Geliştirilmiş Numune Kombine Öncül İzotop Etiketleme ve Isobaric Etiketlemeyi Kullanma Dokuların çoğullama (cPILOT)

Bu gelişmiş multipleks yöntemin genel amacı, numune hatasını ve cihaz süresini azaltırken aynı anda analiz edilebilen protein numunelerinin sayısını artırmaktır. Bu yöntem, yaşlanma, nörodejeneratif hastalık, yaşa bağlı diğer hastalıklar ve kanser alanlarında patogenez, ilerleme, tanı, prognoz ve terapötik hedeflerle ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, birçok koşuldaki protein değişikliklerinin kapsamlı bir anlık görüntüsünün oluşturulabilmesidir.

Bu yöntem fare modelinde Alzheimer hastalığı hakkında bilgi sağlayabilse de, Alzheimer veya bir dizi başka bozukluğu olan hastadan alınan doku örneklerine de uygulanabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler, kısa bir zaman diliminde aynı anda ele alınması gereken birkaç örnek olduğu için bunu zor bulacaktır. Bu yöntem için ilk olarak, asetilasyonun protein nitrasyonu için izoberik etiketleme ile birleştirilebileceğini fark ettiğimizde aklımıza geldi ve bu da bizi tekniğin tüm peptitler için küresel olarak çalışmasını sağlamaya motive etti.

Bu çalışma, Alzheimer hastalığı fare modelinden ve vahşi tip kontrollerden beyin, kalp ve karaciğer dokularını analiz edecektir. Her doku örneğinin 60 ila 90 miligramını bir lizasyon tüpüne aktarın ve sekiz molar üre ile 500 mikrolitre PBS ekleyin. Numuneleri mekanik bir homojenizatör kullanarak homojenize edin.

Doku homojenatını lizasyon tüpünden çıkarın ve bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Parçalama tüpünü sekiz molar üre ile 100 ila 500 mikrolitre PBS ile durulayın ve durulama solüsyonunu doku homojenatı ile birleştirin. Doku homojenatını 15 dakika santrifüjleyin.

Her numuneden süpernatanı kavrayın. Protein konsantrasyonunu belirlemek için BCA testini gerçekleştirdikten sonra, her numuneden ayrı ayrı etiketlenmiş mikrosantrifüj tüplerine 100 mikrogram protein ekleyin. Her numuneye ditiotreitol ekleyin.

Ve iki saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Her numuneye iyodoasetamid, IAM ekleyin ve karanlıkta iki saat buz üzerinde inkübe edin. Daha sonra, her numuneye L-sistein ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.

30 dakika sonra, üreyi iki azı dişinin nihai konsantrasyonuna seyreltmek için kalsiyum klorür ile tris tamponu ekleyin. Her numuneye L1 tosilimitotofeniletilcholer metil keton ile muamele edilmiş tripsin ekleyin. Ve 24 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Ertesi gün, numuneyi sıvı nitrojen içinde hızlı dondurma ile protein sindirimini söndürün ve daha sonraki işlemlere kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın. Dimetilasyon etiketlemesinden önce, peptit numuneleri metin protokolünde açıklandığı gibi tuzdan arındırılır ve vakumlu santrifüjleme ile kurutulur. Dimetilasyon etiketleme prosedürüne başlamak için, peptitleri HPLC veya nanosaf dereceli suda çözünmüş% 1 asetik asit içinde sulandırın.

Her numunenin 50 mikrogramlık bir kısmını yeni bir 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne çıkarın. Sulandırılmış peptitlerin geri kalanını gelecekteki deneyler için eksi 80 santigrat derecede saklayın. Daha sonra gösterilecek adımlarda, kimyasal etkinleştirme reaksiyonlarının tüm numuneler için aynı süre boyunca gerçekleşmesi için reaktiflerin hızlı bir şekilde eklenmesi kritik öneme sahiptir.

Hafif dimetilasyon ile etiketlemek için numunelere sekiz mikrolitre 60 milimolar formaldehit çözeltisi ekleyin. Ağır dimetilasyon ile etiketlemek için numunelere 60 milimolar karbon 13 döteryum etiketli formaldehit çözeltisinden sekiz mikrolitre ekleyin. Hafif dimetilasyon ile etiketlenmiş numunelere sekiz mikrolitre 24 milimolar sodyum siyanoborohidrit ekleyin.

