Name: Dinamik Hücresel Protrüzyonlarda Protein Konsantrasyonunun Yazılım Destekli Takibi için Grafiksel Bir Kullanıcı Arayüzü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Öğrenin filopodial çıkıntılarda protein dinamiklerini yarı otomatik görüntü analizi yazılımı ile analiz etmeyi. Bu yöntem, uzamsal çözünürlüklü protein konsantrasyonunu ve çıkıntı dinamiklerini eş zamanlı nicelendirir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, DFG&#39;den (MG için EXC-1003) finansman sağlamışlardır.

1. Hücre Kültürü <ol><li> 4.5 g / L D-glükoz, L-alanin-L-glutamin dipeptid, piruvat,% 10 sığır fetüsü serumu ve 10 ünite / ml penisilin / streptomisin içeren Dulbecco&#39;nun Değiştirilmiş Kartal Ortamında (DMEM) Kültür HeLa veya COS hücreleri. 0.5 mM L-alanin-L-glutamin dipeptid, serumsuz nöronal takviyeleri ve 10 ünite / ml penisilin / streptomis ile takviye edilmiş L-glutamin, glutamik asit veya aspartik asit içermeyen kültür ortamındaki kültür nöronları. </li><li> % 40 confluency ulaşıldığında, üreticinin talimatlarına göre bir transfeksiyon reaktifi kullanarak seçim yapıları ile transfekte hücreleri. 37 ° C&#39;de inkübe edilen transfekte hücreleri tutun ve 15-18 saat boyunca% 5 CO 2 . </li><li> Görüntü alımı sırasında pH ve ozmolarite (buharlaşma nedeniyle) değişiklikleri azaltmak için, hücre kültürü odalarını (görüntülemeye başlamadan önce)% 90&#39;a kadar, 20 mM 4- (2-hidroksietil) -1 içeren 37 ° C önceden ısıtılmış ortam ile doldurun -piperazinetansülfonik asit (HEPES). MühürlemekKapak, vakum gres ince bir tabaka içinde kapağın iç uygulayın ve yavaşça transfekte hücreleri içeren kültür odası üzerine bastırın. </li></ol> 2. Görüntü Edinimi NOT: Filopodiya uzunluğu 2-10 μm3 arasında değişir 13 . Filopodia ortalama hız 0.05-0.1 μm / sn&#39;de büyür 13 , 14 . <ol><li> 60X veya 100X objektif ve hiçbir piksel binning (burada bir dönen disk konfokal mikroskop) ile bir mikroskop kullanılarak görüntü elde edin. Filopodial dinamikleri izlemek için 1 Hertz&#39;den (Hz) büyük edinim hızları kullanın. Odak dışı nesneleri en aza indirgemek için görüntü filopodisi bazal membrana ( yani substrat yüzeyi) yakındır. </li><li> Düzgün izlemeyi sağlamak için kameranın maruz kalma zamanını ve lazer yoğunluğunu, sinyal / gürültü oranı (SNR) 4&#39;ten büyük olacak şekilde ayarlayın. Bireysel kanalların doygunluğundan kaçının ( örn .255 8-bit görüntüler için 65.535 16-bit görüntüler için), daha sonraki görüntü analizini engelleyecektir. </li><li> Kanamayı önlemek için, lazer çizgileri ve mikroskop filtreleri ile uyumlu floresan etiketleri kullanın (ayrıntılar için bkz. Referans 15 ). </li></ol> 3. Görüntü Ön işleme NOT: Görüntüleri önceden işleme koymak için ImageJ veya diğer mevcut yazılımı kullanın 16 , 17 . <ol><li> Örnek hareket ediyorsa, analiz öncesinde mevcut yazılımları kullanarak yanal sürüklenmeyi düzeltin ( örn. Https://github.com/NMSchneider/fixTranslation-Macro_for_ImageJ). Filmleri eksenel sürüklenme (yani, z-yönünde hareket) ile hariç tutun. </li><li> Doğru arka plan ( yani hücrenin dışındaki alanların gri değerleri), ağartma ( yani , flüoresans proteinlerine hasar vermesi nedeniyle floresan yoğunluğu varsa sürekli kaybı) ve olası kanama yalakı ( yani , bir gribten gelen sinyal(Örn. Http://imagej.net/Category:Plugins ve 16 , 17 ) kullanarak). Not: Münferit kanalların floresan yoğunluğu yazılım tarafından değiştirilmez. </li><li> Sonraki görüntü analizini sağlamak için, belirli protein kanallarına karşılık gelen filmleri, gri tonlamalı olarak &#39;.tiff&#39; yığınlı dosya formatı olarak çalışma klasörüne kaydedin. NOT: İstiflerin boyutları (boyut, uzunluk) tüm kanallar için aynı olmalıdır. </li></ol> 4. Görüntü Analizi - Adım 1: Resim Yükleme NOT: Burada açıklanan yazılım Matlab&#39;da (programlama yazılımı olarak anılır) yazılmıştır ve yalnızca bu program ile çalışır. <ol><li> Görüntü analizleri için gerekli tüm dosyaları içeren sıkıştırılmış klasörü aşağıdaki siteden indirin: https://campus.uni-muenster.de/en/einrichtungen/impb0/nanoscale-forces-in-cells/softwdır-dir/. Dosyaları iş klasörüne sıkıştırın ve kopyalayın. </li><li> Kurulduktan sonra programlama yazılımını açın ve &#39;filopodiaAnalysisM3.fig&#39; dosyasını çalıştırın. GUI Penceresi # 1 Şekil 2A&#39;da gösterildiği gibi açılacaktır. </li><li> Belirli bir proteine ​​karşılık gelen kaydedilmiş yığınlanmış &#39;.tiff&#39; dosyalarını, protein C için &lt;1b&gt; protein B, &lt;1c&gt;, protein C için &lt;1d&gt; düğmelerini kullanarak GUI Pencere # 1&#39;e yükleyin. Bkz. Şekil 2 ve Tablo 1 ayrıntıları için. NOT: GUI Penceresi # 1&#39;de gösterilen Protein A, nihai rasyonel analiz için referans kanalı görevi görür. </li><li> &lt;1a&gt; &#39;yı tıklayarak protein kanallarından hücre üst üste imajı oluşturun. </li><li> İlk kareyi atamak için &lt;2a&gt;, analiz için kullanılan son kareye &lt;2b&gt; tıklayın. </li><li> İsteğe bağlı olarak, &lt;2h&gt; düğmesini kullanarak ilgilenilen filopodiumu içeren ilgi alanını (ROI) kırpın, resmi döndürünüz u&lt;2i&gt; deyin veya serbest el çizim aracını &lt;2j&gt; kullanarak istenmeyen bölgeleri silin. NOT: Görüntü analizini kolaylaştırmak için ImageJ kullanarak ROI&#39;yı (diğer bir deyişle kırpma, döndürme, silme) diğer ön işleme adımlarıyla (arka plan çıkarımı, çamaşır suyu düzeltmeleri vb.) Ayırmanız önerilir. </li><li> Kalite kontrolü için her çerçeve için kaydırıcıyı hareket ettirin ve filmin tamamında filopodyumun açıkça görülebileceğini kontrol edin. </li></ol> 5. Görüntü Analizi - Adım 2: İz Yaratın <ol><li> GUI Pencere # 2&#39;yi açmak için GUI Pencere # 1&#39;deki &lt;3a&gt; düğmesine tıklayın ( Şekil 2B&#39;ye bakın). </li><li> Üst üste yerleştirilen hücre gövdesinin maskesini oluşturmak için GUI Penceresi # 2&#39;deki &lt;4&gt; düğmesine tıklayın (&lt;1a&gt; &#39;yi tıkladıktan sonra GUI Penceresi # 1&#39;de oluşturulur). Program aynı zamanda vertex noktalarını elde etmek için konveks gövde uygulandığı maskenin sınırını oluşturur. </li><li> cliCk düğmesi &lt;5&gt;; Bir imleç belirecektir. İmleci (filopodial ucu mesafesinin ölçülmekte olduğu) tabanı ve ardından ilk göründüğü çerçevedeki filopodinin ucunu seçmek için imleci kullanın. Bunu yapmak