Hücre farklılaşması ve Çekiş Kuvvetleri Korelatif Analizi için Yüksek verim Hücre Mikroarray Platformu
1 Mart 2017
Hücre farklılaşması, iki matris bileşimi ve substrat malzeme özellikleri de dahil olmak üzere mikro-çevresel faktörlerin, bir ana bilgisayar tarafından kontrol edilir. Biz burada hücre farklılaşması ve microenvironmental bağlamında bir fonksiyonu olarak biyomekanik hücre substrat etkileşimleri hem değerlendirmek için çekiş kuvvet mikroskobu ile birlikte hücre mikrodiziler kullanan bir tekniği açıklar.
Bu hücre mikro-dizi platformunun genel amacı, hem hücre farklılaşmasının hem de traksiyon kuvvetlerinin ölçümlerini mikroçevresel bağlama bağlı olarak ilişkilendirmektir. Bu yöntem, kök hücre biyolojisinin temel araştırmalarına ve farklılaşma protokollerinin optimizasyonuna olanak sağlayarak doku mühendisliği alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajları arasında yüksek işlem kapasitesi, biyokimyasal ve biyofiziksel ipuçlarını çeşitlendirme yeteneği ile hem immünofloresan yöntemlerle hem de traksiyon kuvveti mikroskopisi (TFM) ile uç nokta okumaları yapabilmesi yer almaktadır.
Bu yöntemler karaciğer progenitör farklılaşmasını anlamak için kullanılmış olsa da, diğer arteriyel hücre tiplerine ve doku bağlamlarına kolayca uygulanabilir. Deneysel başarı, dizileme protokolünün hem yüksek kaliteli hidrojel substratlar hem de traksiyon kuvveti mikroskobisi ile entegrasyonuna bağlı olduğundan, bu yöntemin görsel gösterimi kritiktir. TFM kullanarak hücre-substrat etkileşimlerinin canlı değerlendirmesi için silanize edilmiş 35 mm cam tabanlı bir petri kabı üzerinde floresan boncuk içeren poliakrilamid hidrojeller üretmek için, öncelikle metin protokolünde açıklandığı şekilde cam substratları çözeltilerde hazırlayın.
Silanize edilmiş 35 mm cam tabanlı petri kaplarını cam bir kurutma tepsisine yerleştirin ve her bir kabın merkezine 20 µL oranında 9:1 ön-polimer boncuk ve foto başlatıcı çözeltisi pipetleyin. Baloncuk oluşumunu önleyerek, her bir kabın üzerini 12 mm'lik dairesel bir lam ile nazikçe kapatın. Floresan boncukların hidrojelin yüzeyine yayılması için kapları ters çevirin ve 20 dakika boyunca oda sıcaklığında bekletin.
Kap ters çevrilmiş haldeyken, 10 dakika boyunca 365 nanometre UVA ışığına maruz bırakın. Polimerizasyon süresini gerektiği gibi optimize edin. Ardından, hidrojelleri 1 molar HEPES tamponuna daldırın ve oda sıcaklığında, karanlıkta gece boyunca bekletin.
Polimerize hidrojellere zarar vermemeye dikkat ederek, lamel camları bir jilet yardımıyla dikkatlice kaldırın. Hidrojelleri, kurumaları için bir ısıtıcı tabla üzerinde 50 degrees Celsius sıcaklıkta kurutun. Hidrojeller, oda sıcaklığında ve karanlıkta üç ay boyunca saklanabilir.
Metin protokolünde açıklandığı şekilde, biyomolekülleri basmak ve kaynak plaka için tamponları hazırlayın. Metin protokolünde açıklandığı şekilde temiz pinleri yükledikten sonra, mikro-dizileyiciyi hazırlayın ve üretici yazılımını kullanarak programlayın. Ardından, nemlendirici üniteyi açın.
Set değerini %65 bağıl nem olarak ayarlayın ve reometre set değerine ulaşana kadar bekleyin. Kaynak plakayı uygun adaptöre yerleştirin. Ardından, dehidrate edilmiş hidrojel altlıkları uygun adaptöre yerleştirin.
