Geliştirilmiş Numune Kombine Öncül İzotop Etiketleme ve Isobaric Etiketlemeyi Kullanma Dokuların çoğullama (cPILOT)
1 Mayıs 2017
Kombine ön-madde izotopik etiketleme ve izobarik etiketleme (cPILOT) izobarik etiketlerin örnek çoğullama kabiliyetini arttıran bir sayısal proteomik stratejisidir. Bu protokol bir Alzheimer hastalığı fare modeli ve vahşi tipli kontrollerden dokulara cPILOT uygulanmasını tarif etmektedir.
Bu gelişmiş multipleks yöntemin genel amacı, numune hatasını ve cihaz süresini azaltırken aynı anda analiz edilebilen protein numunelerinin sayısını artırmaktır. Bu yöntem, yaşlanma, nörodejeneratif hastalık, yaşa bağlı diğer hastalıklar ve kanser alanlarında patogenez, ilerleme, tanı, prognoz ve terapötik hedeflerle ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, birçok koşuldaki protein değişikliklerinin kapsamlı bir anlık görüntüsünün oluşturulabilmesidir.
Bu yöntem fare modelinde Alzheimer hastalığı hakkında bilgi sağlayabilse de, Alzheimer veya bir dizi başka bozukluğu olan hastadan alınan doku örneklerine de uygulanabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler, kısa bir zaman diliminde aynı anda ele alınması gereken birkaç örnek olduğu için bunu zor bulacaktır. Bu yöntem için ilk olarak, asetilasyonun protein nitrasyonu için izoberik etiketleme ile birleştirilebileceğini fark ettiğimizde aklımıza geldi ve bu da bizi tekniğin tüm peptitler için küresel olarak çalışmasını sağlamaya motive etti.
Bu çalışma, Alzheimer hastalığı fare modelinden ve vahşi tip kontrollerden beyin, kalp ve karaciğer dokularını analiz edecektir. Her doku örneğinin 60 ila 90 miligramını bir lizasyon tüpüne aktarın ve sekiz molar üre ile 500 mikrolitre PBS ekleyin. Numuneleri mekanik bir homojenizatör kullanarak homojenize edin.
Doku homojenatını lizasyon tüpünden çıkarın ve bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Parçalama tüpünü sekiz molar üre ile 100 ila 500 mikrolitre PBS ile durulayın ve durulama solüsyonunu doku homojenatı ile birleştirin. Doku homojenatını 15 dakika santrifüjleyin.
Her numuneden süpernatanı kavrayın. Protein konsantrasyonunu belirlemek için BCA testini gerçekleştirdikten sonra, her numuneden ayrı ayrı etiketlenmiş mikrosantrifüj tüplerine 100 mikrogram protein ekleyin. Her numuneye ditiotreitol ekleyin.
Ve iki saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Her numuneye iyodoasetamid, IAM ekleyin ve karanlıkta iki saat buz üzerinde inkübe edin. Daha sonra, her numuneye L-sistein ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
30 dakika sonra, üreyi iki azı dişinin nihai konsantrasyonuna seyreltmek için kalsiyum klorür ile tris tamponu ekleyin. Her numuneye L1 tosilimitotofeniletilcholer metil keton ile muamele edilmiş tripsin ekleyin. Ve 24 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.
Ertesi gün, numuneyi sıvı nitrojen içinde hızlı dondurma ile protein sindirimini söndürün ve daha sonraki işlemlere kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın. Dimetilasyon etiketlemesinden önce, peptit numuneleri metin protokolünde açıklandığı gibi tuzdan arındırılır ve vakumlu santrifüjleme ile kurutulur. Dimetilasyon etiketleme prosedürüne başlamak için, peptitleri HPLC veya nanosaf dereceli suda çözünmüş% 1 asetik asit içinde sulandırın.
Her numunenin 50 mikrogramlık bir kısmını yeni bir 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne çıkarın. Sulandırılmış peptitlerin geri kalanını gelecekteki deneyler için eksi 80 santigrat derecede saklayın. Daha sonra gösterilecek adımlarda, kimyasal etkinleştirme reaksiyonlarının tüm numuneler için aynı süre boyunca gerçekleşmesi için reaktiflerin hızlı bir şekilde eklenmesi kritik öneme sahiptir.
Hafif dimetilasyon ile etiketlemek için numunelere sekiz mikrolitre 60 milimolar formaldehit çözeltisi ekleyin. Ağır dimetilasyon ile etiketlemek için numunelere 60 milimolar karbon 13 döteryum etiketli formaldehit çözeltisinden sekiz mikrolitre ekleyin. Hafif dimetilasyon ile etiketlenmiş numunelere sekiz mikrolitre 24 milimolar sodyum siyanoborohidrit ekleyin.
