arasında Transkriptomik Analizi C. elegans RNA Sıralama Veri
April 8th, 2017
Galaxy ve DAVID biyoinformatik eğitim olmadan araştırmacılar analiz etmek ve RNA-Seq verileri yorumlamak için izin popüler araçlar olarak ortaya çıkmıştır. C. elegans araştırmacılar RNA-Seq deneyler, erişimi gerçekleştirmek ve Galaxy kullanarak veri kümesi işlemek ve DAVID kullanarak gen listelerinden anlamlı biyolojik bilgi elde etmek için biz bir protokol açıklar.
Bu protokolün genel amacı, biyoinformatik uzmanlığı olmayan C.elegans araştırmacılarının bir RNA dizileme deneyi yapmalarına ve açık erişim platformu Galaxy'yi kullanarak verileri analiz etmelerine yardımcı olmaktır. Bu yöntem, C.elegans'taki fenotiplerin arkasındaki transkriptomik imzalar hakkında içgörüler sağlamak için karmaşık yüksek dizileme verilerini analiz etmeye yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, önceden biyoinformatik eğitimi almamış bilim adamlarının ham dizileme verilerini analiz etmelerini ve ilişkili gen ontolojisi terimleriyle birlikte diferansiyel olarak ifade edilen genlerin bir listesini üretmelerini sağlamasıdır.
Bu yöntem özellikle C.elegans dizileme verilerinin nüanslarına yönelik olsa da, genomların, anahtar transkripsiyon değişikliklerinin incelenmesi gereken diğer organizmalara ve biyolojik bağlama da uygulanabilir. Bu video, Galaxy boru hattının web tabanlı kullanımı ile ilgilidir. Mümkünse, iş akışını yerel olarak çalıştırın.
Wiki sayfasındaki talimatlara göre Galaxy'yi indirin ve kurun. Galaxy ana sayfasında sağlanan buradan başlayın eğitimini kullandıktan sonra bu videoyu izleyin. Kullanıcının Galaxy kullanıcı arayüzünü ve iş akışında kullanılan araçları tanıması ve bunlara yönelmesi çok önemlidir.
Başlamak için, analiz ana sayfa görünümüne erişmek için başlık panelindeki verileri analiz et'e tıklayın. Sağ üstteki ilerleme çubuğu, ne kadar disk alanı kullanıldığını izler. Ardından, sol paneldeki araçlar menüsüne erişin ve NGS RNA analizine tıklayın.
Bu, RNA dizi verilerinin analizi için gerekli tüm araçları kullanma seçenekleri sağlar. Şimdi yeni bir analiz geçmişi başlatın. Sağdaki geçmiş paneline gidin.
Dişli çark simgesine tıklayın ve açılır menüden yeni oluştur seçeneğini seçin. Ardından, analizi tanımlamak için geçmiş altında bir ad girin. Devam etmek için araçlar menüsüne gidin ve veri al altında, ham hızlı kuyruk dosyalarını karşıya yüklemek için dosya yükleme işlevine tıklayın.
Görev analiz arayüzünde açıldıktan sonra, yerel dosyayı seç'e tıklayın veya uygun dizi verilerine gitmek ve seçmek için FTP dosyasını seçin. Varsayılan olarak, Galaxy dosya türünü otomatik olarak algılar. Ardından, açılır menüden bu durumda C.elegans olan organizmayı seçin.
Ardından, veri yüklemeyi başlatmak için başlat'a tıklayın. Dosya yüklendikten sonra eylem, verilerin seçilebileceği ve erişilebileceği geçmiş paneline kaydedilir. Şimdi, NGS QC ve manipülasyon menüsüne erişerek, hızlı kuyruk düzleştiriciyi seçerek, taranacak dosya altındaki dosyayı seçerek dosyaları hızlı kuyruk biçiminden hızlı kuyruk sanger biçimine dönüştürün.
Uygun giriş hızlı eşitlik puanlarını seçin, varsayılan parametreleri kullanarak aracı yazın ve çalıştırın. Veri dosyası artık analiz edilebilir. Protokol boyunca kullanılan dosya formatlarına ve test parametrelerine özellikle dikkat edin.