Kaynak plakanın düzenini, dizi tasarımını ve istenen formatı doğru şekilde yansıtacak şekilde program parametrelerini ayarlayın. Dizi üretimini başlatın. Nem oranının %65 bağıl nemin altına düşmediğini ve pinlerin tıkanmadığını saatte en az bir kez kontrol edin.
Nem beklenmedik şekilde düştüyse, nemlendiriciyi doldurmak ve ilgili tüplerdeki yoğuşmayı gidermek için dizileme işlemini durdurun. Pinler tıkalıysa, pinleri temizlemek veya önceden temizlenmiş pinlerle değiştirmek için dizileme işlemini durdurun. Program tamamlandığında, hazırlanan dizileri alüminyum folyo ile kapatılmış bir lam kutusuna veya mikro plakaya yerleştirin.
Dizileri oda sıcaklığında ve %65 bağıl nemde gece boyunca bekletin. Deneyimlerimize göre, en yaygın zorluklar dizi üretimiyle ilgilidir. Üretilen dizilerin teknik kalitesini ve dayanıklılığını floresan işaretli moleküller, genel protein boyaları ve immunofloresan yöntemler kullanarak doğrulamanızı öneririz.
Hazırlamadan bir gün sonra, dizi oluşturulmuş 35 mm petri kaplarını PVS içindeki 3 mL %1 hacimce hacme penisilin-streptomisin çözeltisine daldırın. Dizili substratları 30 dakika boyunca UVC ışığına maruz bırakın. Ardından, penisilin-streptomisin çözeltisini hücre kültür medyası ile değiştirin.
Hücreler toplandıktan ve sayıldıktan sonra, hücreleri her bir 35 mm petri kabı başına 3 mL olacak şekilde dizilere ekin. Dizi kültürlerini 37 °C ve %5 CO2 ortamında, iki ila 24 saat boyunca veya yeterince yoğun hücre adacıkları oluşana kadar inkübe edin. Ekim yoğunluğu ve süresi, kullanılan hücrelere ve özel uygulamaya bağlı olarak ayarlanabilir.
Hücre adacıklarının oluşmasına izin verdikten sonra, array kültürlerini önceden ısıtılmış 3 mL hücre kültürü medyumu ile iki kez yıkayın. Bu noktada, biyolojik sisteme uygun kontroller ve ilgilenilen tedaviler eklenebilir. Herhangi bir tedavinin konsantrasyonunu korumak için arraylerin medyumunu bir ila iki günde bir değiştirin.
Dizi kültürlerini başlattıktan sonraki bir ila beş gün içerisinde, TFM kullanarak hücre-substrat etkileşimlerinin canlı değerlendirmesini gerçekleştirin. Dizi kültürlerini içeren 35 mm'lik petri kaplarını, TFM ölçümleri için robotik sahneye sahip, inkübatörlü bir ters floresan mikroskoba taşıyın. Bir kapta, faz kontrast mikroskopisi kullanarak bireysel hücre adacıklarının konumlarını ve odak düzlemlerini işaretleyin.
Boncukları görüntülemek için uzak kırmızı floresan mikroskopisine geçin. Ardından, önceki adımda kaydedilen konumların her birine geri dönün ve odak düzleminin z-koordinatını, hücre adacığının altındaki boncukların yalnızca ilk katmanı odakta olacak şekilde düzeltin. Yeni koordinatları kaydedin ve disosiasyon öncesi faz kontrast ve uzak kırmızı floresan görüntülerini yakalamak için tüm hücre adacıklarının otomatik görüntülemesine geçin.
Ardından, 150 µL BSA/SDS çözeltisini dikkatlice kaba ekleyin ve hücrelerin substrattan tamamen ayrışması için beş dakika bekleyin. Hücre ayrışmasını faz kontrast mikroskobu kullanarak izleyin. Hücre adacıkları substrattan ayrıştıktan sonra, işaretli konumlara geri dönün ve ilk boncuk katmanının hala odakta olduğunu kontrol edin.