Ağır dimetilasyon ile etiketlenmiş numunelere sekiz mirkolitre 24 milimolar sodyum siyanoboroduderit ekleyin. Numuneleri vorteksleyin ve ardından oda sıcaklığında yaklaşık 10 dakika boyunca bir tüp çalkalayıcı üzerinde hafifçe çalkalayın. Beş dakika boyunca 16 mikrolitre% 1 amonyak ekleyerek reaksiyonları söndürün.
Sekiz mikrolitre% 5 formik asit ekleyerek reaksiyon karışımlarını yeniden asitleştirin. Toplam altı numune oluşturmak için hafif ve ağır dimetillenmiş peptitleri birleştirin. Numune tuzdan arındırma işlemini metin protokolünde açıklandığı gibi gerçekleştirin.
Ve numuneleri vakumlu santrifüjleme ile kurutun. Dimetillenmiş numunelerin izobarik etiketlenmesi için, önce 100 mikrogram dimetillenmiş peptit ve trietilamonyum bikarbonat veya TEAB tamponu sulandırın. Daha sonra, izobarik reaktifleri, üreticinin izobarik etiketleme kitinin protokolüne göre hazırlayın.
Peptit numunelerinin her birine uygun hacmi, bu durumda 41 mikrolitre çözündürülmüş izobarik etiketleme reaktifi ekleyin ve yaklaşık 10 saniye boyunca girdap yapın. Numuneleri bir mikrosantrifüj tüp çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında yaklaşık bir saat çalkalayın. Reaksiyonları söndürmek için her numuneye 8 mikrolitre hidroksilamin ekleyin.
Ve numuneleri oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Etiketli altı numuneyi tek bir karışımda toplayın ve tuzdan arındırın. Peptitleri kütle spektrometresi dereceli suda %0.1 formik asit ile sulandırarak peptitleri sıvı kromatogrofi için hazırlayın.
Sulandırılmış peptitleri 0.65 mikrometre filtre içeren bir mikrosantrifüj tüpüne ekleyin. Ve bir dakika boyunca 12.000 kez g'de santrifüjleyin. Filtreyi çıkarın ve atın.
Filtrelenmiş peptitleri bir otomatik örnekleyici şişesine aktarın. Her güçlü katyon değişim fraksiyonu örneğinden altı mikrolitre enjekte edin. Karbon 18 malzeme ile iki santimetreye kadar paketleyin.
Analitik ayırma ve veri toplama kütle spektrometresi yöntemlerini çalıştırın. Alzheimer hastalığı fare modelinden ve vahşi tip kontrollerden beyin, kalp ve karaciğer dokularının 12 katlı bir cPilot analizi gerçekleştirildi. Öncü veriler, m / z 643.854 ve 647.875'teki zirvelerle temsil edilen hafif ve ağır dimetillenmiş peptitleri gösterdi.
Bu peptitler seçildi, bağımsız olarak izole edildi ve bu spektrumları oluşturmak için çarpışma ile indüklenen ayrışma ile parçalandı. Arama sonuçları, tepe noktalarının fosfogliserat kinaz proteininin bir peptidine ait olduğunu gösterdi. Bu tepeler, daha yüksek enerjili çarpışma ayrışması, tandem kütle spektrometresi için daha fazla izole edildi ve raportör iyonlar gösterildiği gibi gözlendi.
12 numune hakkında bilgi almak için her iki üç aşamalı kütle spektrometresi spektrumu seti de gereklidir. Bu örnekte, Alzheimer hastalığının vahşi tip kontrol iyon oranları, beyin, karaciğer ve kalp dokuları için iki biyolojik kopya arasında benzerdir. Her karşılaştırma için kıvrım değişim değerleri, beyin ve kalpteki fosfoglyerate kinaz bir seviyelerinin Alzheimer hastalığı farelerinde daha yüksek, karaciğerde daha düşük olduğunu göstermektedir.
Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde yapılırsa yaklaşık beş saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, numune işleme konusunda dikkatli olmayı unutmamak önemlidir. Bu prosedüre dahil olarak, harcırah derinliğini ve kapsamını artırmak için güçlü katyon değişimi veya yüksek pH fraksiyonasyonu gibi ayırma yöntemleri gerçekleştirilebilir.
Bu videoyu izledikten sonra, C-Pilot kullanarak örnek çoğullamayı nasıl geliştireceğinizi iyi anlamış olmalısınız.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Kombine öncü izotop etiketleme ve izobarik etiketleme (cPILOT) aynı anda analiz edilen protein örneklerinin sayısını artıran kantitatif proteomik bir stratejidir. Bu yöntem, bir Alzheimer hastalığı fare modelinden ve vahşi tip kontrolörlerden elde edilen dokularda uygulanmaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Proteomik
- Alzheimer Hastalığı Araştırması
Arka Plan
- cPILOT, aynı anda analiz edilen protein örneklerinin sayısını artırır.