Bu bilgi, başarısız testleri ve diğer sorunları gidermek için değerlidir. Devam etmeden önce kalite kontrol testleri kullanılabilir. Bunları çalıştırmayla ilgili ayrıntılar metin protokolünde verilmiştir.
Bir dosya analiz etmeye hazır olduğunda, önce NGS RNA analizi bölümünü açarak ve ardından üst şapka aracına tıklayarak sıralama verilerini eşleyin. Açılır menüden, bu tek mi yoksa eşleştirilmiş son veri mi sorusunun cevabını doldurun. Ardından, uygun hızlı kuyruk dosyasını seçin.
Sonraki açılır menüde yerleşik bir genom kullan'ı seçin ve referans C.elegans genom verilerini seçin. Diğer tüm parametre seçenekleri için varsayılanı seçin ve ardından yürüt'e tıklayın. Veri setindeki transkriptlerin nispi bolluğunu tahmin etmek için, NGS RNA analizi bölümündeki kol düğmeleri aracını seçin ve ilk açılır menüden, üst şapka analizinden elde edilen eşlenmiş kabul edilen isabetleri bam formatındaki dosyayı seçin.
İkinci açılır menüden, referans ek açıklamasını mevcut genom verilerini içeren GTF dosyasına ayarlayın. Sapma düzeltmesi gerçekleştir seçeneği sunulduğunda evet'i seçin ve varsayılan ayarları kullanarak görevi çalıştırın. Ardından, tüm RNA dizisi örnekleri için üretilen birleştirilmiş transkriptleri birleştirmek için NGS RNA analizi menüsünden manşet birleştirme aracını açın.
Araçtaki ilk kutu, önceki adımda kol düğmeleri kullanılarak üretilen tüm GTF dosyalarını yükler. Şimdi, aynı gerinim koşulunun biyolojik kopyaları da dahil olmak üzere test edilen suşların veya koşulların her biri için birleştirilmiş transkript dosyasını seçin. Kullanıcı başvurusu ek açıklaması için evet'i seçin ve başvuru genom veri dosyasını seçin.
Ardından, sıra verilerini kullan seçeneği için evet'i seçin. Bu, uygun referans genomu otomatik olarak algılar ve seçer. Diğer tüm parametreleri varsayılan ayarlarında bırakın ve yürüt'e tıklayın.
Tek bir GTF dosyası üretilecektir. Birden fazla suşu veya koşulu karşılaştırmak için NGS RNA analizi bölümüne geri dönün ve manşet div aracını seçin. Ardından, manşet div aracındaki transkriptler menüsünden, manşet birleştirmeden birleştirilmiş çıktı dosyasını seçin.
Ardından, iki koşul için etiketleri girin. Her koşul için çoğaltmalara gidin ve üst şapkadan o koşulun farklı biyolojik kopyalarına karşılık gelen kabul edilen isabet çıktı dosyalarını seçin. Aynı anda birden fazla dosya seçmek için komut veya kontrol tuşunu basılı tutun.
Dosyaları seçtikten sonra, varsayılan parametre ayarlarını kullanın ve görevi çalıştırmak için yürüt'e tıklayın. Geçmiş panelinde oluşturulan gen diferansiyel test kutusundaki kaydet simgesine tıklayarak diferansiyel olarak ifade edilen verileri indirin. Başlamak için web sitesinden David'e erişin.
Web sayfasının üst bilgisinden Analizi başlat'ı seçin. Galaxy'den elde edilen genlerin listesini A kutusuna kopyalayın ve bu örnekte solucan tabanı gen kimliği olarak gen tanımlayıcısını seçin.Ardından üçüncü sorudaki liste türü altında gen listesini seçin ve listeyi gönder simgesine tıklayın. Şimdi, David görevlerinin seçilebileceği analiz sihirbazı ana sayfası açılacaktır.
Bu video segmentinde bu seçeneklerden birkaçı açıklanmaktadır. İlk olarak, özet sayfasına gitmek için işlevsel açıklama kümelemesini seçin. Ek açıklama kategorilerini varsayılan ayarlarında bırakın ve işlevsel açıklama kümelemesi'ne tıklayın.