Hücre kaynaklı traksiyonun neden olduğu deformasyon nedeniyle bu boncuklar düzlem dışına çıkmışsa, tekrar odaklanmaları için odak düzleminin z-koordinatını düzeltin. Düzeltilmiş z-koordinatlarını kaydedin ve disosyasyon sonrası uzak kırmızı floresan görüntülerini yakalamak için tüm adacıkların otomatik görüntülemesini tekrarlayın. Bu adımları geri kalan kaplar için de tekrarlayın.
Protein A/G konjuge notch ligandları jagged 1 ve delta like 1, hidrojelde gelişmiş tutulum göstermiştir. Notch ligand sunumu ayrıca, yeşil safra kanalı hücresi belirtecinin varlığıyla belirtildiği üzere, karaciğer öncüllerinin safra kanalı hücresi kaderine doğru farklılaşmasını sağlamıştır. Notch ligandlarına verilen yanıt beş farklı ekstrasellüler matris veya ECM proteini için nicelendirilmiş ve karaciğer öncüllerinin ligandlara verdiği yanıtın ECM bağlamına bağlı olduğunu göstermiştir.
Delta like one ve jagged one ligandlarından yoksun progenitörler oluşturmak için küçük saç tokası RNA (shRNA) nakavti kullanılmıştır. Hücreler daha sonra notch ligandları jagged one, delta like one ve delta like four ile karşı karşıya getirilmiştir. Dizilen notch ligandına verilen yanıt, hücrenin kendi içindeki ilgili ligand ekspresyonuna bağlı olarak farklılık göstermiştir.
Bu görüntüler, karaciğer öncüllerinin farklılaşmasının hem substrat sertliğine hem de ECM kompozisyonuna bağlı olduğunu göstermektedir. Kantitatif analizler, kolajen dördün hem yumuşak hem de sert substratlarda farklılaşmayı desteklediğini, fibronektinin ise yalnızca sert substratlarda farklılaşmayı desteklediğini ortaya çıkarmıştır. Temsili ısı haritaları, düşük substrat sertliğindeki kolajen dört üzerinde sürdürülen traksiyon stresinin, safra kanalı hücrelerine farklılaşmayı teşvik ettiğini göstermektedir.
Bu bulgu, çekiş gerilmesinin ortalama karekök ortalama değerlerinin nicelendirilmesiyle doğrulanmıştır. Bu video ve beraberindeki protokol, hidrojellerin ve dizilerin hazırlanması, dizi tabanlı substratlar üzerinde hücre kültürü gerçekleştirilmesi ve çekiş kuvveti mikroskopisi kullanılarak hücre-substrat etkileşimlerinin ölçülmesi için temel adımları sunmuştur. Tekniklere aşina olunduktan sonra, uygun şekilde yürütüldüğü takdirde her bir deney bir ila iki hafta kadar kısa bir sürede tamamlanabilir.
Bu yöntemle bağlantılı olarak, yüksek skorlu dizi koşullarını doğrulamak için kalitatif PCR, immünoblotlama, standart ölçekli mekanobiyoloji eksenleri veya diğer tamamlayıcı moleküler biyoloji teknikleri kullanılarak hücre kültürlerinden yararlanılmalıdır. Bu çok yönlü platform; kök hücre farklılaşması ve kanser hücresi biyolojisi dahil olmak üzere, çok sayıda hücre ve doku bağlamında hücre fonksiyonlarının yüksek kapasiteli incelemesine uygulanabilir.
Genel Bakış
Bu çalışma, çeşitli mikroçevresel bağlamlarda hücre farklılaşması ve çekme kuvvetlerini ilişkilendirmek için tasarlanmış bir hücre mikro-dizi platformu sunmaktadır. Yöntem, kök hücre biyolojisi ve doku mühendisliği uygulamalarının anlaşılmasını geliştirmektedir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Hücre biyolojisi
- Doku mühendisliği
- Biyomekanik
Arka Plan
- Hücre farklılaşması, mikroçevresel faktörlerden etkilenir.
