Parafin doku örneklerinin tek hücreli analizinde immünoprofilleme ve mekansal haritalama karakterizasyonu için çoklanmış barkodlama görüntü analizi

Çok katlı barkodlama görüntü analizi son zamanlarda tümör mikroçevresinin karakterizasyonunu geliştirmiş ve hücre kompozisyonu, fonksiyonel durum ve hücre-hücre etkileşimleri hakkında kapsamlı çalışmalara izin vermiştir. Burada, oligonükleotid konjuge antikorların barkodlamasını ve siklus görüntülemeyi kullanarak, yüksek boyutlu bir görüntü analiz tekniğinin kullanılmasına izin veren bir boyama ve görüntüleme protokolünü tanımlıyoruz.

Multipleks barkodlama görüntü analizinden elde edilen yüksek hacimli biyolojik bilgi, bilim adamlarının tümör mikroçevresini ve tümör hücreleri içindeki özel dağılımı daha iyi anlamalarını sağlar. Bu yöntemin en büyük avantajı, tek tek hücrelerin daha derin fenotiplemesini yapma olasılığı ile aynı doku örneğinden bize çok daha ayrıntılı bilgi vermesidir. Bu yöntem, özelleştirilebilir panellerin, yeni hedef tedavi olarak kullanılmak üzere kanser dokusunda potansiyel olarak öngörücü biyobelirteçleri keşfetmek için tümör mikroçevresini incelemesini sağladı.

Oligonükleotid konjuge antikor boyamasına başlamak için, kapak kaymalarını doku yerleştirme ve yapışmaya hazırlamak için oda sıcaklığında, 24 saat boyunca% 0.1 Poli-L-Lizin çözeltisine batırın. Poly-L-Lizin çözeltisini boşalttıktan sonra, kapak fişlerini 30 saniye boyunca ultra saf suyla yıkayın. Yıkama sonrasında, kapak fişlerini ultra saf sudan çıkarın ve gece boyunca kuruması için tüy bırakmayan bir havluya yerleştirin.

İlgilenilen dokunun 5 mikron kalınlığındaki bölümlerini Poli-L-Lizin yüklü bir kapak kaymasının ortasına yerleştirin ve gece boyunca kurumasını bekleyin. Bir kapak kayma tutucusunu gece boyunca 60 santigrat derecede bir fırında önceden ısıtın. Doku bölümlerini içeren kapak kapağını önceden ısıtılmış tutucuya yerleştirin.

60 santigrat derecede 30 dakika pişirdikten sonra, parafinin dokudan eridiğinden emin olun. Numuneyi içeren kapak kayma tutucusunu bir dizi çözelti halinde sırayla hızlıca yerleştirin. Son olarak, kapak kayma tutucusunu DEPC ile arıtılmış ultra saf suya her biri beş dakikalık iki tur boyunca yerleştirin.

Boş bir pipet ucu kutusunun altına suya batırılmış bir kağıt havlu yerleştirerek bir nem odası hazırlayın. Bir düdüklü tencereyi, 50 mililitrelik bir beherin yüksekliğinin yarısını kaplayacak kadar suyla doldurun. Numune başına 5 mililitre metanolü, 4 santigrat derecede bir beher içine yerleştirin.

Gerekli AR9 tampon hacmini dietil pirokarbonat veya DEPC ile arıtılmış ultra saf su ile 1X'e kadar seyreltin. Ardından, 50 mililitrelik bir cam kabı yaklaşık 40 mililitre seyreltilmiş AR9 tamponu ile doldurun. Numuneyi beherdeki kapak kayma tutucusuna batırın ve beheri tamamen alüminyum folyo ile örtün.

Alüminyum folyo kaplı kabı su dolu düdüklü tencereye yerleştirin ve yaklaşık 15 PSI'da 20 dakika pişirin. Ardından beheri çıkarın ve alüminyum folyoyu dikkatlice açın. Beherin oda sıcaklığında yaklaşık 10 dakika soğumasını bekleyin.

Kapak kayma tutucusunu 1X AR9 arabelleğinden çıkarın. DEPC ile işlenmiş ultra saf suda iki dakika boyunca iki kez inkübe edin. Bu arada, hidrasyon tamponunu, antikor seyrelticiyi ve bloke edici N, G, J ve S çözeltilerini çoğullanmış görüntüleme boyama kitinden alın.

Kapak kayma numunesini, hidrasyon tamponunun 5 mililitresine, her biri iki dakika boyunca iki kez yerleştirin. Daha sonra kapak fişi numunesini çoklanmış görüntüleme antikoru seyreltici bloğunun 5 mililitresine yerleştirin ve oda sıcaklığında 20 ila 30 dakika inkübe edin. Kuluçka sırasında antikor kokteylini hazırlayın.