Ağır dimetilasyon ile etiketlenmiş numunelere sekiz mirkolitre 24 milimolar sodyum siyanoboroduderit ekleyin. Numuneleri vorteksleyin ve ardından oda sıcaklığında yaklaşık 10 dakika boyunca bir tüp çalkalayıcı üzerinde hafifçe çalkalayın. Beş dakika boyunca 16 mikrolitre% 1 amonyak ekleyerek reaksiyonları söndürün.

Sekiz mikrolitre% 5 formik asit ekleyerek reaksiyon karışımlarını yeniden asitleştirin. Toplam altı numune oluşturmak için hafif ve ağır dimetillenmiş peptitleri birleştirin. Numune tuzdan arındırma işlemini metin protokolünde açıklandığı gibi gerçekleştirin.

Ve numuneleri vakumlu santrifüjleme ile kurutun. Dimetillenmiş numunelerin izobarik etiketlenmesi için, önce 100 mikrogram dimetillenmiş peptit ve trietilamonyum bikarbonat veya TEAB tamponu sulandırın. Daha sonra, izobarik reaktifleri, üreticinin izobarik etiketleme kitinin protokolüne göre hazırlayın.

Peptit numunelerinin her birine uygun hacmi, bu durumda 41 mikrolitre çözündürülmüş izobarik etiketleme reaktifi ekleyin ve yaklaşık 10 saniye boyunca girdap yapın. Numuneleri bir mikrosantrifüj tüp çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında yaklaşık bir saat çalkalayın. Reaksiyonları söndürmek için her numuneye 8 mikrolitre hidroksilamin ekleyin.

Ve numuneleri oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Etiketli altı numuneyi tek bir karışımda toplayın ve tuzdan arındırın. Peptitleri kütle spektrometresi dereceli suda %0.1 formik asit ile sulandırarak peptitleri sıvı kromatogrofi için hazırlayın.

Sulandırılmış peptitleri 0.65 mikrometre filtre içeren bir mikrosantrifüj tüpüne ekleyin. Ve bir dakika boyunca 12.000 kez g'de santrifüjleyin. Filtreyi çıkarın ve atın.

Filtrelenmiş peptitleri bir otomatik örnekleyici şişesine aktarın. Her güçlü katyon değişim fraksiyonu örneğinden altı mikrolitre enjekte edin. Karbon 18 malzeme ile iki santimetreye kadar paketleyin.

Analitik ayırma ve veri toplama kütle spektrometresi yöntemlerini çalıştırın. Alzheimer hastalığı fare modelinden ve vahşi tip kontrollerden beyin, kalp ve karaciğer dokularının 12 katlı bir cPilot analizi gerçekleştirildi. Öncü veriler, m / z 643.854 ve 647.875'teki zirvelerle temsil edilen hafif ve ağır dimetillenmiş peptitleri gösterdi.

Bu peptitler seçildi, bağımsız olarak izole edildi ve bu spektrumları oluşturmak için çarpışma ile indüklenen ayrışma ile parçalandı. Arama sonuçları, tepe noktalarının fosfogliserat kinaz proteininin bir peptidine ait olduğunu gösterdi. Bu tepeler, daha yüksek enerjili çarpışma ayrışması, tandem kütle spektrometresi için daha fazla izole edildi ve raportör iyonlar gösterildiği gibi gözlendi.

12 numune hakkında bilgi almak için her iki üç aşamalı kütle spektrometresi spektrumu seti de gereklidir. Bu örnekte, Alzheimer hastalığının vahşi tip kontrol iyon oranları, beyin, karaciğer ve kalp dokuları için iki biyolojik kopya arasında benzerdir. Her karşılaştırma için kıvrım değişim değerleri, beyin ve kalpteki fosfoglyerate kinaz bir seviyelerinin Alzheimer hastalığı farelerinde daha yüksek, karaciğerde daha düşük olduğunu göstermektedir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde yapılırsa yaklaşık beş saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, numune işleme konusunda dikkatli olmayı unutmamak önemlidir. Bu prosedüre dahil olarak, harcırah derinliğini ve kapsamını artırmak için güçlü katyon değişimi veya yüksek pH fraksiyonasyonu gibi ayırma yöntemleri gerçekleştirilebilir.

Bu videoyu izledikten sonra, C-Pilot kullanarak örnek çoğullamayı nasıl geliştireceğinizi iyi anlamış olmalısınız.