- Hücre-substrat etkileşimlerini değerlendirmek için traksiyon kuvveti mikroskobisi (TFM) kullanılır.
- Kök hücre araştırmalarının ilerletilmesi için yüksek verimli teknikler gereklidir.
- Biyokimyasal ve biyofiziksel uyaranların entegrasyonu, deneysel başarı için kritiktir.
Çalışmanın Amacı
- Hücre farklılaşmasını ve biyomekanik etkileşimleri değerlendirmek.
- Çeşitli hücre tipleri için farklılaşma protokollerini optimize etmek.
- Mikrodiziler tekniğinin görsel bir gösterimini sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Floresan boncuklar içeren poliakrilamid hidrojellerin hazırlanması.
- Biyomoleküllerin mikro-dizi baskısı.
- Hücre kültürü ve hazırlanan diziler üzerine ekimi.
- TFM kullanılarak hücre-substrat etkileşimlerinin canlı değerlendirmesi.
Temel Sonuçlar
- Yöntem, hücre davranışının gerçek zamanlı olarak izlenmesine olanak tanır.
- Karaciğer progenitör hücrelerinin başarılı diferansiyasyonu gösterilmiştir.
- Tutarlı sonuçlarla yüksek kaliteli diziler üretilebilir.
- TFM, hücre etkileşimlerinin mekanik özellikleri hakkında bilgiler sağlar.
Sonuçlar
- Hücre mikroarray platformu, kök hücre araştırmaları için değerli bir araçtır.
- Çeşitli hücre tiplerinin ve bunların farklılaşmasının incelenmesine olanak tanır.
- Gelecekteki uygulamalar diğer doku bağlamlarına da yayılabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Sektörel Alaka Düzeyi
Bu platform, doku mühendisliği ve rejeneratif tıbbaki temel bir zorluğa çözüm getirerek, kök hücre farklılaşmasındaki biyokimyasal ve biyofiziksel ipuçlarının yüksek verimli korelasyonuna olanak tanır. İmmünofloresan ve traksiyon kuvvet mikroskopisini entegre ederek, erken hedef doğrulama ve mekanistik risk azaltma süreçlerinde öngörü güvenini artıran kantitatif, çok parametreli okumalar sağlar. Sistem, mikroçevresel faktörlerin ölçeklenebilir taramasını destekleyerek, preklinik süreç ilerlemesindeki devam/tamam kararlarına veri sağlar.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Belirlenmiş mikroçevresel koşullar altında, farklılaşma sonuçlarını hücre altı traksiyon kuvvetleri ile ilişkilendirerek terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Kontrollü ve tekrarlanabilir bir formatta, ECM proteinlerinin ve ligand kombinasyonlarının yüksekle geçirgenlikli taraması aracılığıyla fonksiyonel hedef doğrulamasını destekler.
- Öngörücü Değer: Substrat sertliğinin ve biyokimyasal ipuçlarının hücre kaderi kararlarını birlikte nasıl etkilediğini belirleyerek hedef mekanizmadaki belirsizliği azaltır ve mekanistik risklerin azaltılmasını kolaylaştırır.
Tarama ve Deney Geliştirme
- Bilimsel Değer: Hücre farklılaşması ve traksiyon kuvvetleri üzerine standartlaştırılmış, kantitatif veri setleri oluşturarak, dizili koşullar altında güvenilir bileşik veya ligand değerlendirmesine olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Standartlaştırılmış hidrojel fabrikasyonu, baskı sırasında kontrollü nem ve valide edilmiş boncuk tabanlı TFM okumaları aracılığıyla analiz tekrarlanabilirliğini sağlar.
- Ölçeklenebilirlik Değeri: Mikro-dizi baskı iş akışlarıyla uyumlu olup, verimli öncü madde tanımlaması için lam başına düzinelerce mikroçevresel kombinasyonun paralel olarak test edilmesine imkan verir.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Değer: İmmünofloresans ve biyomekanik ölçümler aracılığıyla safra kanalı hücre kaderinin doğrudan okumaları ile karaciğer progenitör farklılaşmasında hastalıkla ilgili uygulanabilirliği gösterir.
