Transcriptomik Analiz Kullanarak Düzensiz Onkojenik Transkripsiyon Faktörlerinin Yapı-fonksiyon İlişkilerinin Eşlenmesini

Tekrarlayan ve düzensiz transkripsiyon faktörleri üzerinde yapı fonksiyon analizi yapmak zordur. Transkriptomikleri doğru hücresel bağlamla birleştirerek, bu yaklaşım önemli yapı fonksiyon ilişkilerini daha iyi ortaya çıkarır. RNA diziliminin işlevsel bir çıktı olarak kullanılması, tek bir deneyde tek bir protein tarafından düzenlenen tüm genlerin etkili bir şekilde değerlendirilmesine olanak tanıyarak kısmi fonksiyon tespitini daha olası hale getirir.

Kısmi fonksiyon tespiti, onkojenik füzyon transkripsiyon faktörleri için özellikle önemlidir, çünkü bu proteinlerin nasıl çalıştığını bilmiyoruz ve dizilimleri füzyon güdümlü kanserlerde daha iyi tedavilere yol açabilir. Her ne kadar EWS/FLI'daki düzensiz EWS alanına odaklanacak olsak da, EWS, kötü tanımlanmış işlevlere sahip bozukluk alanlarını içeren diğer füzyonlarda yer almaktadır. Bir cDNA ekspresyon yapısı transdüksiyonu için, önce donmuş virüsü cDNA yapılarıyla 37 santigrat derece su banyosunda hızlı bir şekilde çözün ve her bir aşağılık polibrene mililitre başına sekiz miligram 2.5 mikrolitre yavaşça karıştırın.

Daha sonra, ortamı, flakon yapısı başına% 50 ila% 70 birleşen 10 santimetrelik bir hücre kültürü plakasından çıkarın ve plakanın yan tarafındaki iki mililitrelik yapı hacminin tamamını yavaşça atlayın. Virüsü hücrelere eşit şekilde yaymak için plakayı sallayın ve plakayı iki saat boyunca 37 santigrat derece doku kültürü inkübatörüne yerleştirin, plakanın herhangi bir alanının kurumasını önlemek için plakayı her 30 dakikada bir sallayın. Kuluçka süresinin sonunda, fetal sığır serumu, antibiyotikler, sodyum piruvat ve polibren ile takviye edilmiş beş mililitre ortam ekleyin.

Hücre kültürü inkübatöründe gece boyunca inkübasyondan sonra, süpernatanı seçim ortamı ile değiştirin ve hücreleri, seçim ve cDNA yapı ekspresyonuna izin vermek için yedi ila 10 gün daha hücre kültürü inkübatörüne geri koyun. Seçim periyodunun sonunda, hücreleri sayım için 15 mililitrelik konik bir tüpe toplayın ve beş ila 10 kez beşinci hücrelere RNA dizilimi için yeni bir tüpe ve iki kez 10 ila altı hücreye ayırın. protein ekstraksiyonu için başka bir yeni tüpe. Hücreleri santrifüjleme ile çökeltin ve peletleri bir mililitre soğuk PBS'de veya beş dakikalık bir santrifüjlemede yeniden süspanse edin.

Daha sonra hem peletleri hem de sıvı nitrojeni hızlı dondurun ve hücreleri eksi 80 santigrat derecede saklayın. İlgilenilen proteinlerin yıkılmasını ve yapı panelinin ekspresyonunu doğrulamak için, protein lizat örneklerini standart Western blot analiz protokollerine göre uygun birincil ve ikincil antikorlarla kurulayın. RNA kalitesini ve miktarını değerlendirmek için, RNA dizileme hücresi örneklerini lys etmek için silika spin sütunu bazlı bir ekstraksiyon kitinden lizis tamponunu kullanın ve lizatları 30 ila 60 saniye boyunca dakikada 13.000 devirden daha büyük bir genomik DNA çıkarma kolonuna uygulayın.

Ardından, silika spin kolonu saflaştırmasına devam edin ve kolon üzerindeki RNA'yı kit talimatlarına göre yıkayın. Daha sonra RNA'yı 30 mikrolitre elüsyon tamponunda elüte edin ve RNA miktarını ve numune kalitesini değerlendirmek için 260 ila 280 nanometre oranında bir spektrofotometrede en az 2,5 mikrogram RNA'yı analiz edin. Fastq dosya analizi için, terminali yüksek performanslı bilgi işlem ortamına açmak ve proje adlı bir analiz dizini oluşturmak için Putty'yi kullanın.

Proje dizininin yoluna gidin ve sıkıştırılmış ham fastq. gz dosyaları için fastq adlı bir dizin ve kırpılmış adlı ikinci bir dizin oluşturun. Sıkıştırılmış ham fastq'u aktarmak için uygun bir güvenli dosya aktarım programıdır.

gz dosyalarını yerel depolamadan Project FastQ dizinine gidin ve her örnek için bir R1 ve bir R2 dosyası olup olmadığını kontrol edin. Fastq projesine giden yola gidin ve fastq'dan düşük kaliteli okumaları kırpmak için belirtildiği gibi trim bolluğunda komutu kullanın. GZ dosyaları.

