Name: Hücre farklılaşması ve Çekiş Kuvvetleri Korelatif Analizi için Yüksek verim Hücre Mikroarray Platformu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-01T11:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 4 s
Description: Öğrenin hücre farklılaşması ve çekiş kuvvetleri korelasyon analizi için yüksek verimli hücre mikroarray platformunu. Bu yöntem kök hücre biyolojisi ve doku mühendisliği çalışmalarında kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Biz kabul Austin Cyphersmith ve Mayandi Sivaguru (Genomik Biyoloji Carl R. Woese Enstitüsü, University of Illinois at Urbana Champaign) mikroskobu ile yardım için ve cömertçe mikroskopi özünde ekran ve video çekimi barındırmak için.

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.

Deneylerde, biz en yaygın hataları uydurma dizilerin kalitesi ile ilgili ve kötü ilgi biyolojik sistem yanıtı karakterize bulduk. Biz cep mikroarray deneylerde yaygın arıza modları ve ilişkili sorun giderme adımları için Tablo 1&#39;de okuyucu bakın. Özellikle dizilerin kalitesiyle ilgili, biz aşağıdaki öneriyoruz. Böyle rodamin-konjuge dekstran gibi floresan etiketli molekülleri kullanarak programları parametreler ve tamponlar arraying teknik kalite ve sağlamlığı onaylayın. önce ya da daha fazla görsel üreticinin talimatlarına göre arraying ve sonra ya tamamen temiz pimleri pim kanalları ışık mikroskobu kullanılarak enkaz açık olup olmadığını kontrol edin. genel protein lekeleri veya immün kullanarak dizilmiş biyomolekül tutma onaylayın. 70 kDa altında bir moleküler ağırlığa sahip biyomoleküller sık hidrojel 23 korunmaz unutmayın </<html> sup&gt; 31. Birden fazla hücre tiplerini kullanarak dizilmiş biyomolekül hücre işlevselliğini doğrulamak. Sadece yapışık hücreler diziler ile uyumlu olduğunu unutmayın; Buna ek olarak, diziler kaynaşmasının hücreye özel özellikleri (örneğin, integrin ifade profili) ve seçilen ECM proteinleri bağlıdır. Sınırlı yer nedeniyle, burada dizi tasarım, düzen ve imalat geniş bir tedavi verilmez ve daha önceki 23 çalışır için, 25 okuyucu bakın. Biz genel olarak 10-20 benzersiz biyomolekül koşulları (yani, 5-10 noktalar / durumu) oluşan 100 nokta Altdizilim (150 mikron nokta çapı 450 mikron merkez-merkez mesafesi) kullanın. bir dizide altdizilimlerden sayısı rahatça biri 25 × 75 mm mikroskop lamı üzerine 1,280 kadar ölçeklendirilebilir ilgi biyomolekül koşulları sayısına bağlı olarak değişir (~ 64 altdizilimlerden içinde 6.400 noktalar)xref &quot;&gt; 25, 31 parametre üzerinde daha fazla ilgi desen boyutuna bağlı olarak değişir;. 75 desen üretme kapasitesine sahip pimleri - 450 mikron kolayca kullanılabilir. Dizi deneyler en iyi diğer kültür biçimlerini kullanarak yüksek faiz-puanlama dizilmiş koşulları, tahlil okumalara ve biyolojik model sistemleri doğrulama ile tamamlanmaktadır. Spesifik olarak, daha ayrıntılı bir şekilde, standart moleküler biyoloji teknikleri (örneğin, QRT-PCR, immün) veya standart TFM ile bağlantılı dökme kültürleri kullanılarak seçme dizilmiş koşullarının kanıtlayan önerilir. Genetik manipülasyon Ayrıca diziler gözlenen etkileri onaylamak için hizmet, uygun bir biyolojik model sisteminde ilgi faktörünün (örneğin, demonte veya aşırı ifadesi). In vivo hayvan modelleri doğrulama başka bir yöntem temsil en son galektin-3 ve galektin-8 merkezi rolü teyit etmek için, örneğin, kullanılanAkciğer kanseri metastatik niş, başlangıçta hücre mikroarray 31 49 aracılığıyla belirledi. Diğer bir dizi yöntem, iki boyutlu bir mikrofabrike sistemleri 18, 50, 51, 52, 53, 54, 55 ve üç boyutlu tasarlanmış biyomalzeme sistemleri 56, çeşitli 57, 58 dahil olmak üzere, hücresel fonksiyonları microenvironmental düzenleme, problamak için kullanılmıştır , 59, 60, 61. diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, burada tarif edilen hücre mikrodizi platformun özel avantajlar oluşur: (1) ila yukarı çıktıyüzlerce veya etkileşim etkilerinin analizi sağlayan faktörlerin farklı kombinasyonları, binlerce; (2) erişilebilir, otomatik görüntüleme ve analizi; (3) dizilmiş faktörlerin kontrollü sunumu ile hem biyokimyasal ve biyofiziksel okumalarla entegrasyonu; (4) alt-tabaka malzemesi özellikleri değiştirme yeteneğini de; hücre kaderinin ve fonksiyonu ve (5) yüksek içeriği tek hücre analizi. Özetle, ayarlanabilir alt tabaka sertliği yüzeylerde TFM hücre microarrays kombinasyonu hem biyokimyasal ve biyofiziksel ipuçlarının kapsamlı karakterizasyonu sağlar. Burada görüldüğü gibi, bu platform genellenebilir ve hali hazırda hücre farklılaşması ve mechanotransduction kombinatoryal mikro-çevresel bir düzenleme daha iyi anlaşılması doğru yapışık hücre tipleri ve doku çeşitli bağlamlarda da uygulanabilir.

