Hücre farklılaşması ve Çekiş Kuvvetleri Korelatif Analizi için Yüksek verim Hücre Mikroarray Platformu
March 1st, 2017
Hücre farklılaşması, iki matris bileşimi ve substrat malzeme özellikleri de dahil olmak üzere mikro-çevresel faktörlerin, bir ana bilgisayar tarafından kontrol edilir. Biz burada hücre farklılaşması ve microenvironmental bağlamında bir fonksiyonu olarak biyomekanik hücre substrat etkileşimleri hem değerlendirmek için çekiş kuvvet mikroskobu ile birlikte hücre mikrodiziler kullanan bir tekniği açıklar.
Bu hücre mikrodizi platformunun genel amacı, mikro-çevresel bağlamın bir fonksiyonu olarak hem hücre farklılaşmasının hem de çekiş kuvvetlerinin ölçümlerini ilişkilendirmektir. Bu yöntem, doku mühendisliği alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olarak hem kök hücre biyolojisinin temel araştırmalarını hem de farklılaşma protokollerinin optimizasyonunu mümkün kılabilir. Bu tekniğin ana avantajları arasında verimi, biyokimyasal ve biyofiziksel ipuçlarını değiştirme yeteneği ve hem immünoforesans hem de çekiş kuvveti mikroskobu veya TFM ile son nokta okumaları yer alır.
Bu yöntemi kullanmış olsalar da, karaciğer progenitör farklılaşmasını anlayanlar, diğer arteriyel hücre tiplerine ve doku bağlamlarına kolayca uygulanabilir. Deneysel başarı, dizileme protokolünün hem yüksek kaliteli hidrojel substratlar hem de çekiş kuvveti mikroskobu ile entegrasyonuna bağlı olduğundan, bu yöntemin görsel gösterimi kritik öneme sahiptir. TFM kullanarak hücre substrat etkileşimlerinin canlı değerlendirmesi için silanize 35 mm cam tabanlı petri kabı üzerinde poliakrilamid hidrojeller içeren floresan boncuk imal etmek için, önce metin protokolünde açıklandığı gibi çözeltiler halinde cam substratları hazırlayın.
Silinize 35 mm cam tabanlı petri kaplarını bir cam kurutma tepsisine yerleştirin ve her bir kabın ortasına 20 mikrolitre 9'a 1 pre-polimer boncuk - foto başlatıcı solüsyona pipetleyin. Kabarcık oluşumunu önlerken her bir tabağı 12 mm'lik dairesel bir kapak astarı ile nazikçe örtün. Floresan boncukları hidrojelin yüzeyine dağıtmak için, bulaşıkları ters çevirin ve 20 dakika oda sıcaklığında bırakın.
Hala ters çevrilmiş durumdayken, çanağı 10 dakika boyunca 365 nanometre UVA'ya maruz bırakın. Polimerizasyon süresini gerektiği gibi optimize edin. Daha sonra, hidrojelleri 1 molar HEPES tamponuna daldırın ve gece boyunca karanlıkta oda sıcaklığında bırakın.
Polimerize hidrojellere zarar vermemeye dikkat ederek kapak fişlerini bir ustura ile dikkatlice çıkarın. Hidrojelleri kuruyana kadar sıcak bir plakada 50 santigrat derecede kurutun. Hidrojeller oda sıcaklığında karanlıkta üç ay saklanabilir.
Biyo-molekülleri yazdırmak ve kaynak plakası için metin protokolünde açıklandığı gibi tamponları hazırlayın. Temiz pimleri metin protokolünde açıklandığı gibi yükledikten sonra, mikroarrayer'ı hazırlayın ve üretici yazılımını kullanarak programlayın. Ardından, nemlendirici ünitesini açın.
Ayar noktasını %65 bağıl neme ayarlayın ve reometre ayar noktasıyla eşleşene kadar bekleyin. Kaynak plakasını uygun adaptöre yerleştirin. Ardından susuz hidrojel alt tabakaları uygun adaptöre yerleştirin.
Kaynak plakasının düzenini, dizi tasarımını ve istenen formatı doğru bir şekilde yansıtmak için programın parametrelerini ayarlayın. Dizi imalatını başlatın. Nemin %65 bağıl nemin altına düşmediğini ve pimlerin tıkalı olmadığını saatte bir defadan az kontrol etmeyin.