Bu seçenek, zenginleştirme puanlarına göre sıralanmış benzer ek açıklama terimlerinden oluşan kümeler oluşturur. Şimdi, analiz sihirbazına dönün ve gen listesiyle ilişkili önemli ölçüde fazla temsil edilen biyolojik terimleri tanımlamak için işlevsel açıklama tablosu seçeneğini seçin. Değerli bir David özelliği, işlevsel bir açıklama tablosu oluşturma seçeneğidir.
Bu, herhangi bir istatistiksel hesaplama göstermeden genlerle ilişkili tüm ek açıklamaları listeler. Bu, gen analizi ile gen için ve ilgilenilen belirli genleri bulmak için yararlı olabilir. Gözden geçirilmesi gereken bir başka yararlı David aracı, gen fonksiyonel sınıflandırmasıdır.
Bu seçenek, genleri, zenginleştirme puanlarına göre sıralanmış işlevsel olarak ilişkili grupların bir listesine ayırır. Açıklanan protokol, germ hattı kaybını takiben ekspresyonu tcer-1 tarafından modüle edilen genleri tanımlamak için kullanıldı. Uzun ömürlü germ hattı listesi glp-1 mutantlarının transkriptomu, germ hattımızın listelediği ancak yaşam süresi uzaması göstermeyen tcer-1 glp-1 çift mutantları ile karşılaştırıldı.
Dizilerin kalite kontrolü, düşük kaliteli okumalar, %48 ila %49 GC içeriği ve 51 baz çiftinin sabit dizi okuma uzunluğu bulamadı. Örneklerin genom kapsamının yedi kat ile 11 kat arasında olduğu tahmin ediliyordu. Galaxy, her bir suşun iki kopyasından elde edilen NGS verilerinin kombinasyonunu sağladı ve genom geniş ekspresyon profilini vurgulayan gen listeleri oluşturmak için diferansiyel analiz gerçekleştirdi.
Genel olarak, 835 gen, 0.05'lik bir P değeri kesimi kullanılarak iki suş arasında farklı şekilde ifade edildi. Yukarı regüle edilmiş genlerin fonksiyonel notasyon analizi, yüksek zenginleştirme skorlarına sahip dört anotasyon kümesini ortaya çıkardı. Sitokrom P450 ve ksenobiyotik yanıt genleri dahil olmak üzere en yüksek olanı, ardından lipid modifikasyonlarında rol oynayan genler gelir.
Aşağı düzenlenmiş hedeflerin işlevsel açıklama kümelemesi ayrıca çeşitli açıklama kümelerini de tanımladı. Bunlar, hücre iskeleti fonksiyonu, büyümenin pozitif düzenlenmesi, üreme ve yaşlanma için zenginleştirilmiş kümeleri içeriyordu. Galaxy boru hattı, çok çeşitli biyolojik disiplinlerdeki araştırmacıların, büyük ölçekli gen ekspresyonu değişikliklerini hızlı ve verimli bir şekilde analiz etmelerinin yolunu açtı.
Bu videoyu izledikten sonra, bir RNA arama deneyi yapabilmeli ve Galaxy boru hattını kullanarak ham yüksek dizileme verilerini analiz edebilmelisiniz. Ayrıca, David platformunu kullanarak Galaxy verilerinden biyolojik olarak ilgili bilgileri çıkarabilmelisiniz.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu protokol, C.elegans araştırmacılarına RNA dizileme deneylerini yürütmede ve verileri Galaxy platformunu kullanarak analiz etmede yardımcı olur. Biyobiyoinformatik eğitimi olmayanların karmaşık dizileme verilerini etkili bir şekilde yorumlamasını sağlar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Genomik
- Biyoinformatik
Arka Plan
- RNA-Seq, gen ekspresyonunu analiz etmek için güçlü bir araçtır.
- Galaxy, veri analizi için erişilebilir bir platform sağlar.
- Diferansiyel gen ekspresyonu analizi, biyolojik süreçleri anlamak için kritik öneme sahiptir.
