Diffüz İçsel Pontine Glioma Hızlı post-mortem Hücre Kültürü için Protokol (DIPG)

Bu hızlı ölüm sonrası hücre kültürü protokolünün genel amacı, DIPG için etkili tedavileri anlamak ve nihayetinde geliştirmek için gerekli deneyleri kolaylaştırmak için diffüz intrinsik pontin gliomunun dayanıklı hasta kaynaklı hücre kültürlerini oluşturmaktır. Bu yöntem, bazı ilaçların hastadan türetilen farklı kültürlerde işe yarayıp yaramadığı gibi, diffüz intrinsik pontin gliomunun temel biyolojisi ve terapötik stratejileri hakkındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, hasta kaynaklı hücrelerin biyolojisinin doğrudan incelenmesine izin vermesidir.

Bu tekniğin etkileri, hastalığın farklı genetik alt tiplerinde farklı terapötik stratejilerin test edilmesine izin verdiği için DIPG tedavisine kadar uzanır. Bu yöntem DIPG hakkında bilgi sağlayabilse de, diğer pediatrik yüksek dereceli gliomlar, yetişkin glioblastomlar veya diğer merkezi sinir sistemi tümörleri gibi diğer hastalıklara da uygulanabilir. Genel olarak, bu tekniğe yeni olan kişiler mücadele edecektir, çünkü otopsi örneklerini verimli bir şekilde temin etmek ve hızlı bir şekilde işlemek zordur.

Numune hazırlamadan önce, doku kültürü başlığını, tıraş bıçakları, kavisli kanama durdurucular ve diğer steril olmayan aletlerle birlikte UV ışığı altında bir saat boyunca sterilize edin ve steril koşullar altında aşağıdaki tüm adımları gerçekleştirin. Daha sonra, dokuyu yüksek duvarlı 100 milimetreye 20 milimetre hücre kültürü kabına aktarın. Nakliyeden kalan ortamı çıkarın ve 10 ila 15 mililitre soğuk kültür ortamı ile değiştirin.

Ardından, bir tıraş bıçağını kavramak için kavisli kanama durdurucuları kullanarak, kan damarlarını veya meninksleri çıkarırken dokuyu ince bir şekilde kıyın. Son doku parçaları bir milimetreden daha küçük olmalıdır. Daha sonra, dokuyu 50 mililitrelik temiz bir konik tüpe aktarın.

Hücre kültürü kabını ilave beş mililitre soğuk kültür ortamı ile yıkayın ve numuneyi konik tüpe aktarın. Kalan dokuyu aktarmak için bu yıkama adımını gerektiği kadar tekrarlayın. 10 mililitrelik serolojik bir pipet kullanarak, numuneyi dört ila beş kez hafifçe ezin.

Daha büyük doku parçalarının tüpün dibine yerleşmesine izin verin. Gerekirse, numuneyi bir dakika boyunca kısa bir süre santrifüjleyin. Ayrışmış fraksiyonu toplamak için, süpernatanı çıkarın ve 100 mikronluk bir filtreden Mekanik Ayrışma etiketli yeni bir 50 mililitrelik konik tüpe süzün.

Filtreyi orijinal konik tüpün üzerine ters çevirin ve doku parçalarını geri kazanmak için kültür ortamı ile yıkayın. Daha sonra, mekanik ayrışma fraksiyonunu beş dakika boyunca santrifüjleyin. Daha sonra, süpernatanı peletlenmiş mekanik ayrışma fraksiyonundan çıkarın ve dokuyu soğuk kültür ortamında yeniden süspanse edin.

Mekanik ayrışma konik tüpünde beş mililitreden fazla doku varsa, dokuyu diğer 50 mililitrelik konik tüplere bölün, böylece hiçbir tüp beş mililitreden fazla dokuya sahip değildir. Ardından, mekanik olarak ayrışmış fraksiyonu, sakaroz gradyan santrifüjleme adımına kadar buz üzerinde saklayın. Bu prosedürde, kalan doku parçalarını içeren konik tüpü beş dakika boyunca santrifüjleyin.

Bundan sonra, süpernatanı çıkarın ve önceden ısıtılmış enzimatik sindirim solüsyonunu ekleyin, böylece her bir mililitre doku için beş mililitre sindirim solüsyonu olur. Ardından, konik tüp kapağını laboratuvar filmi ile kapatın ve reaksiyonu 37 santigrat derecede bir döndürücü üzerinde 30 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, numuneleri hafifçe ezin.