- Numune hatasını ve cihaz süresini azaltır.
- Bu yöntem yaşlanma ve nörodejeneratif hastalıklardaki temel soruları ele alır.
- Alzheimer'ın ötesinde çeşitli bozukluklara uygulanabilir.
Çalışmanın Amacı
- Koşullar arasında protein değişikliklerinin kapsamlı bir anlık görüntüsünü sağlamak.
- Patogenez ve tedavi hedeflerinin anlaşılmasına katkıda bulunmak.
- Nörodejeneratif hastalıklarda araştırmayı kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- cPILOT'un fare modeli dokularına uygulanması.
- Asetilasyonun izobarik etiketleme ile birleştirilmesi.
- Aynı anda birden fazla numunenin işlenmesi.
- Protein nitrasyonu hakkında bilgiler elde etmek.
Ana Sonuçlar
- cPILOT, çoklülük kabiliyetlerini başarıyla artırır.
- Alzheimer ile ilgili protein değişiklikleri hakkında bilgiler sağlar.
- Daha geniş araştırma için hasta doku örneklerine uygulanabilir.
- Yaşa bağlı çeşitli hastalıkların analizini kolaylaştırır.
Sonuçlar
- cPILOT, kantitatif proteomik için değerli bir araçtır.
- Nörodejeneratif hastalıklarda araştırmayı ilerletme potansiyeli sunar.
- Yönteme yeni başlayanlar için numune işleme karmaşıklığı nedeniyle zorluklar vardır.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Enhanced sample multiplexing addresses the biopharma need for high-throughput, cost-effective proteomic profiling across diverse biological conditions. By enabling simultaneous analysis of 12 or more samples, cPILOT reduces experimental variability and accelerates target validation in neurodegenerative disease research. This capability supports predictive confidence in early discovery by providing quantitative protein abundance data across genotypes, treatments, and time points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by comparing protein expression across disease models and controls.
- Operational Value: Reduces sample handling error and instrument time through increased multiplexing capacity.
- Strategic Value: Supports portfolio triage by generating comprehensive protein change snapshots across multiple conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces standardized, quantitative proteomic data suitable for assay development and biomarker discovery.
- Operational Value: Enables reproducible sample preparation workflows compatible with downstream liquid chromatography and mass spectrometry.
- Strategic Value: Facilitates screening readiness by allowing comparison of biological replicates, drug treatments, and genotypes in a single run.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides disease-relevant protein expression data from mouse tissues that can inform translational biomarker alignment.
- Operational Value: Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling consistent protein quantification across sample sets.
- Strategic Value: Enhances risk-adjusted advancement decisions by reducing biological noise in comparative analyses.
Pipeline & Workflow Integration
cPILOT integrates into the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification by delivering multiplexed proteomic readouts that inform biological de-risking and target confidence.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification via quantitative comparison of protein abundances across Alzheimer's disease and wild-type tissues.
- Screening: Enables assay readiness through reproducible sample labeling and desalting steps that ensure consistent peptide preparation.
- Analytics: Generates reporter ion data from isobaric tags that allow direct comparison of relative protein abundance across 12 experimental conditions.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical continuity by providing protein expression data from brain, heart, and liver tissues relevant to neurodegenerative disease mechanisms.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable proteomic capability applicable to diverse sample types including cells, tissues, bodily fluids, and whole organisms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing experimental bias through simultaneous multi-sample analysis.
- Operational Value: Enhances standardization and scalability of proteomic workflows through defined chemical labeling protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by decreasing per-sample instrument time and enabling higher throughput in discovery campaigns.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by delivering quantitative protein data across genotypes, treatments, and biological replicates for informed go/no-go decisions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in proteomic sample preparation, including tissue homogenization, protein digestion, and peptide labeling techniques.
- Depends on access to mass spectrometry instrumentation capable of detecting isobaric tag reporter ions and performing tandem mass spectrometry fragmentation.
- Necessitates cross-team standardization of reagent handling and timing controls to ensure consistent labeling efficiency across samples.
- Involves adaptation considerations for different sample input types, as global cPILOT applies to cells, tissues, bodily fluids, or whole organisms with protocol adjustments for lysis and digestion.
- Involves practical limitations related to sample handling complexity, particularly when processing multiple samples simultaneously under time-sensitive chemical reaction conditions.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:14
Protein Extraction and Generation of Peptides for Chemical-tagging
2:05
Sample Digestion
3:16
Dimethylation Labeling (N-termini)
5:13
Isobaric Tagging (Lys residues)
6:12
Liquid Chromatography – Tandem Mass Spectrometry (LC-MS/MS) and MS3
7:02
Results: cPILOT Can Be Used to Analyze Tissues from an Alzheimer's Disease Mouse Model and Wild-type Controls
8:23
Conclusion
