Diffüz İçsel Pontine Glioma Hızlı post-mortem Hücre Kültürü için Protokol (DIPG)
7 Mart 2017
Bu protokol, bir hastada elde edilen hücre kültürü modelleri ya da tümör ve mikro-hücrelerinin doğrudan karakterizasyonu kurulması için ölüm sonrası yaygın iç pontin glioma örnekleri hızlı işlem için bir yöntem tarif eder.
Bu hızlı ölüm sonrası hücre kültürü protokolünün genel amacı, DIPG için etkili tedavileri anlamak ve nihayetinde geliştirmek için gerekli deneyleri kolaylaştırmak için diffüz intrinsik pontin gliomunun dayanıklı hasta kaynaklı hücre kültürlerini oluşturmaktır. Bu yöntem, bazı ilaçların hastadan türetilen farklı kültürlerde işe yarayıp yaramadığı gibi, diffüz intrinsik pontin gliomunun temel biyolojisi ve terapötik stratejileri hakkındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, hasta kaynaklı hücrelerin biyolojisinin doğrudan incelenmesine izin vermesidir.
Bu tekniğin etkileri, hastalığın farklı genetik alt tiplerinde farklı terapötik stratejilerin test edilmesine izin verdiği için DIPG tedavisine kadar uzanır. Bu yöntem DIPG hakkında bilgi sağlayabilse de, diğer pediatrik yüksek dereceli gliomlar, yetişkin glioblastomlar veya diğer merkezi sinir sistemi tümörleri gibi diğer hastalıklara da uygulanabilir. Genel olarak, bu tekniğe yeni olan kişiler mücadele edecektir, çünkü otopsi örneklerini verimli bir şekilde temin etmek ve hızlı bir şekilde işlemek zordur.
Numune hazırlamadan önce, doku kültürü başlığını, tıraş bıçakları, kavisli kanama durdurucular ve diğer steril olmayan aletlerle birlikte UV ışığı altında bir saat boyunca sterilize edin ve steril koşullar altında aşağıdaki tüm adımları gerçekleştirin. Daha sonra, dokuyu yüksek duvarlı 100 milimetreye 20 milimetre hücre kültürü kabına aktarın. Nakliyeden kalan ortamı çıkarın ve 10 ila 15 mililitre soğuk kültür ortamı ile değiştirin.
Ardından, bir tıraş bıçağını kavramak için kavisli kanama durdurucuları kullanarak, kan damarlarını veya meninksleri çıkarırken dokuyu ince bir şekilde kıyın. Son doku parçaları bir milimetreden daha küçük olmalıdır. Daha sonra, dokuyu 50 mililitrelik temiz bir konik tüpe aktarın.
Hücre kültürü kabını ilave beş mililitre soğuk kültür ortamı ile yıkayın ve numuneyi konik tüpe aktarın. Kalan dokuyu aktarmak için bu yıkama adımını gerektiği kadar tekrarlayın. 10 mililitrelik serolojik bir pipet kullanarak, numuneyi dört ila beş kez hafifçe ezin.
Daha büyük doku parçalarının tüpün dibine yerleşmesine izin verin. Gerekirse, numuneyi bir dakika boyunca kısa bir süre santrifüjleyin. Ayrışmış fraksiyonu toplamak için, süpernatanı çıkarın ve 100 mikronluk bir filtreden Mekanik Ayrışma etiketli yeni bir 50 mililitrelik konik tüpe süzün.
Filtreyi orijinal konik tüpün üzerine ters çevirin ve doku parçalarını geri kazanmak için kültür ortamı ile yıkayın. Daha sonra, mekanik ayrışma fraksiyonunu beş dakika boyunca santrifüjleyin. Daha sonra, süpernatanı peletlenmiş mekanik ayrışma fraksiyonundan çıkarın ve dokuyu soğuk kültür ortamında yeniden süspanse edin.
Mekanik ayrışma konik tüpünde beş mililitreden fazla doku varsa, dokuyu diğer 50 mililitrelik konik tüplere bölün, böylece hiçbir tüp beş mililitreden fazla dokuya sahip değildir. Ardından, mekanik olarak ayrışmış fraksiyonu, sakaroz gradyan santrifüjleme adımına kadar buz üzerinde saklayın. Bu prosedürde, kalan doku parçalarını içeren konik tüpü beş dakika boyunca santrifüjleyin.
Bundan sonra, süpernatanı çıkarın ve önceden ısıtılmış enzimatik sindirim solüsyonunu ekleyin, böylece her bir mililitre doku için beş mililitre sindirim solüsyonu olur. Ardından, konik tüp kapağını laboratuvar filmi ile kapatın ve reaksiyonu 37 santigrat derecede bir döndürücü üzerinde 30 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, numuneleri hafifçe ezin.