10 mililitrelik serolojik bir pipet kullanarak, numuneyi altı ila sekiz kez yukarı ve aşağı pipetleyin ve aşırı hava kabarcıkları oluşturmaktan kaçının. Ardından, pipetin ucuna 1.000 mikrolitrelik bir pipet ucu ekleyin ve numuneyi altı ila sekiz kez daha ezin. Kalan parçaların tüpün dibine çökmesine izin verin.

Daha sonra, süpernatanı, 100 mikronluk bir filtreden hala asılı olan hücrelerle, Enzimatik Ayrışma etiketli yeni bir 50 mililitrelik konik tüpe çıkarın ve süzün ve buz üzerinde saklayın. Bunu takiben, enzimatik ayrışma tüpünü beş dakika boyunca santrifüjleyin ve sükroz gradyan santrifüjlemeye devam edin. Numune hala çözelti içinde süspanse edilmişse, beş dakika santrifüjleyin.

Daha sonra, süpernatanı çıkarın ve dokuyu kalsiyum ve magnezyum içermeyen 20 mililitre soğuk HBSS'de tekrar askıya alın. Ardından, soğuk HBSS ile hacmi 25 mililitreye getirin. Yavaşça 25 mililitre 1.8 molar sükroz çözeltisi ekleyin ve karıştırmak için tüpü ters çevirin.

Bu, 0.9 molar sükroz gradyanı ile sonuçlanır. Daha sonra, numuneyi 10 dakika ara vermeden santrifüjleyin. Miyelin kalıntılarını mümkün olduğunca fazla sükroz sükroz çözeltisi içinde dikkatlice aspire edin.

Ardından, kalsiyum ve magnezyum içermeyen 30 mililitre soğuk HBSS ekleyerek ve hafifçe karıştırarak numuneyi yıkayın. Bundan sonra, beş dakika boyunca santrifüj edin. Bu prosedürde, yıkama süpernatantını çıkarın.

Beş mililitre ACK lizis tamponu ekleyin ve tüpü oda sıcaklığında bir dakika döndürerek hücre peletini nazikçe yeniden askıya alın. Daha sonra, kalsiyum ve magnezyum içermeyen 30 mililitre soğuk HBSS ekleyerek lizisi söndürün. Daha sonra, beş dakika boyunca santrifüj edin.

Son hücre peletini büyüme faktörleri ile 10 ila 15 mililitre sıcak tam TSM'de yeniden süspanse edin ve Tripan mavisi dışlamasını kullanarak bir hemositometre üzerinde canlı hücre yoğunluğunu ölçün. Daha sonra, son hücre süspansiyonunu yeni bir T75 kültür şişesine aktarın. Genel büyüme faktörü seviyelerini korumak için her gün ek büyüme faktörleri ekleyin ve tümör hücresi nörosferlerinin gelişimini izleyin.

Burada, numunelerin kültürlemenin erken aşamalarından dayanıklı bir kültüre nasıl görünebileceğine dair çeşitli örnekler verilmiştir. Başlangıçta, plakalı ve erken kültürler genellikle hayatta kalan birçok hücre içermiyor gibi görünmektedir. Ayrıca, erken hücre kümeleri genellikle tipik olarak nörosferlerle ilişkilendirilen kontrast derecesini göstermez.

Bununla birlikte, bu hücre kümelerinin ilk geçişi, hücre kümelerinin ters filtrelenmesi ile birleştiğinde, küreler oluşturabilen sağlıklı tümör hücrelerini izole edebilir. Süzüntü tipik olarak artık kalıntı içerir. Hastadan türetilen bu örnekler daha sonra birden fazla geçiş için kültürde tutulabilir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa üç ila dört saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, enzimatik ayrışma hariç her adımda numunenin soğuk sıcaklıkta tutulmasını sağlamak ve numunenin travmatik kullanımını en aza indirmek önemlidir. Bu prosedürü takiben, DIPG patobiyolojisi ile ilgili sonraki soruları yanıtlamak için in vitro ilaç taraması veya ortotopik ksenogreftleme gibi ek çalışmalar yapılabilir.

Geliştirildikten sonra, bu kültür tekniği, pediatrik nöro onkoloji alanındaki araştırmacıların DIPG'li çocuklar için yeni terapötik yollar keşfetmelerinin yolunu açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, beyin tümörü örnekleri üzerinde hızlı ölüm sonrası hücre kültürü protokollerinin nasıl uygulanacağı konusunda iyi bir fikre sahip olmalısınız. İnsan dokusu ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve kişisel koruyucu ekipman giymek ve steril teknik gibi önlemlerin her zaman kullanılması gerektiğini unutmayın.