Proje dizinine giden yola gidin ve STAR output adlı yeni bir dizin oluşturun. Proje kırpma dizinine giden yola gidin ve kırpılan fastq'yu hizalamak için STAR'ı çalıştırmak için belirtildiği gibi komutu kullanın. GZ dosyaları.

Belirtilen konumdaki transkript başına sayıları içeren sonraki adımlar için gerekli çıktıyı bulun ve gen çıkışı sekme dosyası başına her okumada okumak için komutu kullanın. İlk sütun için, aşağı akış işlemeyi kolaylaştırmak için yalnızca ENSEMBL gen kimliği sütunundaki noktadan önceki karakterleri kullanın. Ardından, tüm örneklerin sayılarını totcts adlı veri çerçevesine derlemek için komutu kullanın ve bu yeni ham sayım verileri tablosunu sekmeyle ayrılmış bir metin dosyası olarak kaydedin.

DESeq2 kullanarak her yapı için diferansiyel ifade profilini tanımlamak için, deneysel DESeq2 tasarımını girin ve boyut faktörlerini tahmin etmek ve DESeq2'yi çalıştırmak için bir DESeq veri seti oluşturmak üzere matris işlevinden DESeq veri kümesini kullanın. Analizin kalitesini değerlendirmek için, düzenli günlük normalleştirme sayılarını çıkarmak için DESeq2'yi kullanın. DESeq2 sonuçlarından her bir transkripsiyonel profil için sonuçları çıkarırken, devrilme durumuna veya taban çizgisi boş vektörüne atıfta bulunarak ikili karşılaştırmalar yapın.

Bu sonuçları HGNC gen sembolleri ile daha fazla değiştirin ve DESeq2 verilerinden verileri, ENSEMBL gen kimliği, HGNC sembolü, baseMean ifadesi ve log iki kat değişim ve ham ve düzeltilmiş P değerleri ile tüm yapılar için bir diferansiyel ifade verisi ile tek bir dosya olarak çıkarın. Başarılı toplu iş normalleştirmesini ve ilgi alanı örneği benzerliğini değerlendirin ve kodu, temel bileşenler analizi ve örneklemden örneğe uzaklık grafikleriyle örnek kümelemeyi kontrol etmek için düzenli günlük normalleştirilmiş sayımlarını kullanmak için kullanın. En değişken 1.000 geni bir matrise çıkarmak için düzenli günlük normalleştirilmiş sayımları kullanın ve bu genlere dayalı olarak örneklerin denetimsiz hiyerarşik kümelemesini gerçekleştirmek için bir ısı haritası kullanın.

Dendrogramdan ilgilenilen kümeleri çıkarmak için, dendrogram ilgi kümelerinin hangi düzeyinde göründüğüne karar verin ve K'yi bu düzeydeki küme sayısına eşit olarak ayarlayın. Hangi kümelerin ilgi çekici olduğunu belirlemek için, küme tarafından sıralanan ısı haritasını yeniden çizin ve her kümeyle ilişkili genlerin listesini bir tabloya aktarın, ardından tanımlanan ve sınıflar arasında karşılaştırılan farklı gen kümelerinin biyolojik rollerini belirlemek için uygun bir biyoinformatik araç kullanın. Bu temsili analizde, pozitif ve negatif yapılarla etkili bir yıkım ve kurtarma gözlemlenebilir.

DAF'tan kurtarılan hücrelerin koloni oluşturamadığını, bu da onkojenik dönüşümün bozulduğunu düşündürür. Replikant doğrulamasının tamamlanmasının ardından, toplu normalizasyon ve analiz için tüm numuneler için fenotipik tahliller ve ilk RNA dizileme veri işleme gen sayıları elde edilebilir. Parti normalizasyonu olmadan DESeq2, muhtemelen hücrelerin kültürdeki geçişinden kaynaklanan biyolojik değişkenlik ve her partinin işlenmesindeki farklılıklar nedeniyle kafa karıştırıcı parti kusurlarına neden olabilir.

Toplu normalleştirmenin ardından DESeq2, taban çizgisine göre ilgilenilen yapılar için transkripsiyonel profiller oluşturmak için kullanılabilir. Bu veriler için temel bileşen analizi, DAF'ın transkripsiyonel profilinin vahşi tip EWS/FLI ve Delta 22 arasında ara olduğunu ve kısmi işlevi doğruladığını göstermektedir. Ayrıca, örnekler arasında en değişken 1.000 genin hiyerarşik kümelenmesi, DAF'ın EWS / FLI hedef genlerini baskılamakta başarısız olduğunu ve gen aktivasyon aktivitesini yalnızca kısmen koruduğunu göstermektedir.

En iyi gen analizi, DAF'ın aktive ettiği gen sınıflarının, DAF'ın işlevsel olmadığı EWS/FLI ile aktive edilen hedeflerden işlevsel olarak farklı olduğunu göstermektedir. İlginç bir şekilde, DAF en çok GGAA mikrosatellit aktive edilmiş genleri kurtarabilir, ancak yüksek afiniteli bir bölgenin yakınında aktive olmuş genleri kurtaramaz. Transkriptomik çıktının ilgili fenotipik tahlillerle eşleştirilmesi, yapı fonksiyon analizini tamamlar.

Araştırmacılar, farklı transkripsiyonel fonksiyonların mekanik sürücülerini incelemek için başka teknikler de kullanabilirler.