Tek Hücreli Histon Post-Translasyonel Modifikasyonlarının Çoklayıcı Analizi için Otomatik Örnek Hazırlığı (sc-hPTM2)
19 Aralık 2025
Burada, izotopik iki plex etiketleme stratejisi ve ArgC sindirimi kullanarak tek hücreli histon post-translasyonel modifikasyon analizini otomatikleştirmek için bir protokol sunuyoruz. Bu iş akışı, tek hücre çözünürlükte kromatin heterojenliği ve epigenetik yanıtların nicel, tekrarlanabilir ve yüksek hassasiyetli profillenmesini mümkün kılar.
Tek hücreli proteomikleri, translasyon sonrası modifikasyonlar için küresel kromatin heterojenliğini incelemek amacıyla otomatik çoklu bir yöntemle geliştiriyoruz. Bu protokolü zorlaştıran şey, pikogram ölçeği proteomik hazırlanması, çoklu etiketleme ve karmaşık kombinatoryal modifiye histon peptitlerinin çözümlenmesidir. Başlamak için, Hep G2/C3A hepatosellüler karsinom hücrelerini buz gibi soğuk PBS'de mikrolitre başına 200 ila 500 hücre konsantrasyonunda yeniden oluşturun.
Her nozulun darbe genişliğini ve sürücü voltajını üreticinin sağladığı değerlere ayarlayın. Maksimum manyetik verimliliği için, iki nozül arasındaki Z offset'in 50 mikrometreden daha az fark olduğundan emin olun. Her nozul için optimal temas konumunu belirleyin ve nozul kurulum sekmesinde Z yükseklik okumalarını karşılaştırın.
Tuplex çoklu yayın şeması için, bir sürgü kaputundaki sürgü tutucuya yükleyin ve ardından enstrümana aktarın. Pipet kullanarak, 150 mikrolitre LCMS sınıfı DMSO'yu yeni bir PCR tüpüne aldırın. Yıkama istasyonunun ikinci yerine koyun, boru kapağı alet kapısına bakacak şekilde yerleştirin.
DMSO koşusuna başla. DMSO aspirasyonundan sonra bir kez stabil drop elde edin. PDC şeffaflığındaki değişikliğe dikkat edin.
Voltajın artırılması gerekebilir. Düşüş ses kontrolü yaparak stabiliteyi doğrulayın. Kamerayı hizalamak için baş kamera sihirbazı kurulumunu yapın.
DMSO'yu dağıtın ve cihazın nomeleri otomatik olarak temizlemesine ve kalite kontrolü için tüm slaytlarda görüntü kaydetmesine izin verin. Bu görüntüleri inceleyerek her slaytta bir DMSO damlası olduğunu ve eksik ya da hedefin dışında damlacık olup olmadığını kontrol edin. Hücre askısını aspire ettikten sonra, hücreyi bir modülde açın, arka plan yakalaması yapın ve ardından fırlatma bölgesini tanımlamak için haritalama rutini çalıştırılır.
Analizi yapın ve ardından parçacıkları boyut ve uzamaya göre hücreler için kapı ile seçin. Şimdi, LCMS sınıfı suda taze bir sindirim master karışımı hazırlayın. Çözeltiyi vakum pompasıyla buz üzerinde 10 dakika gaz ile aşındırın.
Sindirim karışımını slaytlara dağıttıktan sonra, enstrümanın nomeleri otomatik olarak yıkamasına ve her slaytı fotoğraflamasına izin verin. Her damlanın sindirim karışımını eşit şekilde aldığından emin olmak için görüntüleri inceleyin. Sindirim için slaytları gece boyunca oda sıcaklığında kuluçka edin.
Buharlaştırma ve gece boyunca sindirim başlattıktan sonra görüntüleri inceleyin. Damlalar yeterince kuruysa, koşu durdurun. Eğer yoksa, devam et'e tıklayıp beş dakika daha kurut.