Nem beklenmedik bir şekilde düştüyse, nemlendiriciyi doldurmak ve ilgili yoğuşma tüplerini temizlemek için dizgeyi duraklatın. Pimler tıkalıysa, pimleri temizlemek için diziyi duraklatın veya başka bir şekilde önceden temizlenmiş pimlerle değiştirin. Program tamamlandıktan sonra, fabrikasyon dizileri alüminyum folyo ile kaplı bir kayar kutuya veya mikro plakaya yerleştirin.
Dizileri gece boyunca oda sıcaklığında %65 bağıl nemde bırakın. Deneyimlerimize göre, en yaygın zorluklar dizi üretimi ile ilgilidir. Floresan etiketli moleküller, genel protein boyaları ve immün floresanlar kullanılarak fabrikasyon dizilerin teknik kalitesini ve sağlamlığını onaylamanızı öneririz.
İmalattan sonraki gün, dizi 35 mm petri kaplarını PVS'de hacim başına 3 mL %1 hacim penisilin-streptomisin içine daldırın. Dizili alt tabakaları 30 dakika boyunca UVC'de maruz bırakın. Daha sonra penisilin-streptomisin çözeltisini hücre kültürü ortamı için değiştirin.
Hücreleri topladıktan ve saydıktan sonra, hücreleri 35 mm petri kabı başına 3 mL'lik dizilere tohumlayın. Dizi kültürlerini 37 santigrat derecede ve% 5 CO2'de iki ila 24 saat veya iyi nüfuslu hücre adaları oluşana kadar inkübe edin. Tohumlama yoğunluğu ve süresi, hücrelere ve özel uygulamaya bağlı olarak ayarlanabilir.
Hücre adalarının oluşumuna izin verdikten sonra, dizi kültürlerini 3 mL önceden ısıtılmış hücre kültürü ortamı ile iki kez yıkayın. Bu noktada, ilgilenilen uygun kontroller ve tedaviler biyolojik sisteme eklenebilir. Herhangi bir tedavinin konsantrasyonunu korumak için dizilerin ortamını her bir ila iki günde bir değiştirin.
Dizi kültürlerinin başlatılmasından sonraki bir ila beş gün içinde, TFM kullanarak hücre substrat etkileşimlerinin canlı değerlendirmesini gerçekleştirin. Dizi kültürleri içeren 35 mm'lik petri kaplarını, TFM ölçümleri için robotik aşamalı inkübe edilmiş ters çevrilmiş bir floresan mikroskoba taşıyın. Bir tabakta, faz kontrast mikroskobu kullanarak tek tek hücre adalarının konumlarını ve odak düzlemlerini işaretleyin.
Boncukları görselleştirmek için uzak kırmızı floresan mikroskobuna geçin. Ardından, önceki adımda kaydedilen konumların her birine geri dönün ve odak düzleminin z koordinatını düzeltin, böylece hücre adasının altındaki yalnızca ilk boncuk tabakası odakta olur. Yeni koordinatları kaydedin ve ayrışma öncesi faz kontrastını ve uzak kırmızı floresan görüntüleri yakalamak için tüm hücre adalarının otomatik görüntülemesine devam edin.
Daha sonra, tabağa dikkatlice 150 mikrolitre BSA / SDS çözeltisi ekleyin ve substrattan tam hücre ayrışmasına izin vermek için beş dakika bekleyin. Faz kontrast mikroskobu kullanarak hücre ayrışmasını izleyin. Hücre adaları alt tabakadan ayrıldıktan sonra, işaretli konumlara geri dönün ve ilk boncuk tabakasının hala odakta olup olmadığını kontrol edin.
Bu boncuklar, hücre tarafından oluşturulan çekişin neden olduğu deformasyon nedeniyle düzlem dışındaysa, odaklanılan düzlemin z koordinatını tekrar odakta olacak şekilde düzeltin. Düzeltilmiş z koordinatlarını kaydedin ve ayrışma sonrası uzak kırmızı floresan görüntüleri yakalamak için tüm adaların otomatik görüntülemesini tekrarlayın. Kalan yemekler için bu adımları tekrarlayın.
