Geliştirilmiş Numune Kombine Öncül İzotop Etiketleme ve Isobaric Etiketlemeyi Kullanma Dokuların çoğullama (cPILOT)

Bu geliştirilmiş multipleks yöntemin genel amacı, örnek hatasını ve cihaz süresini azaltırken aynı anda analiz edilebilen protein örneği sayısını artırmaktır. Bu yöntem; yaşlanma, nörodejeneratif hastalıklar, yaşa bağlı diğer hastalıklar ve kanser alanlarında patogenez, progresyon, tanı, prognoz ve terapötik hedeflerle ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, birçok farklı durumdaki protein değişimlerine dair kapsamlı bir genel görünümün oluşturulabilmesidir.

Bu yöntem fare modellerinde Alzheimer hastalığına dair içgörü sağlayabilse de, Alzheimer hastalarından veya diğer çeşitli bozukluklara sahip bireylerden alınan doku örneklerine de uygulanabilir. Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler, kısa bir zaman dilimi içinde aynı anda işlemesi gereken birçok örnek bulunduğu için zorluk yaşayacaklardır. Asetilasyonun, protein nitrasyonu için izobarik etiketleme ile birleştirilebileceğini fark ettiğimizde bu yöntemle ilgili ilk fikrimiz oluştu ve bu durum, tekniğin tüm peptidler için küresel olarak çalışmasını sağlamamız konusunda bizi motive etti.

Bu çalışma, bir Alzheimer hastalığı fare modeli ve vahşi tip kontrol grubundan alınan beyin, kalp ve karaciğer dokularını analiz edecektir. Her bir doku örneğinden 60 ila 90 mg'ı bir liziz tüpüne aktarın ve sekiz molar üre içeren 500 µL PBS ekleyin. Örnekleri mekanik bir homojenizatör kullanarak homojenize edin.

Doku homojenatını lizleme tüpünden çıkarıp bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Lizleme tüpünü 8 M üre içeren 100 ila 500 µL PBS ile durulayın ve durulama solüsyonunu doku homojenatı ile birleştirin. Doku homojenatını 15 dakika boyunca santrifüjleyin.

Her bir örneğin süpernatantını toplayın. Protein konsantrasyonunu belirlemek için BCA analizi gerçekleştirdikten sonra, her bir örnekten 100 µg proteinle ayrı ayrı etiketlenmiş mikrosantrifüj tüplerine ekleyin. Her bir örneğe ditiyotreitol ekleyin.

Ve 37 °C'de iki saat boyunca inkübe edin. Her örneğe iodoasetamid (IAM) ekleyin ve buz üzerinde karanlıkta iki saat boyunca inkübe edin. Ardından, her örneğe L-sistein ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin.

30 dakika sonra, üre konsantrasyonunu nihai olarak iki molar olacak şekilde seyreltmek için kalsiyum klorür içeren tris tamponu ekleyin. Her örneğe L1 tosilimitotophenylethylcholer methyl ketone ile işlem görmüş tripsin ekleyin ve 37 °C'de 24 saat boyunca inkübe edin.

Ertesi gün, örneği sıvı azot içinde şok dondurarak protein sindirimini durdurun ve ileri işlemlerine kadar -80 °C'de saklayın. Dimetilasyon etiketlemesi öncesinde, peptit örnekleri metin protokolünde açıklandığı gibi tuzdan arındırılır ve vakum santrifüjasyonu ile kurutulur. Dimetilasyon etiketleme prosedürüne başlamak için, peptitleri HPLC veya nanopure grade su içinde çözünmüş %1 asetik asitte yeniden çözünür hale getirin.

Her bir örneğin 50 µg'lık bir kısmını yeni bir 1,5 mL'lik mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Yeniden süspande edilen peptidlerin geri kalanını, gelecek deneyler için -80 °C'de saklayın. Bir sonraki aşamalarda gösterilecek adımlarda, kimyasal etkinleştirme reaksiyonlarının tüm örnekler için aynı süre boyunca gerçekleşmesi adına reaktiflerin hızlıca eklenmesi kritik önem taşımaktadır.

Hafif dimetilasyon ile etiketleme yapılacak örneklere sekiz mikrolitre 60 milimolar formaldehit çözeltisi ekleyin. Ağır dimetilasyon ile etiketleme yapılacak örneklere sekiz mikrolitre 60 milimolar karbon 13 döteryum işaretli formaldehit çözeltisi ekleyin. Hafif dimetilasyon ile etiketlenen örneklere sekiz mikrolitre 24 milimolar sodyum siyanoborohidrür ekleyin.