Hücre ve çevresindeki mikro-çevresel faktörler arasındaki etkileşimler geliştirme, homeostaz ve hastalığın patojenezi, 1, 2, 3, 4 boyunca biyolojik süreçlerin büyük bir çeşitlilik aracılık eder. Bu mikro-çevresel etkileşimler ligand-reseptörü aracılığıyla hücrelere çözünür faktörlerin teslim bağlayıcı hücre-matris ve hücre-hücre etkileşimleri bulunmaktadır. Yukarıda biyokimyasal açıdan ek olarak, bu tür alt-tabaka mekanik özellikleri biofiziksel parametreleri (örneğin, Young modülü, gözeneklilik) ve hücre şekli ve ilişkili alt mechanotransduction artan hücre farklılaşması 5, 6, 7, 8, anahtar aracılar olarak tanındı adres 9 <sup&gt; 10. Bu microenvironmental etkileşimler kaynaklanan sinyaller gen ağları ve sinyal yolları girdi olarak hizmet vermektedir. Ayrıca, bu hücre iç bileşenler aynı zamanda hücre hakiki genetik programlar ve hücre dış mikro-çevresel faktörlerin 5, 11, 12 arasındaki karmaşık eş düzenleyici döngü tamamlayan salgılanan faktörler ve matris-parçalayıcı enzimler yoluyla mikro geri bildirimde bulunur. Mikro-çevresel faktörler tarafından kontrol edilen sunum için tasarlanmış sistemlerinin kullanımı farklı bağlamlarda 13, 14, 15, bir dizi yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Özellikle mikrofabrike sistemleri, minyatürleştirme 13 ile protein ve hücreleri hem de yüksek paralelleştirilmiş analiz hassas mekansal model oluşturmanın kolaylaştırmıştır <supSınıf = &quot;xref&quot;&gt; 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22. Hücre mikrodizileri biyomoleküllerin kombinasyonları iletişim baskılı bir esnek poliakrilamid hidrojel alt-tabaka 23, 24, 25 üzerine olan bu tür bir mikrofabrike sistemi temsil eder. Hücre-yapışkan bileşenlerin (yani matriks proteinleri) dahil sık sık immünsitokimya ve floresan gazetecilere yoluyla aşağı analizi ile takip edilmektedir mikrodizinlerinde sürekli hücre yapışması ve kültürünü mümkün kılar. Hücre mikroarray&#39;ler verimli karaciğer hücre fenotip 23, 26, nöral prekürsör farklılaşma 27 mammar geliştirilmiş bir anlayış elde yönelik edilmiştiry progenitör kader kararları 28, embriyonik kök hücre bakım / farklılaşma 23, 29, 30, akciğer kanseri metastazı 31 ve melanom 32 tedavi yanıtı. Son zamanlarda endoderm tarifnamede 33, karaciğer progenitör farklılaşma 34, 35, ve akciğer tümör hücre tedaviye yanıt 36 hücre dışı matris (ECM) protein bileşiminin rolünü tanımlamak için hücre mikrodizileri kullanımını göstermiştir. Bu çalışmalarda, biz dizi platformunun kombinasyon yeteneklerinin artırılması ve hücre dışı matriks kompozisyonu ve biyomekanik ile hücre içsel sinyalizasyon kavşakları keşfetmeye odaklanmıştır. Ayrıca, yetenek kantitatif şekilde karakterize sağlamak için bu dizi platformda biyofizik readouts hayata geçirdikfarklılaşma hücre kontraktilite terize rolü 35 işler. Bunu yapmak için, biz hücre tarafından üretilen çekiş yüksek verimlilik değerlendirilmesini sağlamak için hücre mikroarray&#39;ler ile çekme kuvvet mikroskobu (TFM) entegre edilmiştir. TFM hücresi tarafından oluşturulan çekme kuvvetlerinin ölçülmesi için yaygın olarak kullanılan bir yöntem olup, bileşim ve yerel mikro-37, 38, 39, 40 biyomekanik tek-hücre ve doku düzeyinde işlev koordinasyonu ile ilgili önemli bilgiler sağlamıştır. Bu nedenle, hücre mikrodizileri ile TFM birleştiren temel fizyolojik olarak uygun biofiziksel parametreleri ölçmek için yüksek verimli bir sistem sağlar. Burada anlatılan hücre mikroarray platformu dört bölümden oluşmaktadır: poliakrilamid yüzeylerde, diziler, hücre kültürü ve tahlil okuma üretiminde ve verilerin analizi imalatı. Görmekİlk üç deney bölümleri şematik özeti Şekil 1 &#39;dir; immünofloresan verilerin analizi odaklanarak son bölümde bir şematik özeti için bakınız Şekil 2. Biyomekanik hücre alt-tabaka etkileşim çalışmalar hücre mikrodizi platformu adapte amacıyla, Wen et al başına ayarlanabilir Young modülü ama benzer gözenekli poliakrilamid substratlar kullanılır. 41. onların alt tabaka üzerinde hücreler tarafından uygulanan kuvvetlerin TFM ölçümleri etkinleştirmek için, biz sık sık diğer gruplar tarafından kullanılan slaytlar kalın cam mikroskop ek olarak cam alt Petri kabı biçimi uyguladı. Bu nedenle, bu hücre mikrodizi platformu ayrı cam alt yemekler TFM ile mikroskop lamı ve hücre tarafından üretilen kuvvetlerin immünofloresan ile hücre farklılaşmasının paralel ölçümler yeteneğine sahiptir. Biz de yaygın hücre mikroarray&#39;ler ile kullanılan analitik yaklaşıma çeşitli iyileştirmeler uyguladık. Özelly, yerine genel ada yoğunluğu parametrik Z-puanlama, biz tek hücreli yoğunluğunu ölçmek ve normal olmayan dağılımlar için hesap ve daha doğru hücresel davranışını tanımlamak için kantil normalleşme uygulayın. Biz bu gelişmeler biyokimyasal ve biyofiziksel hem ipuçları önemli, kesişen rol oynadığı biyolojik süreçlerin araştırılması yönünde özellikle yarar sağladığına inanıyoruz. Ayrıca, bizim analitik gelişmeler tek hücreli ve nüfus seviyesi davranışı sapmak hangi hücresel fonksiyonları bir dizi çalışmalara hücre mikroarray&#39;ler uygulanmasını sağlar.