Kuluçkadan sonra, kapak kaymasını önceden hazırlanmış nem odasına yerleştirin. Antikor kokteylinin 190 mikrolitresini pipetleyin, numuneyi kapağın üzerine kaydırın ve üç saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Daha sonra, numuneyi, her biri iki dakika boyunca 5 mililitre çoklanmış görüntüleme antikoru seyreltici bloğu ile iki kez yıkayın.

Bağlı antikorları dokuya sabitlemek için, kapak kaymalarını% 16 formaldehit içinde% 1.6'ya seyreltilmiş depolama çözeltisi ile 10 dakika boyunca inkübe edin ve PBS ile üç kez yıkayın. Kapağı inkübe ettikten sonra metanol içinde beş dakika boyunca kayar, 4 santigrat dereceye kadar önceden soğutun. Yıkamayı takiben, kapak kaymalarını PBS ile seyreltilmiş fiksatif reaktifin 5 mililitresinde 20 dakika boyunca tekrar inkübe edin ve depolamadan önce PBS ile üç kez yıkayın.

Metinde belirtilen kompozisyonu takip ederek muhabir ana karışımını hazırlayın. 96 delikli bir plakadaki bir kuyuyu, raporlayıcı ana karışımını ve bu deneysel döngü için spesifik barkodlu floroforları içeren 245 mikrolitrelik bir çözelti ile doldurun. Şekil, burada bir karsinom paneli için kullanılan bir muhabir plakası yapılandırmasını göstermektedir.

Barkodlu floroforları korumak için, 96 delikli raportör plakasının üzerine bir folyo plaka kapağı yapıştırın ve plakayı çoklanmış görüntüleme cihazının içine yerleştirin. DAPI kanalını kullanarak mikroskop aşamasına bir numune kapağı kayması yerleştirerek ve bir nükleer leke çözeltisinin 1:1500 titrasyonunun 700 mikrolitresini dokuya manuel olarak pipetleyerek görüntülemenin odağını kalibre edin. Çok katlı görüntüleme cihazını hazırlamak için, DEPC ile arıtılmış ultra saf su kullanarak 10X çoklanmış görüntüleme arabelleğini 1X'e seyreltin ve reaktif şişelerini uygun çözeltiler veya çözücülerle doldurun.

Tüm mikroskop parametrelerini ayarlayın ve görüntülenecek numune kapak fişinde ilgilenilen bölgeleri seçin. Deneysel tasarımı enstrüman yöneticisi yazılımına girin. Kontrol yazılımında Deneme düğmesini tıklatın ve Deneme Kurulumu ve Yönetimi penceresinde Yeni Şablon düğmesini tıklatın.

Proje adını Proje düğmesinin yanındaki alana yazın ve toplam döngü sayısını girin. Kanal Ataması düğmesine tıklayın, her döngü için doğru döngü, kuyu numaraları, Z yığını yerleri, işaretçi adı, sınıf ve her döngü için pozlama süresi gibi bilgileri sütunlara yazın. Ardından, Denemeyi Başlat'ı tıklayarak denemeyi başlatın ve denemeyi kaydedin.

Bilgisayardaki QuPath simgesine tıklayın ve yazılımı açın. qptiff dosyasını görüntüleyici penceresine sürükleyin. Parlaklık Karşıtlığı penceresini açmak için parlaklık ve karşıtlık düğmesini tıklatın.

İşaretçi sinyalini göstermek veya gizlemek için seçili sütundaki işaretçiyi işaretleyin veya işaretini kaldırın. İlgi alanını yakınlaştırmak veya uzaklaştırmak için sığdırmak için yakınlaştır düğmesine tıklayın. Görüntü analiz yazılımı kullanılarak görüntülendiğinde, bileşik görüntüler tüm işaretçileri veya seçilen işaretleyicileri istenildiği gibi gösterdi.

Tüm belirteçlerin sinyal yoğunluğu, dinamik aralığı ve uzamsal dağılımı ortaya çıkarıldı. Bu teknik, hücre altı seviyedeki 26 belirtecin tümünün tek bir doku bölümünde analiz edilmesine izin verdi. Multipleks görüntü analizi sürecini takiben, bilişim yaklaşımları ile biyolojik ve klinik içgörü elde etmek için yüksek boyutlu tek hücreli verileri işleyebilir ve analiz edebilir.

Çoklama barkodlama görüntü analizi, bilim adamlarının tümör dokusunun profilini çıkarmalarını ve araştırma sorularını panellerdeki belirteçlere göre cevaplamalarını sağlayan güçlü bir metodolojidir.