştirmektir. PH düşüşü, kalsiyum karbonatın çözünmesine ve aljinat damlacıklarının boncuklar halinde iç jelleşmesine yol açar. Son adım, sulu bir çözelti eklenerek boncukların emülsiyondan geri kazanılması, fazların santrifüjleme ile ayrılması ve ardından boncukların yıkanması ve filtrelenmesinden oluşur.

İmmobilize edilmiş hücreler daha sonra in vitro olarak kültürlenebilir veya transplantasyon için kullanılabilir. Tanımladığımız yöntem, aljinat boncukları oluşturmak için nozul bazlı hücre kapsülleyicilerinin kullanılmasına bir alternatiftir. Bu, ilk olarak 1992'de Poncelet ve diğerleri tarafından bildirilen enzimler ve mikrobiyal hücre immobilizasyonu için bir yöntemden türetilmiştir.

Bizi en çok ilgilendiren uygulama, reddetme önleyici ilaçlara olan ihtiyacı azaltmak veya hatta ortadan kaldırmak için nakledilen hücreleri immünoizole etmenin bir yolu olarak aljinat kapsüllemesidir. Emülsiyon bazlı prosesin nozul bazlı cihazlara göre temel avantajları, ölçeklenebilirliği ve sağlamlığıdır. Damlacıklar neredeyse aynı anda üretildiğinden, çok seyreltik veya çok konsantre aljinat çözeltilerinden çok kısa sürelerde çok büyük miktarlarda boncuk üretilebilir.

Dahası, proses çok sağlamdır ve arızaya eğilimli değildir ve hatta nozulları tıkayabilecek partiküllerin varlığında bile ve son olarak proses ekipmanı oldukça basittir ve bu nedenle çoğu laboratuvar için erişilebilir, çok nispeten düşük maliyetlidir. Temel işleme adımları, aljinat damlacıklarını oluşturmak için emülsifikasyon ve iç kalsiyum kaynağını serbest bırakmak için asitleştirmedir. Damlacık boyutu esas olarak pervane tasarımı, çalkalama hızı ve çalkalama süresinden etkilenir.

Boncukların mekanik özellikleri ve hücre sağkalımı, asitleşmenin kapsamı ve süresinden etkilenir. Bu videoda, transplantasyon için hücreleri %5 aljinat boncuklarında kapsüllemek için kullanılan bir yöntemi gösteriyoruz. Bu parametreler muhtemelen diğer potansiyel uygulamalar için optimizasyon gerektirecektir.

Yarı yarıya LVM ve MVG aljinat karışımı içeren% 5 aljinat boncukları oluşturmak için 583 miligram LVM ve 583 miligram MVG aljinik asit tozunu tartın. 20 mililitrelik işlem tamponunu manyetik bir karıştırma plakasına yerleştirin. Transplantasyon uygulamaları için pH 7.4'te 170 milimolar sodyum klorür içeren 10 milimolar HEPES tamponu kullanıyoruz.

Aljinik asit tozunu aşamalı olarak çözeltiye ekleyin. Çözeltiyi gece boyunca düşük hızda karıştırarak bırakın. Gerekirse, şişeyi karıştırma plakasına sabitleyin.

Ertesi gün, aljinat tam olarak çözülmezse, kavanozu döner bir karıştırıcıya sabitleyin ve gece boyunca 37 santigrat derecede karıştırmaya devam edin. Aljinat tamamen çözüldüğünde, çözeltiyi 30 dakika otoklavlayarak sterilize edin. Otoklavı açmadan önce sıcaklığın 50 santigrat derecenin altına düşmesine izin verin.

20 mililitre işlem tamponuna bir gram kalsiyum karbonat ekleyerek kalsiyum karbonat süspansiyonunu hazırlayın. Emülsiyon işlemi için kullanılan kalsiyum karbonat süspansiyonunu ve karıştırılmış kabı otoklavlayın. Kullanmadan önce, kaptaki yoğuşmuş su kalıntılarını temizleyin.

Emülsiyon işleminden hemen önce, 44 mikrolitre buzlu asetik asidi, 50 mililitrelik konik bir tüpe yerleştirilmiş 11 mililitre mineral yağ içinde çözün. Yaygın bir hata, asetik asidin eksik çözünmesi, 10 mikrolitreden daha küçük pipetleme miktarlarından kaçınılması ve asidin tekrarlanan girdaplama ile tamamen çözülmesini sağlamaktır. Hücre kapsüllemesine geçmeden önce tüm çözeltilerin oda sıcaklığına ulaşmasına izin verin.

Eğirme şişesine 10 mililitre mineral yağ koyun ve 250 RPM'de karıştırmaya başlayın. Beta-tc3 hücreleri gibi yapışık hücreler kullanılıyorsa, hücreleri tripsinize edin. Tam ortam ekleyerek reaksiyonu sonlandırın ve hücre sayımı için bir örnek alın.