<table><tbody><tr><td>0.2 ve mikro; m şırınga filtresi</td><td>Pall Corporation</td><td>4433</td><td>Uygun boyutta Luer kilitli plastik şırıngalarla eşleştirin.</td></tr><tr><td>100 & kez; penisilin & ndash; streptomisin çözeltisi</td><td>Fisher Scientific</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>22 & kez 60 mm kapak camları</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>63765</td><td></td></tr><tr><td>3- (trimetoksisilil) propil metakrilat (3-TPM)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>440159</td><td>Üreticinin talimatlarına göre inert gaz altında saklayın. 3-TPM'nin havaya maruz kalması, cam alt tabakaların silanizasyonunu tehlikeye atabilir. DİKKAT: 3-TPM yanıcı bir sıvıdır. Isıdan, kıvılcımlardan, açık alevlerden ve sıcak yüzeylerden uzak tutun ve yalnızca kimyasal çeker ocakta kullanın.</td></tr><tr><td>3-[(3-Kolamidopropil)dimetilamonyo]-1-propansülfonat hidrat (CHAPS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3023</td><td></td></tr><tr><td>35 mm cam tabanlı Petri kapları</td><td>Hücre E & G</td><td>GBD00002-200</td><td>13 mm kuyu #1.5 kapak camından oluşur. TFM ve canlı hücre görüntülemeyi mümkün kılar.</td></tr><tr><td>384 oyuklu polipropilen V-tabanlı mikroplaka, steril olmayan</td><td>USA Scientific</td><td>1823-8400</td><td></td></tr><tr><td>6 oyuklu polistiren mikroplakalar</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1B</td><td>35 mm cam tabanlı Petri kapları, mikroplaka kuyularına sığar ve dizi imalatını kolaylaştırır.</td></tr><tr><td>Aseton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179973</td><td></td></tr><tr><td>Akrilamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3553</td><td>DİKKAT: Akrilamid'e maruz kalmak akut toksisite ve tahrişe neden olabilir. Koruyucu eldiven, giysi ve göz koruması kullanın.</td></tr><tr><td>Kollajen I, sıçan kuyruğu</td><td>EMD Millipore</td><td>08-115MI</td><td></td></tr><tr><td>Kollajen III, insan</td><td>EMD Millipore</td><td>CC054</td><td></td></tr><tr><td>Kollajen IV, insan</td><td>EMD Millipore</td><td>CC076</td><td></td></tr><tr><td>Çapraz bağlayıcı, 365 nm</td><td>UVP</td><td>CL-1000</td><td></td></tr><tr><td>Dekstran, rodamin B-konjuge, 70 kDa</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D1841</td><td>Dizi konumu için bir işaretleyici olarak kullanılır.</td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP231</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun fosfat tamponlu tuzlu su (PBS)Fisher</td> <td>Scientific (HyClone)</td><td>SH3001302</td><td></td></tr><tr><td>Etil alkol</td><td>Decon Labs</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>Etilendiamintetraasetik asit (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ED</td><td></td></tr><tr><td>Fc-rekombinant DLL1, fare</td><td>R& D Systems</td><td>5026-DL-050</td><td></td></tr><tr><td>Fc-rekombinant DLL4, fare</td><td>AdipoGen</td><td>AG-40A-0145-C050</td><td></td></tr><tr><td>Fc-rekombinant JAG1, sıçan</td><td>R& D Systems</td><td>599-JG-100</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektin, insan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2006</td><td></td></tr><tr><td>Floresan mikroskobu, ters</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 200M</td><td>Mikroskobun hem otomatik floresan görüntüleme hem de TFM için robotik bir aşama ile donatıldığından emin olun. Çevresel kontrol (yani ., 37 &derece; C ve %5 CO2) TFM için şiddetle tavsiye edilir.</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-20</td><td></td></tr><tr><td>Buzlu asetik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>695092</td> ile Fluoromount G <td>DİKKAT: Asetik asit yanıcı ve aşındırıcıdır. Koruyucu eldiven, giysi ve göz koruması kullanın.</td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6145</td><td></td></tr><tr><td>Irgacure 2959</td><td>BASF Corporation</td><td>55047962</td><td></td></tr><tr><td>Laminin, fare</td><td>EMD Millipore</td><td>CC095</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179957</td><td></td></tr><tr><td>Mikrodizi tarayıcı</td><td>GenePix</td><td>4000B</td><td>Floroforlar Cy3 veya Cy5 uyumlu olmalıdır.</td></tr><tr><td>Mikro Dizileyici</td><td>Digilab</td><td>OmniGrid Mikro</td><td>Benzer veya daha büyük kapasiteye sahip diğer mikrodiziler kolayca ikame edilebilir.</td></tr><tr><td>Mikroskop slaytları, 25 > 75 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS294775X25</td><td>~0,9 &ndash; 1,1 mm kalınlık.</td></tr><tr><td>N, N & asal; -Metilenbisakrilamid (bisakrilamid)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7279</td><td>DİKKAT: Akrilamid'e maruz kalmak akut toksisite ve tahrişe neden olabilir. Koruyucu eldiven, giysi ve göz koruması kullanın.</td></tr><tr><td>Paraformaldehit (PFA), %16 v/v</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>RT15710</td><td>Optimum fiksasyon için PFA'yı taze hazırlayın (saklamayın). DİKKAT: PFA'ya maruz kalmak akut toksisiteye neden olabilir ve ayrıca temas halinde cildi tahriş edebilir veya aşındırabilir. Koruyucu eldiven, giysi ve göz koruması giyin ve yalnızca kimyasal çeker ocakta kullanın.</td></tr><tr><td>Protein A/G, rekombinant</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21186</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex kurutma tepsisi, 2.000&nbsp; mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-242B</td><td></td></tr><tr><td>Dikdörtgen 4 odacıklı kültür kabı</td><td>Fisher Scientific (Nunc)</td><td>12-565-495</td><td>Dizili mikroskop slaytlarında hücre kültürü için.</td></tr><tr><td>Sodyum asetat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum hidroksit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>415413</td><td>DİKKAT: NaOH oldukça yakıcıdır ve ciddi cilt yanıklarına ve göz hasarına neden olabilir. Koruyucu eldiven, giysi ve göz koruması kullanın.</td></tr><tr><td>ArrayIt</td><td>SMP3'ü</td> <td>dizmek için gizli pin</td><td>Her dizi çalıştırıldıktan sonra üreticinin talimatlarını kullanarak pinleri temizleyin. 150 mikronluk alanlar üretir; Diğer pin boyutlarını satın alın (75&ndash; 450 mikron) özel uygulamanıza uygun olarak.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr></tbody></table>

hücre farklılaşması ve Çekiş kuvvetleri korelatif analizi için yüksek verim hücre mikroarray platformu

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

elastik hidrojel yüzeyinde biyomoleküllerin temas baskılı kombinasyonları oluşur microfabricated hücresel mikroarray&#39;ler, hücre farklılaşması üzerine dizilmiş biyokimyasal sinyallerin etkisini ölçmek için bir sıkı kontrol, yüksek verimli mühendislik sistem sağlamak. Hücre mikrodiziler kullanarak Son çalışmalar, birçok microenvironmental faktör paralel olarak sunulduğu kombinasyon çalışmaları için kendi programını ortaya koymuştur. Ancak bu çabalar hücre yanıtları biyokimyasal ipuçlarının etkilerini araştıran öncelikle odaklanmıştır. Burada, çekiş kuvveti mikroskobu ile immünofloresan ve biyomekanik hücre-substrat etkileşimleri hem hücre farklılaşması değerlendirmek için ayarlanabilir malzeme özelliklerine sahip bir cep mikroarray platformu sunuyoruz. Bunu yapmak için, biz ya mikroskop lamı veya cam alt Petri kapları üzerinde fabrikasyon Young modülü değişen poliakrilamid hidrojeller kullanan iki farklı biçimleri geliştirmişlerdir. Biz bes sağlamakBu hidrojel yüzeylerde microarrays imalat, mikrodizinlerinde sonraki hücre kültürü ve veri edinimi için t uygulamaları ve sorun giderme. Bu platform da biyokimyasal (örneğin, hücre dışı matris bileşimi) hem ve biyofiziksel (örneğin, alt-tabaka sertliği) işaretler rolleri kesişen önemli oynayabilir biyolojik proseslerin incelenmesi kullanılmak için çok uygundur.