Etiketleme için önce çoklu histon derifizasyonu için stok çözeltileri hazırlanın. Dağıtımdan sonra, cihazın nomeleri otomatik olarak yıkamasına ve her slaytı fotoğraflamasına izin verin. Görüntüleri gözden geçirerek tüm slaytlarda eşit dağılımını ve doğru damla yerleşimini doğrulayın.
İnkubasyon tamamlandıktan sonra, hidroksilamin çözeltisi söndürülmek için dağıtılır. Örneği almak için ana sekmeden koşuyu seçin ve ardından koşu sekmesinden çalıştırın. Manyetik işlem bittikten sonra, hata olup olmadığını kontrol etmek için görüntüleri inceleyin.
Pickup işlemi bittikten sonra, manyetik plakanın kapağını çıkarın. Sonra örnekleri düşük ısıda vakum konsantratöründe kurutun. Veri toplama için yüksek performanslı sıvı kromatografi yöntemi programlanın.
MS iki deneyini 50 kütle aşırı yükü izolasyon pencereleri, %27 yüksek enerjili çarpışma ayrışması ve %1000 otomatik kazanç kontrol hedefi olacak şekilde ayarlayın. Plakayı kauçuk bir concap matı ile kaplayın ve otomatik sampler'ın içine yerleştirin. Ham dosyalar alındıktan sonra kısa bir süreliğine kromatogramı kontrol edin ve ardından ham veriyi EpiProfile sürüm 2.1'de çalıştırın. Normalize edilmiş histon PTM bolluklarının çıktı tablosunu inceleyin ve bunu aşağı akış analizleri için kullanın.
İlk 20 histon H3 peptidoformu, kontrol ve sodyum bütirat ile işlenmiş koşullarda göreceli bolluklarını göstererek nicelendirildi. Hem H3 K9 asetilasyonu hem de H3 K14 asetilasyonu, sodyum bütirat işlemiyle daha yüksek göreceli bolluk göstermiştir. H3 K9 asetilasyonu ise K14 asetilasyonu işlenmiş hücrelerde daha da zenginleşmiş görünüyordu.
Sodyum bütirat tedavisinden sonra toplam asetilasyon seviyeleri arttı; tedavi edilen hücreler, tek hücre seviyesinde yakalanan daha yüksek heterojenliği yansıtan kontrollere kıyasla daha geniş bir hata dağılımı gösterdi. Tek ve birlikte gerçekleşen histon modifikasyonlarının nicelendirilmesi, kombinatoryal asetilasyon durumlarının sodyum bütirat tarafından en güçlü şekilde etkilendiğini göstermiştir. Sodyum bütirat ile işlenmiş hücrelerin daha geniş dağılması, sferoidler içindeki bireysel hücreler arasında artan biyolojik heterojenliği göstermiştir.
Bu protokol, bilim insanlarının tek hücre çözeltisinde kromatin durumlarını incelemesine olanak tanıyarak epigenetik araştırmadaki boşluğu kapatır. Bu iş akışı, yüksek verimli örnek hazırlama, örnek çoklaması ve tarafsız kütle spektrometrisi ile hem hassas hem de nicel tek hücreli epigenetik veriler üretmeyi sağlar. Gelecekteki araştırmalar, kromatinin düzenlenmesinin kanser, metabolik hastalıklar ve yaşlanma gibi hastalık durumlarını nasıl değiştirdiğini keşfedecek.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, izotopik iki-plex etiketleme stratejisi kullanarak tek hücreli histon post-translasyonel modifikasyon analizini otomatikleştirmek için bir protokol sunar. İş akışı, tek hücre çözünürlüğünde kromatin heterojenliğinin kantitatif ve yüksek hassasiyetli profilini sağlar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Tek hücreli proteomiks
- Histon post-translasyonel modifikasyonları
- Kromatin analizi
Arka Plan
- Tek hücreli analiz, hücresel heterojenliği anlamak için kritik öneme sahiptir.
- Post-translasyonel modifikasyonlar, kromatin yapısının ve işlevinin düzenlenmesinde kilit rol oynar.