Protein A/G konjuge çentik ligandları pürüzlü ve delta benzeri hidrojellerde daha iyi tutma gösterdi. Çentik ligand sunumu ayrıca, yeşil safra kanalı hücresi markörünün varlığı ile gösterildiği gibi, karaciğer progenitörlerinin bir safra kanalı hücresi kaderine doğru farklılaşmasına neden oldu. Çentik ligandlarına verilen yanıt, beş hücre dışı matris veya ECM proteini için ölçüldü ve karaciğer progenitörlerinin ligandlara tepkisinin ECM bağlamına bağlı olduğunu gösterdi.
Küçük saç tokası RNA yıkımı, ligandlar delta gibi bir ve pürüzlü bir tane olmadan progenitörler oluşturmak için kullanıldı. Hücreler daha sonra çentikli ligandlarla sunuldu: pürüzlü, biri pürüzlü, delta bir, delta dört. Dizili çentik ligandına yanıt, her iki ligandın hücre içsel ifadesine bağlı olarak değişmiştir.
Bu görüntüler, hem substrat sertliğine hem de ECM bileşimine bağlı olarak karaciğer progenitörlerinin farklılaşmasını göstermektedir. Kantitatif analiz, kollajen dörtlünün hem yumuşak hem de sert substratlarda farklılaşmayı desteklediğini, fibronektinin ise sadece sert substratlarda farklılaşmayı desteklediğini ortaya koydu. Temsili ısı haritaları, kollajen dört üzerindeki düşük substrat sertliğinde sürekli çekiş stresinin, safra kanalı hücrelerine farklılaşmayı teşvik ettiğini göstermektedir.
Bu bulgu, çekiş geriliminin ortalama kök ortalama kare değerlerinin nicelleştirilmesiyle doğrulanmıştır. Bu video ve beraberindeki protokol, dizili substratlar üzerinde hücre kültürü gerçekleştirmek için hidrojeller ve diziler üretmek ve çekiş kuvveti mikroskobu kullanarak hücre substrat etkileşimlerini ölçmek için ana adımları sağlamıştır. Tekniklere aşina olduktan sonra, uygun şekilde yapılırsa her deney bir ila iki hafta gibi kısa bir sürede tamamlanabilir.
Bu yöntemle kasılmada, kalitatif PCR, immünoblotlama, standart ölçekli mekanobiyoloji eksenleri veya diğer tamamlayıcı moleküler biyoloji teknikleri kullanılarak yüksek skorlu dizi koşullarını doğrulamak için hücre kültürleri kullanılmalıdır. Bu çok yönlü platform, kök hücre farklılaşması ve kanser hücresi biyolojisi dahil olmak üzere çok sayıda hücre ve doku bağlamında hücre fonksiyonlarının yüksek verimli araştırmasına uygulanabilir.
Genel Bakış
Bu çalışma, çeşitli mikroçevresel bağlamlarda hücre farklılaşması ve çekiş kuvvetlerini ilişkilendirmek üzere tasarlanmış bir hücre mikrodizisi platformu sunmaktadır. Yöntem, kök hücre biyolojisi ve doku mühendisliği uygulamaları hakkındaki anlayışı artırmaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Hücre biyolojisi
- Doku mühendisliği
- Biyomekanik
Arka Plan
- Hücre farklılaşması mikroçevresel faktörlerden etkilenir.
- Traksiyon kuvveti mikroskobu (TFM), hücre-alt tabaka etkileşimlerini değerlendirmek için kullanılır.
- Yüksek verimli teknikler, kök hücre araştırmalarının ilerlemesi için gereklidir.
- Biyokimyasal ve biyofiziksel sinyallerin entegrasyonu deneysel başarı için kritiktir.
Çalışmanın Amacı
- Hücre farklılaşması ve biyomekanik etkileşimleri değerlendirmek.
- Çeşitli hücre tipleri için farklılaşma protokollerini optimize etmek.
- Mikrodizisi tekniğinin görsel bir gösterimini sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Floresan boncuklu poliakrilamid hidrojellerin üretimi.
- Biyomoleküllerin mikrodizisi baskısı.
- Hücre kültürü ve üretilen diziler üzerinde tohumlama.