Bu platformu kullanarak, karaciğer atalarıdır 34, 35 kaderi şartnamede hem biyokimyasal ve biyofiziksel ipuçlarının rolünü araştırdık. Protein A / G-konjuge Çentik ligandlan poliakrilamid hidrojel (Şekil 3A), geliştirilmiş saklama ve kümelenme gösterdi ve safra kanalı, hücre kaderine (Şekil 3B) doğru karaciğer progenitörlerin farklılaşmasını sürüş Ayrıca sahip idi. Tek hücreli bir analiz kullanarak, liganda karaciğer progenitörlerinin tepkisi de bağlıdır bulgu, ECM proteinleri kolajen I, kolajen III, kolajen IV, fibronektin ve laminin (Şekil 3C) çentik ligandlarına yanıt sayısal ECM bağlam. Son olarak, ligandlar DLL1 ve Jag1 olmadan karaciğer atalarıdır oluşturmak için ShRNA demonte kullanılmaktadır. dizilmiş Notch bağına yanıt pr bağlı olarak değişiklikHer iki ligandın özünü, hücre dışsal liganda yanıt hücre iç ligand ifade (Şekil 3D) bir fonksiyonu da doğrular. Dahası, çift pozitif bir tat alt popülasyonunu gözlenmiştir (ALB + / OPN +) DLL1 demonte (Şekil 3D) hücreler. Birlikte, bu temsili sonuçlar göstermektedir: (1) tek tek ligandların devirme ile birden dizilmiş ECM proteinleri ve Çentik ligand eşleştirme ile gösterildiği üzere bir dizi formatı kombinasyon yetenekleri; (2) sadece bir işlevi ECM proteinlerini dizilmiş değil, aynı zamanda protein A / G-aracılı birleştirme aracılığı ile hücre-hücre ligand dizilmiş; ve (3) bizim tek hücreli analizi ve benzersiz alt popülasyonlar ayırt etme yeteneği uygulanması. Ayrıca karaciğer progenitörlerinin farklılaşma alt-tabaka sertliği ve ECM bileşimi (Şekil 4a, her iki bağımlı olduğu görülmektedir </str<html> fibronektin sadece sert yüzeylerde (Şekil 4B) üzerinde farklılaşma desteklerken ong&gt;), özellikle kolajen IV bulma hem yumuşak ve sert yüzeylerde farklılaşma destekleyicidir. TFM ölçümlerinin Temsilcisi ısı haritaları kollajen IV düşük substrat sertliği de sürekli çekiş stres safra yolu hücreleri (Şekil 4C), ortalama kök ortalama kare değerleri (Şekil 4D) tarafından teyit bir bulgu haline farklılaşmayı teşvik önerdi. Birlikte, bu temsili sonuçlar göstermektedir: (1) bir ayarlanabilir sertlik yüzeylerde hücre mikroarreyleri ile TFM başarılı entegrasyon hücre fenotipi ve çekiş stres hem değerlendirmek için; (2) matris bileşimi ve alt tabaka sertlik hem karaciğer progenitör hücre kaderinin koordinasyonu; ve (3) hücre mikrodizilerinde bizim TFM analizi ve tipik bir gerilim profillerini uygulanması. e 1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 55362 / 55362fig1.jpg &quot;/&gt; Şekil 1: İlk Üç Deneysel Bölümler gösteriliyor Özet şematik. Bölüm 1, cam yüzeylerde temizlenmeli ve poliakrilamid hidrojeller fabrikasyon kolaylaştırmak için Silanlanmış edilir. Bölüm 2&#39;de, ilgi konusu biyomolekülün kombinasyonları 384 kaynağı mikro-hazırlanır. Bir robot arrayer sonra hidrojeller üzerinde diziler imalatı, temiz pimleri, kaynak mikroplaka ve poliakrilamid hidrojeller ile yüklenir ve başlatılır. Bölüm 3, hücreler dizilmiş alan üzerine ekilip ilgi kültür protokolü uygulandı, bundan sonra, uygun izin verilir. uç noktada, hücreler ya TFM kullanarak immünsitokimya / Immünofloresan için sabit veya analiz edilir. Ölçek çubukları 75 mikron. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55362/55362fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> = &quot;1&quot;&gt; sayfa içinde <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/55362/55362fig2.jpg" /> Şekil 2: İşleme ve Diziler gelen İmmünofloresan Verilerin Analizi. (A) Karo, kompozit 32 bit RGB görüntüleri ilk binned ve daha sonra tek tek 8-bitlik kanallara ayrılır. dizilmiş floresan belirteçler ve hücre adaların bir arada kullanarak, dizinin üç köşesi otomatik yönlendirme ve dizilerin gridding sağlamak için belirlenmiştir. (B) tek-hücreli veri giriş dizilerinin her kanal için oluşturulur. Deneysel sürüklenme hesaba amacıyla, kantil normalleştirme tüm çoğaltır genelinde tek bir paylaşılan dağıtım üreten, biyolojik tekrarında uygulanır. Quantile normalize veri sonradan ya da tek hücreli dağılımlarının doğrudan analizi (bir etiket için pozitif yüzde hücre yoğunluğu ortalama örneğin, hücre / ada) çizilen ve topluluk ölçümlerinin hesaplanması yoluyla yorumlanır.m / files / ftp_upload / 55362 / 55362fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/55362/55362fig3.jpg" /> Şekil 3: Notch Ligand Sunum Aracılık Karaciğer Progenitör Farklılaşma. (A) Fc-rekombinant Çentik ligandları Jagged-1 (JAG1) ve Delta gibi 1 (DLL1) Protein A / G ile dizilmiş gelişmiş tutma ve kümelenme sergiledi. Ölçek çubuğu 50 mm. (B) Karaciğer ataları Notch ligand ile ibrazı üzerine safra yolu hücrelerine diferansiye. 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), nükleer bir etiket, albümin (ALB) bir karaciğer hücre belirteci olduğu ve osteopontin (APN) olan bir safra kanalı, hücre belirtecidir. Ölçek çubuğu 150 mm. (C) ECM proteinleri üzerinde çentik ligandlar JAG1, DLL1 ve Delta gibi 4 (DLL4) için APN için pozitif hücrelerin yüzdesi miktarının belirlenmesi I kollajenin, collagen III, kolajen IV, fibronektin ve laminin. Student t-test P &lt;0.05 (*) için belirtilen P-değerleri, her ECM proteininde içinde her dizilmiş Çentik ligand için kontrol IgG karşı yapıldı. Notch ligandları JAG1, DLL1 ve DLL4 mevcuttur kollajen III hücreler için ALB ve APN (D) Görüntüleme sitometri. Çentiksiz karaciğer progenitörler DLL1 ve Jag1 (yani, shDll1 ve shJag1) shRNA demonte kullanılarak elde edilmiştir ligandları. Ortalama ± sem Bu rakam Kaylan&#39;ın ark tadil edilmiş olduğu (C) &#39;de veriler sunmuşlardır. 34. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55362/55362fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/55362/55362fig4.jpg" /> Şekil 4: The Matrix Kompozisyon ve Yüzey Sertlik CooKaraciğer Progenitör Farklılaşma rdinate. Kanal hücreleri safra (A) Karaciğer progenitör farklılaşma ECM kompozisyon ve alt tabaka sertlik hem bağlıdır. DAPI ALB bir karaciğer hücre işaretleyici ve APN bir safra kanalı, hücre işaretleyici, nükleer bir etikettir. (B) Young modülü alt tabakalar 30 kPa, 13 kPa, kollajen 4 kPa I (C1), kolajen IV (C4), fibronektin (FN), ve iki yönlü kombinasyonları ile ilgili APN için pozitif hücrelerin yüzdesi kantifikasyonu bu ECM proteinleri. (C) Celi bir gerilim alt-tabaka sertliği ve ECM bileşimin hem bağlıdır. (D) Young modülü alt tabakalar 30 kPa ve kollajen 4 kPa I (C1), kolajen IV (C4), fibronektin (FN), ve bu her iki yollu kombinasyonları, çekiş stres kök-ortalama-kare değerlerinin miktarının belirlenmesi ECM proteinleri. (B) ve (D) &#39;de, veriler SEM ve Student t-test, ortalama ± olarak sunulduP &lt;0.05 (*) p &lt;0.01 (**) için belirtilen P-değerleri, her ECM kombinasyonu için 30 kPa karşı gerçekleştirilen edildi ve p &lt;0.001 (***). Ölçek çubukları 50 mikron. Bu rakam Kourouklis ark modifiye edilmiştir. 35. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55362/55362fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td fo:width="1.2in"> Bölüm </td><td fo:width="1.5in"> Sorun </td><td fo:width="1.5in"> potansiyel Nedenler </td><td> Çözüm </td></tr><tr><td rowspan="3"> Poliakrilamid Yüzey 1. Fabrikasyon. </td><td> Coverglass hidrojelden kaldırılamaz. </td><td> Overpolymerization. </td><td> &lt;10 dakika (4 W / m 2) polimerizasyon süresini azaltın. UV crossli kontrolnker çıkış beklenen aralığı içindedir. </td></tr><tr><td> Kötü poliakrilamid hidrojel polimerizasyon. </td><td> Underpolymerization. </td><td> Polimerizasyon süresi&gt; 10 dakika (4 W / m 2) artırmak. UV çapraz bağlayıcı çıkışı beklenen aralıkta olup olmadığını kontrol edin. </td></tr><tr><td> Poliakrilamid hidrojellerin coverglass çıkarıldıktan sonra zarar görmektedir. </td><td> Yumuşak poliakrilamid hidrojeller zarar kolaydır. </td><td> Biz özellikle (yani, 4 kPa) hidrojeller yumuşak hidrojel üretim verimi (~% 50) azalan gözlemlemek. nazikçe hidrojeller Kulp ve istenilen verimi elde etmek için başlangıç ​​sayısını artırmak. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Diziler 2. Fabrikasyon. </td><td rowspan="2"> Kötü veya tutarsız nokta morfolojisi. </td><td> Tutarsız nemlendirici fonksiyonu. </td><td> Bu nemlendirici kontrol edin ve her yazdırma çalışması boyunca işlevsel reometre ve% 65 RH korumak. </td></tr><tr><td> baskı kafası veya takunya sıkışmış pimleriged. </td><td> ücretsiz pim hareketine izin vermek için yazıcı kafasını temizleyin. iyice önce veya her baskı çalışmasından sonra temiz iğneler pim kanallarından agrega kaldırmak için. </td></tr><tr><td rowspan="8"> 3. Hücre Kültürü ve Tahlili Yürütme. </td><td rowspan="2"> İlk eki sonra diziler Hücre dekolmanı ya da ölüm. </td><td> Overseeding ve aşırı çoğalması. </td><td> İlk tohumlama yoğunluğu ve süresini azaltın. hücre çoğalmasını azaltmak için dizi kültürü sırasında &quot;bakım&quot; veya &quot;farklılaşma&quot; ortamını kullanın. </td></tr><tr><td> hidrojel toksik akrilamid Yayın. </td><td> Akrilamid difüzyon / tahliyesine imkan vermek ve hücre toksisitesini azaltmak için en az 3 gün boyunca dH 2 O hidrojeller bekletin. </td></tr><tr><td rowspan="4"> Hücreler diziler eklemek gerekmez. </td><td> Underseeding. </td><td> İlk tohumlama yoğunluğu ve süresini artırın. Bir daha güçlü yapışık hücre türünü kullanın. </td></tr><tr><td> Zayıf birikimimatris veya Biyomoleküllerin durum. </td><td> Parçacıkların ve agrega temiz iğne, baskı parametrelerini onaylamak ve floresan belirteçler, örneğin, rodamin-konjuge dekstran lekelenme değerlendirir. </td></tr><tr><td> hücre-matris etkileşimlerinin spesifikliği. </td><td> Farklı hücre tipleri, bazı ancak diğer ECM proteinleri spesifik olarak yapışır. senin hücreleri ile birden fazla farklı ECM proteinleri test edin. </td></tr><tr><td> imalattan sonra suboptimal dizi depolama. </td><td> Biz dondurma sırasında faz değişiklikleri önlemek için kısmen,% 65 RH ve oda sıcaklığında gece boyunca fabrikasyon dizileri saklamak öneririz. Hücre yapışması, her iki nem, sıcaklık ve depolama süresi karşı duyarlıdır; Bu parametreler deneyler için optimize / tutarlı olduğundan emin olun. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Hücre kültürü sırasında cam alt tabakadan hidrojel dekolmanı. </td><td> Kötü slayt temizleme ve silanizasyon. </td><td> slayt temizliği için çalışan çözümler değiştirin vesilanizasyon. </td></tr><tr><td> Overdehydrated hidrojel. </td><td> daha uzun 15-30 dakika süreyle sıcak bir plaka üzerinde kurutucu hidrojeller bırakmayın. </td></tr><tr><td> Verilerin 4. analizi. </td><td> tekrarlanan noktalar ve slaytlar arasında yüksek değişkenlik. </td><td> Dizi üretiminde değişkenliği. </td><td> pim ve yazıcı kafası temiz olup olmadığını kontrol edin. nemlendirici işlevi onaylayın. Görselleştirmek ve floresan işaretlerini kullanarak spot ve dizi kalitesini ölçmek. olarak saklayın dizileri yukarıda önerilir. </td></tr></tbody></table> Tablo 1: Sorun Giderme.