10 mililitrelik serolojik bir pipet kullanarak, numuneyi altı ila sekiz kez yukarı ve aşağı pipetleyin ve aşırı hava kabarcıkları oluşturmaktan kaçının. Ardından, pipetin ucuna 1.000 mikrolitrelik bir pipet ucu ekleyin ve numuneyi altı ila sekiz kez daha ezin. Kalan parçaların tüpün dibine çökmesine izin verin.
Daha sonra, süpernatanı, 100 mikronluk bir filtreden hala asılı olan hücrelerle, Enzimatik Ayrışma etiketli yeni bir 50 mililitrelik konik tüpe çıkarın ve süzün ve buz üzerinde saklayın. Bunu takiben, enzimatik ayrışma tüpünü beş dakika boyunca santrifüjleyin ve sükroz gradyan santrifüjlemeye devam edin. Numune hala çözelti içinde süspanse edilmişse, beş dakika santrifüjleyin.
Daha sonra, süpernatanı çıkarın ve dokuyu kalsiyum ve magnezyum içermeyen 20 mililitre soğuk HBSS'de tekrar askıya alın. Ardından, soğuk HBSS ile hacmi 25 mililitreye getirin. Yavaşça 25 mililitre 1.8 molar sükroz çözeltisi ekleyin ve karıştırmak için tüpü ters çevirin.
Bu, 0.9 molar sükroz gradyanı ile sonuçlanır. Daha sonra, numuneyi 10 dakika ara vermeden santrifüjleyin. Miyelin kalıntılarını mümkün olduğunca fazla sükroz sükroz çözeltisi içinde dikkatlice aspire edin.
Ardından, kalsiyum ve magnezyum içermeyen 30 mililitre soğuk HBSS ekleyerek ve hafifçe karıştırarak numuneyi yıkayın. Bundan sonra, beş dakika boyunca santrifüj edin. Bu prosedürde, yıkama süpernatantını çıkarın.
Beş mililitre ACK lizis tamponu ekleyin ve tüpü oda sıcaklığında bir dakika döndürerek hücre peletini nazikçe yeniden askıya alın. Daha sonra, kalsiyum ve magnezyum içermeyen 30 mililitre soğuk HBSS ekleyerek lizisi söndürün. Daha sonra, beş dakika boyunca santrifüj edin.
Son hücre peletini büyüme faktörleri ile 10 ila 15 mililitre sıcak tam TSM'de yeniden süspanse edin ve Tripan mavisi dışlamasını kullanarak bir hemositometre üzerinde canlı hücre yoğunluğunu ölçün. Daha sonra, son hücre süspansiyonunu yeni bir T75 kültür şişesine aktarın. Genel büyüme faktörü seviyelerini korumak için her gün ek büyüme faktörleri ekleyin ve tümör hücresi nörosferlerinin gelişimini izleyin.
Burada, numunelerin kültürlemenin erken aşamalarından dayanıklı bir kültüre nasıl görünebileceğine dair çeşitli örnekler verilmiştir. Başlangıçta, plakalı ve erken kültürler genellikle hayatta kalan birçok hücre içermiyor gibi görünmektedir. Ayrıca, erken hücre kümeleri genellikle tipik olarak nörosferlerle ilişkilendirilen kontrast derecesini göstermez.
Bununla birlikte, bu hücre kümelerinin ilk geçişi, hücre kümelerinin ters filtrelenmesi ile birleştiğinde, küreler oluşturabilen sağlıklı tümör hücrelerini izole edebilir. Süzüntü tipik olarak artık kalıntı içerir. Hastadan türetilen bu örnekler daha sonra birden fazla geçiş için kültürde tutulabilir.
Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa üç ila dört saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, enzimatik ayrışma hariç her adımda numunenin soğuk sıcaklıkta tutulmasını sağlamak ve numunenin travmatik kullanımını en aza indirmek önemlidir. Bu prosedürü takiben, DIPG patobiyolojisi ile ilgili sonraki soruları yanıtlamak için in vitro ilaç taraması veya ortotopik ksenogreftleme gibi ek çalışmalar yapılabilir.
Geliştirildikten sonra, bu kültür tekniği, pediatrik nöro onkoloji alanındaki araştırmacıların DIPG'li çocuklar için yeni terapötik yollar keşfetmelerinin yolunu açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, beyin tümörü örnekleri üzerinde hızlı ölüm sonrası hücre kültürü protokollerinin nasıl uygulanacağı konusunda iyi bir fikre sahip olmalısınız. İnsan dokusu ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve kişisel koruyucu ekipman giymek ve steril teknik gibi önlemlerin her zaman kullanılması gerektiğini unutmayın.