- TFM kullanarak hücre-alt tabaka etkileşimlerinin canlı değerlendirilmesi.
Ana Sonuçlar
- Yöntem, hücre davranışının gerçek zamanlı izlenmesini sağlar.
- Karaciğer progenitör hücrelerinin başarılı farklılaşması gösterilmiştir.
- Tutarlı sonuçlarla yüksek kaliteli diziler üretilebilir.
- TFM, hücre etkileşimlerinin mekanik özellikleri hakkında bilgiler sağlar.
Sonuçlar
- Hücre mikrodizisi platformu, kök hücre araştırmaları için değerli bir araçtır.
- Çeşitli hücre tiplerinin ve bunların farklılaşmasının çalışmasını sağlar.
- Gelecek uygulamaları diğer doku bağlamlarına uzanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This platform enables high-throughput correlation of biochemical and biophysical cues in stem cell differentiation, addressing a key challenge in tissue engineering and regenerative medicine. By integrating immunofluorescence and traction force microscopy, it provides quantitative, multiparametric readouts that enhance predictive confidence in early target validation and mechanistic de-risking. The system supports scalable screening of microenvironmental factors, informing go/no-go decisions in preclinical pipeline advancement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by correlating differentiation outcomes with subcellular traction forces under defined microenvironmental conditions.
- Operational Value: Supports functional target validation through high-throughput screening of ECM proteins and ligand combinations in a controlled, reproducible format.
- Predictive Value: Facilitates mechanistic de-risking by identifying how substrate stiffness and biochemical cues jointly influence cell fate decisions, reducing ambiguity in target mechanism.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, quantitative datasets on cell differentiation and traction forces, enabling reliable compound or ligand evaluation across arrayed conditions.
- Operational Value: Ensures assay reproducibility through standardized hydrogel fabrication, controlled humidity during printing, and validated bead-based TFM readouts.
- Scalability Value: Compatible with microarray printing workflows, allowing parallel testing of dozens of microenvironmental combinations per slide for efficient lead identification.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Demonstrates disease-relevant applicability in liver progenitor differentiation, with direct readouts of bile duct cell fate via immunofluorescence and biomechanical metrics.
- Preclinical Continuity: Bridges discovery-scale mechanistic insights with preclinical validation by providing multiparametric data on differentiation efficacy and mechanobiological responses.
- Risk-Adjusted Decision-Making: Enables prioritization of conditions that show sustained traction stress and differentiation on permissive matrices, supporting data-driven advancement.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification, particularly for targets where mechanotransduction influences efficacy or toxicity.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating the effects of arrayed biochemical and biophysical variables on cell differentiation and force generation.
- Screening: Delivers assay-ready, standardized outputs via immunofluorescence and TFM, enabling quantitative comparison of microenvironmental conditions.
- Analytics: Provides multiparametric readouts (fluorescence intensity, traction stress RMS) that allow teams to rank conditions by differentiation efficacy and mechanical phenotype.
- Translational Research: Connects to preclinical work through validated, disease-relevant cell models and measurable biomechanical endpoints predictive of tissue-level behavior.
- Enterprise Reuse: Fabricated hydrogel substrates are storable and reusable across projects, positioning the platform as a scalable, cross-disciplinary capability.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target mechanisms by reducing mechanistic ambiguity through correlated biochemical and biomechanical profiling.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization via controlled hydrogel fabrication, environmental monitoring during arraying, and validated dissociation/re-imaging workflows for TFM.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling rapid triage of microenvironmental conditions, reducing reliance on low-throughput, sequential validation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying conditions with concordant differentiation and biomechanical responses, informing advancement decisions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in hydrogel chemistry, microarray printing, and traction force microscopy setup and calibration.
- Dependent on access to UVA/UVC exposure systems, humidified arraying platforms, and inverted fluorescent microscopes with robotic stages.
- Necessitates cross-team standardization of array fabrication protocols, including humidity control, pin maintenance, and substrate storage conditions.
- Adaptation to alternative cell types may require optimization of seeding density, culture duration, and dissociation conditions.
- Practical limitations include the need for careful bubble avoidance during hydrogel polymerization and validation of array quality via fluorescent labeling prior to cell culture.