Hücre farklılaşması, iki matris bileşimi ve substrat malzeme özellikleri de dahil olmak üzere mikro-çevresel faktörlerin, bir ana bilgisayar tarafından kontrol edilir. Biz burada hücre farklılaşması ve microenvironmental bağlamında bir fonksiyonu olarak biyomekanik hücre substrat etkileşimleri hem değerlendirmek için çekiş kuvvet mikroskobu ile birlikte hücre mikrodiziler kullanan bir tekniği açıklar.

Hücre farklılaşması ve Çekiş Kuvvetleri Korelatif Analizi için Yüksek verim Hücre Mikroarray Platformu

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

Bu hücre mikro-dizi platformunun genel amacı, hem hücre farklılaşmasının hem de traksiyon kuvvetlerinin ölçümlerini mikroçevresel bağlama bağlı olarak ilişkilendirmektir. Bu yöntem, kök hücre biyolojisinin temel araştırmalarına ve farklılaşma protokollerinin optimizasyonuna olanak sağlayarak doku mühendisliği alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajları arasında yüksek işlem kapasitesi, biyokimyasal ve biyofiziksel ipuçlarını çeşitlendirme yeteneği ile hem immünofloresan yöntemlerle hem de traksiyon kuvveti mikroskopisi (TFM) ile uç nokta okumaları yapabilmesi yer almaktadır.Bu yöntemler karaciğer progenitör farklılaşmasını anlamak için kullanılmış olsa da, diğer arteriyel hücre tiplerine ve doku bağlamlarına kolayca uygulanabilir. Deneysel başarı, dizileme protokolünün hem yüksek kaliteli hidrojel substratlar hem de traksiyon kuvveti mikroskobisi ile entegrasyonuna bağlı olduğundan, bu yöntemin görsel gösterimi kritiktir. TFM kullanarak hücre-substrat etkileşimlerinin canlı değerlendirmesi için silanize edilmiş 35 mm cam tabanlı bir petri kabı üzerinde floresan boncuk içeren poliakrilamid hidrojeller üretmek için, öncelikle metin protokolünde açıklandığı şekilde cam substratları çözeltilerde hazırlayın.Silanize edilmiş 35 mm cam tabanlı petri kaplarını cam bir kurutma tepsisine yerleştirin ve her bir kabın merkezine 20 µL oranında 9:1 ön-polimer boncuk ve foto başlatıcı çözeltisi pipetleyin. Baloncuk oluşumunu önleyerek, her bir kabın üzerini 12 mm'lik dairesel bir lam ile nazikçe kapatın. Floresan boncukların hidrojelin yüzeyine yayılması için kapları ters çevirin ve 20 dakika boyunca oda sıcaklığında bekletin.Kap ters çevrilmiş haldeyken, 10 dakika boyunca 365 nanometre UVA ışığına maruz bırakın. Polimerizasyon süresini gerektiği gibi optimize edin. Ardından, hidrojelleri 1 molar HEPES tamponuna daldırın ve oda sıcaklığında, karanlıkta gece boyunca bekletin.Polimerize hidrojellere zarar vermemeye dikkat ederek, lamel camları bir jilet yardımıyla dikkatlice kaldırın. Hidrojelleri, kurumaları için bir ısıtıcı tabla üzerinde 50 degrees Celsius sıcaklıkta kurutun. Hidrojeller, oda sıcaklığında ve karanlıkta üç ay boyunca saklanabilir.Metin protokolünde açıklandığı şekilde, biyomolekülleri basmak ve kaynak plaka için tamponları hazırlayın. Metin protokolünde açıklandığı şekilde temiz pinleri yükledikten sonra, mikro-dizileyiciyi hazırlayın ve üretici yazılımını kullanarak programlayın. Ardından, nemlendirici üniteyi açın.Set değerini %65 bağıl nem olarak ayarlayın ve reometre set değerine ulaşana kadar bekleyin. Kaynak plakayı uygun adaptöre yerleştirin. Ardından, dehidrate edilmiş hidrojel altlıkları uygun adaptöre yerleştirin.Kaynak plakanın düzenini, dizi tasarımını ve istenen formatı doğru şekilde yansıtacak şekilde program parametrelerini ayarlayın. Dizi üretimini başlatın. Nem oranının %65 bağıl nemin altına düşmediğini ve pinlerin tıkanmadığını saatte en az bir kez kontrol edin.Nem beklenmedik şekilde düştüyse, nemlendiriciyi doldurmak ve ilgili tüplerdeki yoğuşmayı gidermek için dizileme işlemini durdurun. Pinler tıkalıysa, pinleri temizlemek veya önceden temizlenmiş pinlerle değiştirmek için dizileme işlemini durdurun. Program tamamlandığında, hazırlanan dizileri alüminyum folyo ile kapatılmış bir lam kutusuna veya mikro plakaya yerleştirin.Dizileri oda sıcaklığında ve %65 bağıl nemde gece boyunca bekletin. Deneyimlerimize göre, en yaygın zorluklar dizi üretimiyle ilgilidir. Üretilen dizilerin teknik kalitesini ve dayanıklılığını floresan işaretli moleküller, genel protein boyaları ve immunofloresan yöntemler kullanarak doğrulamanızı öneririz.Hazırlamadan bir gün sonra, dizi oluşturulmuş 35 mm petri kaplarını PVS içindeki 3 mL %1 hacimce hacme penisilin-streptomisin çözeltisine daldırın. Dizili substratları 30 dakika boyunca UVC ışığına maruz bırakın. Ardından, penisilin-streptomisin çözeltisini hücre kültür medyası ile değiştirin.Hücreler toplandıktan ve sayıldıktan sonra, hücreleri her bir 35 mm petri kabı başına 3 mL olacak şekilde dizilere ekin. Dizi kültürlerini 37 °C ve %5 CO2 ortamında, iki ila 24 saat boyunca veya yeterince yoğun hücre adacıkları oluşana kadar