Hücre konsantrasyonunu manuel olarak veya otomatik bir hücre sayacı ile belirleyin. Hücreleri 300 g'da yedi dakika santrifüjleyin ve ardından hücre paletini tam ortamda yeniden süspanse edin. Santrifüjleme adımını tekrarlayın ve ardından boncuklarda istenen nihai konsantrasyonun 10 ve 1/2 katını elde etmek için hücreleri uygun hacimde tam ortamda yeniden süspanse edin.

9.9 mililitre aljinat çözeltisini düz tabanlı bir tüpe aktarın, ardından 1.1 mililitre hücre stoğu ve 550 mikrolitre kalsiyum karbonat süspansiyonu ekleyin. Aljinat, kalsiyum karbonat ve hücre süspansiyonunu hafif girdaplama ile karıştırın. Bu karışımın 10.5 mililitresini hemen bir şırınga kullanarak çalkalama yağına aktarın.

Çalkalama oranını artırın ve ardından zamanlayıcıyı başlatın. Çalkalama oranını belirlemek için, önce boncuk boyutunu çalkalama hızıyla ilişkilendiren standart bir eğri oluşturulmalıdır. 12 dakika sonra, emülsiyonu asitleştirmek için 10 mililitre yağ ve asetik asit çözeltisi ekleyin, kalsiyumu karbonattan serbest bırakın ve jelleşmiş boncuklar elde edin.

Bu iç jelleşme adımı için sekiz dakika bekleyin. Fenol kırmızısı pH indikatörünü içeren emülsifiye damlacıkların renk değişimine dikkat edin. Çalkalama oranını 400 RPM'ye düşürün,% 10 orta ile karıştırılmış 40 mililitre proses tamponu ekleyerek asidi nötralize edin, bu da faz çevirmeye yol açar.

Çalkalamayı bir dakika sonra durdurun ve karışımı konik tüplere aktarın. Eğirme şişesini 20 mililitre daha fazla orta ile durulayın ve bunu tüplere ekleyin. Yağ fazını aspire etmeden önce mümkün olduğunca çok sulu çözeltiyi aspire edin.

Boncuk çökelmesini ve faz ayrımını hızlandırmak için tüpleri 630 g'da üç dakika santrifüjleyin. Bir Pasteur pipeti ile aspire ederek yağı ve fazla işlem tamponunu çıkarın. Boncukları, yıkamalar arasında 630 g santrifüj kullanarak en az bir kez orta derecede yıkayın.

Boncuk süspansiyonunu 40 mikron naylon hücreli süzgeçlerde süzün ve süzgeçteki fazla sıvıyı alttan aspire edin. Boncukları bir spatula kullanarak bilinen bir hacimdeki ortama aktarın. Boncuk hacmini ölçün ve istenen boncuk konsantrasyonunu elde etmek için ortamı doldurun.

Tipik bir konsantrasyon, beş mililitre toplam hacim başına bir mililitre boncuktur. Bu noktadan sonra, boncuklara zarar vermemek için boncukları her zaman geniş delikli pipetlerle tutun. Kapsüllenmiş hücreler artık T şişelerine aktarılabilir ve in vitro kültür veya transplantasyon için kullanılabilir.

Emülsiyon işleminin sonunda, hareketsiz hale getirilmiş hücreler içeren aljinat boncuklar elde edilmelidir. İşlemden sonra, boncuk boyutu dağılımı ve hücre sağkalımı rutin olarak değerlendirilmelidir. Boncuk boyutu dağılımını belirlemek için, boncuklar toluidin mavisi ile boyanabilir ve ardından görüntü analizi yapılabilir.

Bu prosesten geniş bir damla boyutu dağılımı beklenir. Hücre sağkalımını değerlendirmek için boncuklar, kalsein-ve etidyum homodimer gibi canlı ölü lekelerle inkübe edilebilir. Bu videoda açıklanan işlem kullanılarak,% 76 beta-tc3 hücre sağkalımı ölçüldü.

Bu videoyu izledikten sonra, basit bir karıştırma sistemi kullanarak aljinat boncuklarındaki memeli hücrelerinin nasıl hareketsiz hale getirileceğini iyi anlamış olmalısınız. Bu videoda gösterilen temel protokol, çok çeşitli aljinat türleri ve kalsitrasyonlar kullanarak çeşitli hücre tiplerini hareketsiz hale getirmek için uygun olmalıdır. Ortalama boncuk boyutunu, aljinat veya yağın her yeni lotu ile çalkalama oranıyla ilişkilendiren standart bir eğri oluşturmanızı öneririz.

Tanımladığımız emülsifikasyon işlemi, nozul bazlı hücre kapsülleyicilerine umut verici bir alternatiftir. Aljinat boncuklarındaki memeli hücrelerini hareketsiz hale getirmek için sağlam ve basit bir yöntemdir. Biz ve dünyanın dört bir yanındaki diğerleri nozül hücre tedavileri geliştirirken, binlerce diyabetik hasta için bu tür ölçeklerde yöntemlere ihtiyaç duyulacaktır.

Bir beta hücre hattının %5 aljinat boncuklarında nakledilmesinden elde edilen umut verici sonuçları yayınladık ve nakil reddine karşı bu geliştirilmiş bariyerin in vivo performansını keşfetmeye devam ediyoruz.