Ağır dimetilasyon ile etiketlenmiş örneklere 24 millimolar sodyum siyanoborodürid'in sekiz mikrolitresi ekleyin. Örnekleri vorteksleyin ve ardından oda sıcaklığında yaklaşık 10 dakika boyunca bir tüp çalkalayıcıda nazikçe sallayın. Reaksiyonları 16 mikrolitre %1 amonyak ekleyerek beş dakika boyunca durdurun.

Reaksiyon karışımlarına sekiz µL %5 formik asit ekleyerek yeniden asitlendirin. Toplam altı örnek oluşturmak için hafif ve ağır dimetillenmiş peptitleri birleştirin. Örnek tuz giderme işlemini metin protokolünde açıklandığı şekilde gerçekleştirin.

Ve örnekleri vakum santrifüjasyonu ile kurutun. Dimetillenmiş örneklerin izobarik etiketlemesine başlamak için, öncelikle 100 µg dimetillenmiş peptidi trietilamonyum bikarbonat veya TEAB tamponu ile yeniden süspande edin. Ardından, izobarik etiketleme kitinin üretici protokolüne göre izobarik reaktifleri hazırlayın.

Uygun hacimde, bu durumda 41 µL çözünür hale getirilmiş izobarik etiketleme reaktifini her bir peptit örneğine ekleyin ve yaklaşık 10 saniye boyunca vorteksleyin. Örnekleri, oda sıcaklığında yaklaşık bir saat boyunca mikro santrifüj tüp çalkalayıcıda sallayın. Reaksiyonları durdurmak için her bir örneğe 8 µL hidroksilamin ekleyin.

Ardından örnekleri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin. Etiketlenmiş altı örneği tek bir karışımda birleştirin ve tuzdan arındırın. Peptitleri, 0.1% formik asit içeren kütle spektrometrisi saflığında suda yeniden çözerek sıvı kromatografisi için hazırlayın.

Rekonstitüe peptidleri, 0,65 mikrometre filtre içeren bir mikrocentrifüj tüpüne ekleyin. Ve 12.000 ×g'de bir dakika boyunca santrifüjleyin. Filtreyi çıkarın ve atın.

Filtrelenmiş peptitleri bir otomatik örnekleyici şişesine aktarın. Her bir güçlü katyon değişim fraksiyonu örneğinden altı µL'yi bir tuzak kolona enjekte edin. C18 materyali ile iki cm'ye kadar doldurun.

Analitik ayırma ve veri toplama kütle spektrometre yöntemlerini çalıştırın. Bir Alzheimer hastalığı fare modeli ve vahşi tip kontrollerinden alınan beyin, kalp ve karaciğer dokularının 12-plex cPilot analizi gerçekleştirildi. Prekürsör verileri, m/z 643.854 ve 647.875'teki piklerle temsil edilen hafif ve ağır dimetillenmiş peptidleri gösterdi.

Bu peptidler seçilmiş, bağımsız olarak izole edilmiş ve bu spektrumları oluşturmak amacıyla çarpışma kaynaklı ayrışma (collision induced dissociation) ile fragmanlara ayrılmıştır. Tarama sonuçları, piklerin fosfogliserat kinaz 1 proteinine ait bir peptide ait olduğunu göstermiştir. Bu pikler, yüksek enerjili çarpışma ayrışmalı tandem kütle spektrometrisi için daha ileri düzeyde izole edilmiş ve raporlayıcı iyonlar gösterildiği şekilde gözlemlenmiştir.

12 örnek hakkında bilgi edinmek için her iki üç aşamalı kütle spektrometrisi spektrum seti de gereklidir. Bu örnekte, beyin, karaciğer ve kalp dokuları için Alzheimer hastalığı ile vahşi tip kontrol iyon oranları, iki biyolojik tekrarda benzerdir. Her bir karşılaştırma için kat değişimi değerleri, fosfogliserat kinaz bir seviyelerinin beyin ve kalpte Alzheimer hastalığına sahip farelerde daha yüksek, karaciğerde ise daha düşük olduğunu göstermektedir.

Bu teknik bir kez kavrandığında, düzgün bir şekilde uygulandığı takdirde yaklaşık beş saatte tamamlanabilir. Bu prosedürü uygularken, numune taşıma ve işleme sırasında dikkatli olmayı hatırlamak önemlidir. Günlük derinliği ve kapsamı artırmak amacıyla, bu prosedüre güçlü katyon değişimi veya yüksek pH fraksiyonlaması gibi ayırma yöntemleri dahil edilebilir.

Bu videoyu izledikten sonra, C-Pilot kullanarak örnek çoklamanın nasıl artırılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.