- C.elegans, genetik çalışmalar için bir model organizma olarak hizmet eder.
Çalışmanın Amacı
- C.elegans araştırmacılarının RNA-Seq verilerini analiz etmelerini sağlamak.
- Fenotiplerle ilgili transkriptomik imzalara ilişkin içgörüler sağlamak.
- Biyobiyoinformatik uzmanlığı gerektirmeden gen ekspresyonunu anlamak için kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- C.elegans örneklerinin RNA dizilenmesi.
- Galaxy platformu kullanılarak veri işleme.
- Farklı eksprese edilen genlerin tanımlanması.
- DAVID kullanılarak gen ontolojisi analizi.
Ana Sonuçlar
- Farklı eksprese edilen genlerin başarılı bir şekilde tanımlanması.
- Gen listeleriyle ilişkili gen ontolojisi terimlerine ilişkin içgörüler.
- Galaxy platformunun uzman olmayanlar için kullanılabilirliğinin gösterimi.
- Yöntemin diğer organizmalara potansiyel uygulaması.
Sonuçlar
- Protokol, araştırmacıların RNA-Seq verilerini etkili bir şekilde analiz etmelerini sağlar.
- Galaxy ve DAVID, biyolojik yorumlama için değerli araçlardır.
- Bu yaklaşım, çeşitli biyolojik bağlamlar için uyarlanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Accessible transcriptomic analysis platforms like Galaxy enable discovery teams to interrogate gene expression changes without requiring deep bioinformatics expertise, accelerating early-stage target validation and mechanistic de-risking. By streamlining RNA-Seq data processing and functional annotation, this workflow supports rapid hypothesis testing and portfolio triage in model systems such as C. elegans. The approach enhances reproducibility and scalability for both novice and experienced R&D teams handling small-scale transcriptomic studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rapid identification of differentially expressed genes linked to phenotypic changes.
- Supports functional annotation clustering to clarify biological pathways and mechanisms.
- Facilitates hypothesis-driven interrogation of gene function in disease-relevant models.
- Reduces reliance on specialized bioinformatics personnel for initial data analysis.
Screening & Assay Development
- Provides standardized workflows for RNA-Seq data quality control and alignment.
- Generates reproducible gene lists for downstream screening or validation assays.
- Ensures quantitative outputs suitable for comparative analysis across conditions.
- Prepares data for enrichment and gene ontology analysis to inform assay design.
Translational & Preclinical Research
- Aligns transcriptomic signatures with functional annotation to inform biomarker discovery.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation in model organisms.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on robust gene expression data.
- Facilitates cross-study comparisons by leveraging standardized analysis pipelines.
Pipeline & Workflow Integration
This workflow positions RNA-Seq analysis from raw data through differential expression and functional annotation within the early discovery to preclinical continuum, supporting both target validation and mechanistic studies.
- Discovery Biology: Empowers teams to test hypotheses and clarify gene function using accessible transcriptomic data analysis.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative gene expression outputs for reliable condition comparison.
- Analytics: Integrates statistical thresholds (e.g., p-value cutoffs) and enrichment scores for robust data interpretation.
- Translational Research: Connects gene expression changes to biological processes relevant for preclinical models.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, user-friendly pipeline adaptable to various organisms and experimental contexts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in early-stage research.
- Operational Value: Standardizes RNA-Seq analysis, improving reproducibility and reducing training barriers.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions and enhances capital efficiency by democratizing data analysis.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery-stage assets.
Implementation Considerations
- Requires basic familiarity with the Galaxy user interface and workflow modules.
- Needs access to computational infrastructure for data upload and processing.
- Demands attention to file formats, parameter settings, and quality control steps.
- Adaptable to other organisms with available reference genomes and annotation files.
- Dependent on accurate statistical analysis and functional annotation for actionable outputs.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
9:39
Conclusion
3:28
Data Analysis with Tuxedo Suite
0:56
Getting Started with Galaxy
6:19
Gene Ontology (GO) Term Analyses Using DAVID
7:56
Results: Transcriptome Dictated by the Transcription Elongation Factor TCER-1, that Extends Lifespan of Germline-less C. elegans