inkübe edin. Ekim yoğunluğu ve süresi, kullanılan hücrelere ve özel uygulamaya bağlı olarak ayarlanabilir.Hücre adacıklarının oluşmasına izin verdikten sonra, array kültürlerini önceden ısıtılmış 3 mL hücre kültürü medyumu ile iki kez yıkayın. Bu noktada, biyolojik sisteme uygun kontroller ve ilgilenilen tedaviler eklenebilir. Herhangi bir tedavinin konsantrasyonunu korumak için arraylerin medyumunu bir ila iki günde bir değiştirin.Dizi kültürlerini başlattıktan sonraki bir ila beş gün içerisinde, TFM kullanarak hücre-substrat etkileşimlerinin canlı değerlendirmesini gerçekleştirin. Dizi kültürlerini içeren 35 mm'lik petri kaplarını, TFM ölçümleri için robotik sahneye sahip, inkübatörlü bir ters floresan mikroskoba taşıyın. Bir kapta, faz kontrast mikroskopisi kullanarak bireysel hücre adacıklarının konumlarını ve odak düzlemlerini işaretleyin.Boncukları görüntülemek için uzak kırmızı floresan mikroskopisine geçin. Ardından, önceki adımda kaydedilen konumların her birine geri dönün ve odak düzleminin z-koordinatını, hücre adacığının altındaki boncukların yalnızca ilk katmanı odakta olacak şekilde düzeltin. Yeni koordinatları kaydedin ve disosiasyon öncesi faz kontrast ve uzak kırmızı floresan görüntülerini yakalamak için tüm hücre adacıklarının otomatik görüntülemesine geçin.Ardından, 150 µL BSA/SDS çözeltisini dikkatlice kaba ekleyin ve hücrelerin substrattan tamamen ayrışması için beş dakika bekleyin. Hücre ayrışmasını faz kontrast mikroskobu kullanarak izleyin. Hücre adacıkları substrattan ayrıştıktan sonra, işaretli konumlara geri dönün ve ilk boncuk katmanının hala odakta olduğunu kontrol edin.Hücre kaynaklı traksiyonun neden olduğu deformasyon nedeniyle bu boncuklar düzlem dışına çıkmışsa, tekrar odaklanmaları için odak düzleminin z-koordinatını düzeltin. Düzeltilmiş z-koordinatlarını kaydedin ve disosyasyon sonrası uzak kırmızı floresan görüntülerini yakalamak için tüm adacıkların otomatik görüntülemesini tekrarlayın. Bu adımları geri kalan kaplar için de tekrarlayın.Protein A/G konjuge notch ligandları jagged 1 ve delta like 1, hidrojelde gelişmiş tutulum göstermiştir. Notch ligand sunumu ayrıca, yeşil safra kanalı hücresi belirtecinin varlığıyla belirtildiği üzere, karaciğer öncüllerinin safra kanalı hücresi kaderine doğru farklılaşmasını sağlamıştır. Notch ligandlarına verilen yanıt beş farklı ekstrasellüler matris veya ECM proteini için nicelendirilmiş ve karaciğer öncüllerinin ligandlara verdiği yanıtın ECM bağlamına bağlı olduğunu göstermiştir.Delta like one ve jagged one ligandlarından yoksun progenitörler oluşturmak için küçük saç tokası RNA (shRNA) nakavti kullanılmıştır. Hücreler daha sonra notch ligandları jagged one, delta like one ve delta like four ile karşı karşıya getirilmiştir. Dizilen notch ligandına verilen yanıt, hücrenin kendi içindeki ilgili ligand ekspresyonuna bağlı olarak farklılık göstermiştir.Bu görüntüler, karaciğer öncüllerinin farklılaşmasının hem substrat sertliğine hem de ECM kompozisyonuna bağlı olduğunu göstermektedir. Kantitatif analizler, kolajen dördün hem yumuşak hem de sert substratlarda farklılaşmayı desteklediğini, fibronektinin ise yalnızca sert substratlarda farklılaşmayı desteklediğini ortaya çıkarmıştır. Temsili ısı haritaları, düşük substrat sertliğindeki kolajen dört üzerinde sürdürülen traksiyon stresinin, safra kanalı hücrelerine farklılaşmayı teşvik ettiğini göstermektedir.Bu bulgu, çekiş gerilmesinin ortalama karekök ortalama değerlerinin nicelendirilmesiyle doğrulanmıştır. Bu video ve beraberindeki protokol, hidrojellerin ve dizilerin hazırlanması, dizi tabanlı substratlar üzerinde hücre kültürü gerçekleştirilmesi ve çekiş kuvveti mikroskopisi kullanılarak hücre-substrat etkileşimlerinin ölçülmesi için temel adımları sunmuştur. Tekniklere aşina olunduktan sonra, uygun şekilde yürütüldüğü takdirde her bir deney bir ila iki hafta kadar kısa bir sürede tamamlanabilir.Bu yöntemle bağlantılı olarak, yüksek skorlu dizi koşullarını doğrulamak için kalitatif PCR, immünoblotlama, standart ölçekli mekanobiyoloji eksenleri veya diğer tamamlayıcı moleküler biyoloji teknikleri kullanılarak hücre kültürlerinden yararlanılmalıdır. Bu çok yönlü platform; kök hücre farklılaşması ve kanser hücresi biyolojisi dahil olmak üzere, çok sayıda hücre ve doku bağlamında hücre fonksiyonlarının yüksek kapasiteli incelemesine uygulanabilir.

a-high-throughput-cell-microarray-platform-for-correlative-analysis

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bu protokolde, teknolojinin dayandığı dikey yerinden mesajların microactuator dizi imalat, ve nasıl bu temel teknoloji, yüksek verimli mekanik dinamik hücre kültürü, hem de iki boyutlu ve üç boyutlu kültür yapmak için değiştirilebilir göstermektedir paradigmalar.

