Bir Yetişkin Sıçan Kalpten Yüksek Kalitede Kardiyomiyosit, Endotel Hücresi ve Fibroblastların Eşzamanlı İzolasyonu

Bir fare kalpten farklı kardiyak hücre tiplerinin izolasyonu için çeşitli protokoller geliştirilmiş ve açıklanmıştır. Burada, yüksek kaliteli ana kardiyak hücre tiplerinin (kardiyomiyosit, endotel hücreleri ve fibroblastların) tek bir preparasyondan izole edilmesini sağlayan deneysel maliyetleri düşüren optimize edilmiş bir protokol tarif edilmiştir.

Bu prosedürün genel amacı, bireysel in vitro analizleri için sıçan kalbinden canlı kardiyomiyositleri, endotel hücrelerini ve fibroblastları aynı anda izole etmektir. Bu yöntem, kardiyovasküler alanda kardiyak hipertrofi, iskemi, reperfüzyon hasarı, endotel fonksiyonu ve kardiyak fibrozda rol oynayan sinyal mekanizmaları hakkındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, tüm ana kalp hücrelerinin aynı anda izole edilebilmesi ve potansiyel olarak ilişkili araştırma maliyetlerini ve deneysel hayvan sayılarını azaltmasıdır.

Bir damıtılmış su ve bir 50 mililitre Powell medium yıkamadan sonra, ortamı 80 mililitre taze Powell ortamı ile değiştirin ve ortamı sürekli olarak karbojen ile perfüze etmek için cam silindirden bir cam Pasteur pipeti kullanın. Daha sonra, aort yoluyla yeni hasat edilmiş bir sıçan kalbini Langendorff perfüzyon sistemine monte etmek için iki çift ince kavisli forseps kullanın ve perfüzyon sistemi kanülünün ucunu ilk aort dalı ile aort kapağı arasına yerleştirin. Aortu bir timsah kelepçesi ile sabitleyin.

Kanülün kapağını açın ve ardından kalbi cerrahi bir dikişle sabitleyin. Perfüzyon ortamının 35 mililitresinin kalp damlasından geçmesine izin verin ve kalan kanı çıkarın. Toplama hunisini kalbin altına yerleştirin ve perfüzyon ortamını toplama hunisinden rezervuara yeniden dolaştırmak için peristaltik pompayı çalıştırın.

Perfüzyon ortamına kollajenaz solüsyonu ekleyin ve kalbi devridaim kollajenaz solüsyonu ile 30 dakika boyunca perfüze edin. Sindirimin sonunda, kalbi Langendorff sisteminden çıkarmak için makas kullanın ve bir cam Petri kabına yerleştirin. Şimdi hem kulakçıkları hem de kalan yağ dokusunu kalpten çıkarın.

Epitel hücre kontaminasyonunu önlemek için, perikardları dikkatlice soymak için iki forseps kullanın. Kalbi ortadan kesin ve yarımları doku doğrayıcıya yerleştirin. Kalbi iki ila üç kez kıyın ve doku parçalarını Langendorff perfüzyonundan 12 mililitre sindirim tamponu içeren 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın.

Doku parçalarını bir su banyosunda beş ila 10 dakika sindirin, ara sıra beş mililitrelik tek kullanımlık plastik pipetle karıştırın. Daha sonra hücre süspansiyonunu 100 mikrometrelik bir elekten geçirerek 50 mililitrelik konik bir tüpe süzün. Perfüzyon sistemini en az bir litre damıtılmış su ve ardından 100 mililitre 0.1 normal sodyum hidroksit ile 30 dakika boyunca yıkayın, ardından sistemi iki ila üç litre damıtılmış su ile yıkayın ve cihazı yıkanmış hava ile kurulayın.

Filtrelenmiş hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve endotel hücresini ve süpernatan içeren fibroblastı 50 mililitrelik yeni bir tüpe dikkatlice aktarmak için tek kullanımlık bir pipet kullanın. Peletleri altı mililitre kalsiyum çözeltisi içinde yeniden süspanse edin. Bir dakika sonra, hücreleri ikinci bir santrifüjleme ile toplayın ve peleti altı mililitre kalsiyum çözeltisi ikide yeniden süspanse edin.