- Preklinik Süreklilik: Farklılaşma etkinliği ve mekanobiyolojik yanıtlar hakkında çok parametreli veriler sağlayarak, keşif ölçekli mekanistik içgörüler ile preklinik doğrulama arasında köprü kurar.
- Riskten Arındırılmış Karar Verme: Permisif matrislerde sürdürülebilir traksiyon stresinin ve farklılaşmanın gözlendiği koşulların önceliklendirilmesine olanak tanıyarak veri odaklı ilerlemeyi destekler.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, hedef hipotez testinden öncü bileşik belirlemeye kadar uzanan keşif sürekliliğine uygundur; özellikle mekanotransdüksiyonun etkinliği veya toksisiteyi etkilediği hedefler için geçerlidir.
- Keşif Biyolojisi: Hücre farklılaşması ve kuvvet üretimi üzerindeki dizilen biyokimyasal ve biyofiziksel değişkenlerin etkilerini izole ederek hipotez testlerini destekler.
- Tarama: İmmünofloresans ve TFM aracılığıyla analize hazır, standartlaştırılmış çıktılar sunarak mikroçevresel koşulların nicel karşılaştırılmasına olanak tanır.
- Analitik: Ekiplerin koşulları farklılaşma etkinliğine ve mekanik fenotipe göre sıralamasına imkan veren çok parametreli okumalar (floresans yoğunluğu, traksiyon stresi RMS) sağlar.
- Translasyonel Araştırma: Valide edilmiş, hastalıkla ilişkili hücre modelleri ve doku düzeyindeki davranışın öngörücü ölçülebilir biyomekanik uç noktalar aracılığıyla preklinik çalışmalarla bağlantı kurar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Fabrike edilmiş hidrojel substratlar depolanabilir ve projeler genelinde yeniden kullanılabilir niteliktedir; bu da platformu ölçeklenebilir ve disiplinler arası bir yetkinlik olarak konumlandırır.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Korele biyokimyasal ve biyomekanik profilleme yoluyla mekanistik belirsizliği azaltarak, hedef mekanizmalardaki öngörü güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Kontrollü hidrojel üretimi, dizileme sırasında çevresel izleme ve TFM için valide edilmiş disosyasyon/yeniden görüntüleme iş akışları aracılığıyla tekrarlanabilirliği ve standardizasyonu geliştirir.
- Stratejik Değer: Mikroçevresel koşulların hızlıca önceliklendirilmesine olanak tanıyarak, düşük throughputlu ardışık doğrulamalara olan bağımlılığı azaltır ve sermaye verimliliğini artırır.
- Portföy Etkisi: Uyumlu farklılaşma ve biyomekanik yanıtların olduğu koşulları belirleyerek, riskle uyumlu önceliklendirmeyi destekler ve ilerleme kararlarına temel oluşturur.
Uygulama Hususları
- Hidrojel kimyası, mikroarray basımı ve traksiyon kuvveti mikroskobu kurulumu ile kalibrasyonu konularında uzmanlık gerektirir.
- UVA/UVC maruziyet sistemlerine, nemlendirilmiş arrayleme platformlarına ve robotik sahneli ters floresan mikroskoplara erişime bağlıdır.
- Nem kontrolü, pin bakımı ve substrat saklama koşulları dahil olmak üzere, array fabrikasyon protokollerinin ekipler arası standartlaştırılmasını gerektirir.
- Alternatif hücre tiplerine adaptasyon; ekim yoğunluğunun, kültür süresinin ve disosiyasyon koşullarının optimizasyonunu gerektirebilir.
- Pratik kısıtlamalar arasında, hidrojel polimerizasyonu sırasında dikkatli bir şekilde hava kabarcıklarından kaçınılması ve hücre kültüründen önce floresan etiketleme yoluyla array kalitesinin doğrulanması gerekliliği yer alır.