Mekanik Dinamik Hücre Kültürü için Microfabricated platformlar

Bu videoda çekiş kuvveti mikroskobu testi açıklanmaktadır. Tahlil, gömülü floresan boncuklara sahip yumuşak elastik hidrojel üzerinde bulunan hücre dışı matris üzerindeki insan kolon kanseri hücrelerinin hücresel çekişini belirler. Floresan boncukların ortaya çıkan yer değiştirmesi, uygun bir yazılım kullanılarak ölçülür.

Traksiyon Sitometrisi Testi: Kanser Hücrelerinin ECM Üzerine Uyguladığı Traksiyon Kuvvetini Ölçmek İçin Bir Yöntem

Biz mikro ölçekli hücre stimülasyonu deneyler için otomatik bir hücre kültürü ve sorgulama platformu geliştirdik. Platform yetiştirilmesi ve hücrelerin küçük nüfus uyarıcı ve moleküler analizler için lizatları kurtarma, basit, çok yönlü ve hassas kontrol sağlar. Platform de değerli hücreleri ve / veya reaktif kullanmak çalışmalar için uygundur.

Mikro ölçekli Hücre Stimülasyon deneyler için Çok Yönlü Otomatik Platformu

Bu çalışma, sinir sistemi kurtarma ve onarımı için uzun süreli in vivo nakil çalışmalarında uygulanmadan önce tasarlanmış kök hücreleri ve davranışlarını hızlı bir şekilde karakterize etmek için deneysel bir platformu tanımlamaktadır.

Nöroprotektif Stratejileri Tedavi Faktörleri teslimi için tasarlandı Erişkin Kök Hücre Yüksek Verimli Karakterizasyonu

Açıklanan, yapışık hücreler ve mikroyapılı substratlar arasındaki mekanik etkileşimleri ölçmek için kullanılan protokollerdir. Bu etkileşimler, göç, proliferasyon, farklılaşma ve apoptoz dahil olmak üzere temel hücre davranışlarıyla yakından bağlantılıdır. Protokoller, her bir mikro direk için ilgili kuvvetlerin belirlenmesini sağlayan MechProfiler adlı açık kaynaklı bir görüntü analiz yazılımı sunar.

Micropost Diziler Kolay ve Doğru Mekanik-profil

Biz silikon kauçuk (PDMS) ile imal yüksek verim çekiş kuvveti tahlil sunuyoruz. Bu roman tahlil çeşitli biyolojik ve Biyomedikal süreçler ve hastalıklar sırasında hücre kontrazlığı fiziksel değişiklikler okumak için uygundur. Bu yöntemin yardımcı programını, epitelyal-mesenkimal geçiş sırasında bir TGF-β bağımlılık artışına göre ölçerek gösteriyoruz.

PDMS kullanarak yüksek verim çekiş kuvveti mikroskobu dönüşüm büyüme faktörü-β epitelyal-mezenkimal geçiş üzerinde doz bağımlı etkileri ortaya çıkarır

Mekanik kuvvetler hücre göçlerini kontrol etmek için önemlidir. Bu protokol, hücre yapısı ve göç değişiklikleri ortaya çıkarmak için yerel bir sertlik gradyan ile hücreleri uyarmak için bir cam mikropipette ve bir mikromanipülatör kullanılarak deforme edilebilir elastik hidrojellerin kullanımını göstermektedir.

Hücresel Hareketin Mekanik Kontrolünün Ve İlgili Sinyal Olaylarının Değerlendirilmesi için Tek Hücreli Durotaksis Tsay

Bu protokol, referanssız, çekiş kuvveti mikroskobu olarak kullanılmak üzere poli (etilen glikol) bazlı hidrojellere gömülü üç boyutlu floresan fidüyal belirteçdizilerini imal etmek için multifoton litografinin uygulanması için talimatlar sağlar. Platform. Bu talimatlar kullanılarak, 3B malzeme gerinimölçümü ve hücresel çekişlerin hesaplanması, yüksek iş gücü kuvveti ölçümlerini teşvik etmek için basitleştirilmiştir.

Referanssız Çekiş Kuvveti Mikroskopi Platformunun İmalatı ve Uygulanması

Gelişimkolektif hücre göçü, yara iyileşmesi, ve kanser metastazı genellikle büyüme faktörleri veya sinyal moleküllerinin gradyanları tarafından yönlendirilir. Burada açıklanan bir mikroakışkan sistem ve biyokimyasal gradyan altında kolektif göç mekaniği ölçmek için nasıl bir gösteri ile çekiş mikroskobu birleştiren deneysel bir sistemdir.

Kemotaktik Kolektif Göç için Mikroakışkanlarla Entegre Çekiş Mikroskobu

Hücresel Sinyalleri Analiz Etmek için Bütünleştirici Araç Seti (iTACS) platformu, bağlı hücrelerdeki çok çeşitli kimyasal ve mekanik sinyalleri aynı anda ölçme işlemini otomatikleştirir. iTACS, topluluk odaklı gelişimi kolaylaştırmak ve araştırmacıların eğitim geçmişlerine bakılmaksızın tüm platform özelliklerini kullanmalarını sağlamak için tasarlanmıştır.

Hücresel Sinyalleri Analiz Etmek için Bütünleştirici Araç Seti: Kuvvetler, Hareket, Morfoloji ve Floresan

Bu çalışma, floresan olarak etiketlenmiş elastomerik büzülebilir yüzeyler (FLECS) Teknolojisini, floresan protein mikrodesenlerinin görselleştirilmiş yer değiştirmelerine dayanan tek hücreli kontraktil kuvvetlerin basitleştirilmiş, eller kapalı nicelleştirilmesi için mikrowell formatında kullanmak için esnek bir protokol sunmaktadır.

Mikrodesenli Elastomerler Kullanarak Tek Hücreli Kasılmanın Basitleştirilmiş, Yüksek Verimli Analizi

Öğrenin hücre farklılaşması ve çekiş kuvvetleri korelasyon analizi için yüksek verimli hücre mikroarray platformunu. Bu yöntem kök hücre biyolojisi ve doku mühendisliği çalışmalarında kullanılır.

Hücre farklılaşması ve Çekiş Kuvvetleri Korelatif Analizi için Yüksek verim Hücre Mikroarray Platformu

Daha fazla video keşfet