- Otomatik yöntemler, proteomik çalışmalarda tekrarlanabilirliği ve hassasiyeti artırabilir.
- Zorluklar arasında küçük numune boyutlarının ve karmaşık peptit karışımlarının işlenmesi yer alır.
Çalışmanın Amacı
- Tek hücre çözünürlüğünde histon modifikasyonlarını analiz etmek için sağlam bir protokol geliştirmek.
- Proteomik iş akışlarında çoklu etiketlemenin verimliliğini artırmak.
- Düşük bolluktaki histon peptitlerinin zorluklarına hitap etmek.
Kullanılan Yöntemler
- Hep G2/C3A hücrelerinin PBS'de belirli bir konsantrasyonda yeniden yapılandırılması.
- Optimal numune alımı için nozul parametrelerinin ayarlanması.
- Kantifikasyon için izotopik iki-plex etiketlemenin uygulanması.
- Peptit hazırlığı için ArgC sindiriminin kullanılması.
Ana Sonuçlar
- Tek hücreli histon modifikasyon analizinin başarılı otomasyonu.
- Profilde yüksek hassasiyet ve tekrarlanabilirlik gösterildi.
- Karmaşık kombinatoryal modifikasyonlu histon peptitlerinin etkili çözümü.
- Kromatin heterojenliği ve epigenetik tepkiler hakkında bilgiler.
Sonuçlar
- Geliştirilmiş protokol, tek hücre çözünürlüğünde kromatin dinamiği çalışmasını geliştirir.
- Otomasyon, histon modifikasyon analizinin verimliliğini önemli ölçüde artırır.
- Bu yöntem, epigenetikle ilgili çeşitli biyolojik sorulara uygulanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Automated single-cell histone PTM analysis addresses the critical challenge of resolving chromatin heterogeneity and epigenetic regulation at cellular resolution. This workflow enhances predictive confidence in early discovery by enabling quantitative, multiplexed profiling of histone modifications across individual cells. The approach supports risk-adjusted portfolio decisions by providing high-content, reproducible data on epigenetic states relevant to disease and therapeutic modulation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of chromatin regulatory mechanisms at the single-cell level.
- Supports functional target validation by quantifying histone PTM changes in response to perturbations.
- Facilitates mechanistic de-risking through direct measurement of epigenetic heterogeneity.
- Improves predictive confidence for target selection and triage in epigenetic drug discovery.
Screening & Assay Development
- Prepares validated single-cell systems for downstream screening of epigenetic modulators.
- Delivers standardized, reproducible, and quantitative histone PTM readouts for assay development.
- Enables multiplexed comparison of treatment conditions using isotopic labeling strategies.
- Supports scalable, high-throughput workflows for compound evaluation in chromatin biology.
Translational & Preclinical Research
- Aligns single-cell epigenetic profiling with disease-relevant models such as tumor spheroids.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation by capturing cellular heterogeneity in response to therapeutic agents.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on quantitative chromatin state data.
- Supports translational biomarker identification for epigenetic drug development.
Pipeline & Workflow Integration
This automated protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling high-content, quantitative analysis of histone PTMs at single-cell resolution.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by resolving cell-to-cell chromatin variability.
- Screening: Provides assay-ready, multiplexed outputs for robust compound screening and comparison.
- Analytics: Delivers quantitative, normalized histone PTM abundance tables for statistical analysis and condition comparison.
- Translational Research: Connects single-cell epigenetic data to disease models and therapeutic response evaluation.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, automated capability for ongoing epigenetic profiling across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in chromatin-targeted discovery.
- Operational Value: Standardizes and automates sample preparation for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by providing high-content, quantitative data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of epigenetic targets and compounds.
Implementation Considerations
- Requires expertise in single-cell proteomics and mass spectrometry data analysis.
- Needs access to automated nano liquid handling and high-resolution LC-MS instrumentation.
- Demands cross-team standardization for sample preparation and data processing workflows.
- Adaptation may be needed for different cell types or disease models.
- Throughput and sensitivity are limited by instrument capacity and sample handling precision.