Genel Bakış
Bu protokol, hasta kaynaklı hücre kültürü modelleri oluşturmak için ölüm sonrası diffüz intrinzik pontin glioma örneklerinin hızlı işleme yöntemini açıklar. Bu teknik, tümör biyolojisi ve terapötik stratejileri çalışmayı kolaylaştırır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Onkoloji
- Hücre Biyolojisi
Arka Plan
- Diffüz intrinzik pontin glioma (DIPG) zorlu bir pediatrik beyin tümörüdür.
- DIPG biyolojisini anlamak, etkili tedaviler geliştirmek için kritik öneme sahiptir.
- Hasta kaynaklı hücre kültürleri, tümör davranışı hakkında içgörüler sağlayabilir.
- Bu yöntem diğer yüksek dereceli gliomalar ve CNS tümörlerine de uygulanabilir.
Çalışmanın Amacı
- DIPG'den sürekli hasta kaynaklı hücre kültürleri oluşturmak.
- DIPG biyolojisini anlamayı amaçlayan deneyleri kolaylaştırmak.
- Farklı genetik alt tiplerde terapötik stratejileri test etmek.
Kullanılan Yöntemler
- Steril koşullar altında ölüm sonrası örnek işleme.
- Dokular örneklerinin mekanik ve enzimatik olarak ayrıştırılması.
- Hücre ayıklama için sükroz gradyan santrifüjasyonu.
- Hücre kültürü bakımı büyüme faktörleri ile.
Ana Sonuçlar
- Hasta kaynaklı hücre kültürlerinin başarılı bir şekilde oluşturulması.
- DIPG biyolojisi ve potansiyel terapötik tepkiler hakkında içgörüler.
- Diğer CNS tümörlerine uygulanabilirliğin gösterilmesi.
Sonuçlar
- Bu protokol, hasta kaynaklı DIPG hücrelerinin doğrudan çalışılmasına olanak tanır.
- Çeşitli terapötik stratejileri test etmek için bir platform sağlar.
- Gelecekteki uygulamalar diğer pediatrik ve yetişkin beyin tümörlerine genişletilebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This protocol addresses the critical need for physiologically relevant models in pediatric oncology by enabling rapid generation of patient-derived DIPG cultures from post-mortem tissue. It supports target validation and preclinical de-risking by providing a scalable system to evaluate therapeutic response across genetic subtypes. The method enhances translational continuity from discovery to lead identification by supplying durable cultures for mechanistic and phenotypic screening.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses using patient-derived cells that retain tumor-specific biology.
- Operational Value: Provides a renewable source of DIPG cells for functional target validation and pathway analysis.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by allowing drug response comparison across genetically distinct cultures.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates dissociated cell suspensions suitable for FACS isolation and downstream molecular profiling.
- Operational Value: Standardizes sample preparation to produce consistent inputs for high-throughput screening platforms.
- Scalability: Enables production of sufficient cell numbers for multi-well assay formats and dose-response testing.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains tumor-derived neurosphere-forming capacity, preserving key pathobiological features for preclinical modeling.
- Operational Value: Facilitates orthotopic xenograft establishment for in vivo efficacy and pharmacokinetic studies.
- Translational Alignment: Bridges discovery findings to preclinical validation through continuous culture passaging.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supplying validated biological systems for lead identification and preclinical evaluation. It enables hypothesis-driven screening and supports go/no-go decisions through quantitative, reproducible outputs.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by allowing direct testing of drug effects on patient-derived DIPG cells.
- Screening: Delivers standardized, viable cell suspensions ready for compound library screening and target engagement assays.
- Analytics: Enables quantification of viable cell density and neurosphere formation as phenotypic readouts for compound screening.
- Translational Research: Provides a continuous culture system that maintains tumor properties for longitudinal preclinical studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for generating CNS tumor models applicable to multiple therapeutic programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing reliance on non-predictive cell lines and enhancing biological relevance.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized dissociation, filtration, and centrifugation steps under sterile conditions.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early elimination of ineffective compounds using patient-relevant models.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by generating efficacy data across multiple DIPG genetic subtypes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in sterile tissue handling and enzymatic dissociation techniques.
- Depends on access to post-mortem tissue and rapid processing infrastructure to maintain sample viability.
- Necessitates standardized protocols across teams to ensure culture consistency and comparability of results.
- Involves adaptation considerations when applying the protocol to other CNS tumor types with differing tissue characteristics.
- Limited by the difficulty in procuring and rapidly processing autopsy samples, which affects throughput and accessibility.