Bir dakika sonra, hücre süspansiyonunu 12 mililitre kalsiyum çözeltisi üç ilavesiyle seyreltin ve hafifçe eğerek iyice karıştırın. Başka bir santrifüjlemeden sonra, peleti 20 mililitre önceden ısıtılmış CCT ortamında yeniden süspanse edin. Daha sonra, laminin ile önceden kaplanmış 20 steril 35 milimetre hücre kültürü kabının her birine bir mililitre hücre ayırın ve hücreleri karbondioksit içermeyen bir hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin, ortamı iki mililitre taze CCT ortamı ile değiştirin iki saat sonra ölü hücreleri çıkarmak için.

Şimdi endotel hücresini ve süpernatan içeren fibroblastı santrifüjleyin ve peleti 1.5 mililitre endotel hücre izolasyon tamponunda yeniden süspanse edin. Hücreleri iki mililitrelik bir numune tüpüne aktarın ve uçtan uca rotasyonla dört santigrat derecede 30 dakikalık bir inkübasyon için hücrelere fare anti-sıçan CD31 antikoru ekleyin. Kuluçka işleminin sonunda, uçtan uca rotasyonla dört santigrat derecede inkübasyonda 20 için Pan anti-fare IGG boncukları ekleyin.

Boncuk inkübasyonunun sonunda, hücreleri iki dakika boyunca manyetik bir rafa yerleştirin ve çoğunlukla fibroblast içeren süpernatanı dikkatlice çıkarmak için bir mililitrelik bir pipet kullanın. 10 mililitre fibroblast hücre kültürü ortamı içeren 10 santimetrelik bir kültür kabındaki fibroblastları görün ve hücreleri bir saat boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte bir hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. Daha sonra, endotel hücrelerinin tüpüne bir mililitre yıkama tamponu ekleyin ve tüpü kapatın.

Boncukları yeniden askıya almak için hücreleri dört ila beş kez hafifçe sallayın. Ardından tüpü mıknatısa geri koyun ve bir dakika sonra yıkama tamponunu çıkarın. Son yıkamadan sonra, yıkama tamponunu bir mililitre MV2 endotel hücre kültürü ortamı ile değiştirin ve endotel hücrelerini, hücre kültürü inkübatöründeki gece kültürleri için 12 oyuklu bir plakanın tek bir kuyucuğuna tohumlayın.

Fibroblast inkübasyonunun sonunda, bağlı hücreleri iki ila üç kez uygun miktarda önceden ısıtılmış PBS ile yıkayın. Daha sonra, hücrelere önceden ısıtılmış taze fibroblast hücre kültürü ortamı ekleyin ve fibroblastları hücre kültürü inkübatörüne geri koyun. Ertesi sabah, endotel hücre kültüründeki süpernatanı taze endotel hücre kültürü ortamı ile değiştirin ve hücreleri, yarı birleşene kadar her iki ila üç günde bir ortamı değiştirerek inkübatöre geri koyun.

Daha sonra, bağlı fibroblast hücrelerinin kültürünü, gösterildiği gibi önceden ısıtılmış taze PBS ile yıkayın ve hücreleri önceden ısıtılmış taze ortamla besleyin. Kardiyomiyosit izolasyon prosedürü, %70 ila 80 oranında saf, canlı, çubuk şeklinde, çizgili bir kardiyak hücre popülasyonu sağlar. Kardiyomiyositlerde iskemi repurfüzyonuna yanıt olarak fura ile yüklü izole kardiyomiyositlerin hücre içi kalsiyum salınım analizi daha sonra yapılabilir ve ayrıca ATP ilavesinden sonra manyetik boncuk izole endotel hücrelerinde ve fibroblastlarda kalsiyum sinyallemesindeki değişikliklerin analizi yapılabilir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde uygulanırsa üç saat içinde tamamlanabilir. Bu işlemi denerken, bu perfüzyon sistemini düzgün bir şekilde kurmayı unutmamak ve kalbi hazır olur olmaz derhal sisteme sabitlemek önemlidir. Geliştirildikten sonra, bu teknik, kardiyovasküler araştırma alanındaki araştırmacıların farklı kardiyovasküler patofizyolojilerde yer alan sinyalleri keşfetmelerinin yolunu açtı.

Bu videoyu izledikten sonra, kardiyak hücre izolasyonu ve kültürünün temel ilkelerini iyi anlamış olmalısınız. Cerrahi aletler ve hücre kültürü reaktifleri ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken aletlerin dikkatli kullanımı ve eldiven kullanımı gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.