için kaydırıcıyı Pencere # 2&#39;de hareket ettirin). NOT: Veri çıkışındaki hataları en aza indirgemek için, taban noktasını eksene göre filopodial ucun altına dikey olarak yerleştirin. Taban noktasının başka yerlere yerleştirilmesi ( örneğin yanal olarak kaydırılmış olması), hücre gövdesi içerisindeki floresans değerlerinde yönsel bir önyargı ortaya çıkarabilir. </li><li> &lt;6c&gt; &#39;yi kullanarak eşik uzunluğunu (filopodinin üzerinde bükülecek) seçin. Not: Bu uzunluk, taban noktası (&lt;5&gt; kullanılarak seçilen) ile hücre gövdesinin sınırı (filopodinin büyümeye başladığı bölge) arasındaki uzaklık olarak tanımlanır. Mesafe piksel olarak ölçülür. </li><li> &lt;6a&gt; kutusunda filopodiya şekline yaklaşmak için kullanılan kesim sayısını belirtin. NOT: mEn az sayıda bölüm, filopodyum tarafından ulaşılan maksimum uzunluğa, ayrıca filopodyumun nasıl bükülmesine bağlıdır. Taban ve ucu arasındaki piksel sayısından daha büyük sayıda segment ( örn . Eşik uzunluğu) seçmeyin. Adım 5.4&#39;te tanımlanan eşik uzunluğundan daha fazla segment seçme. ( Yani taban ve uç arasındaki piksel sayısı) filopodyumun uzunluğunun bir tahmini ile sonuçlanacaktır. </li><li> Düğümleri yerleştirmek için yatay tarayıcı görevi gören tarama genişliğini &lt;6b&gt; olarak belirtin. NOT: Bu düğümler, program tarafından, filopodyumun gövdesi ile taban ve ucu birleştiren çizginin ( yani omurgasını oluşturmak için) sığdırılması için kullanılır. Bir başlangıç ​​noktası olarak, maksimum uzunluğa bir faktör ile çarpılmış piksele bir değer koyun <img alt="Denklem" src="/files/ftp_upload/55653/55653eq1.jpg" /> . </li><li> &lt;6d&gt; kutusunda tarama yarıçapını (piksel cinsinden) belirtin. Ob&#39;dan yaklaşık% 50 daha büyük bir değer kullanınÇerçeveler arası uç yer değiştirmesini sağladı. NOT: Çok büyük bir tarama yarıçapı kullanmak, gerçek filopodial ucu bulunmayan çerçevelerde istenmeyen konveks gövde noktalarını yakalayabilir ( örneğin düzlem dışı hareket veya düşük SNR). </li><li> Kutu &lt;6e&gt; &#39;de eğme açısını belirtin. NOT: Açı eşiği, bütün analiz sırasında filopodyumun bükülmüş maksimum açısı ile belirlenir. Açı eşiğini belirtmek, filopodiya hücre gövdesine doğru eğildiğinde yazılımın filopodiya yanından büyüyen istenmeyen yapıların izlemesini hariç tutmasına yardımcı olur. Program dikey eksenden 45 dereceden daha az eğilme açısı ile filopodiya için güvenilir şekilde çalışır. </li><li> İzlemeye başlamak için GUI Penceresi # 2&#39;deki &lt;Track &amp; Analyze&gt; düğmesini tıklayın. Gelecekteki referans için tüm izleme protokolünü kaydetmek için GUI Penceresi # 2&#39;deki &#39;Geçmiş izlemesi&#39; kutusunu tıklayın. NOT: İzleme işlemi tamamlandıktan sonra, her karedeki filopodyumun uzunluğu,Gelecekteki başvurular için &#39;dynamics.xlsx&#39; dosyasının &#39;length_vel&#39; adlı sayfası. Aynı şekilde, diğer tüm izleme parametreleri &#39;dynamics.xlsx&#39; parametrelerinde saklanır. </li><li> İsteğe bağlı olarak, filopodiya tüm karelerde otomatik olarak algılanmazsa, elle düzeltmek için aşağıdaki adımları kullanın. <ol><li> Pencere # 2&#39;deki kaydırıcıyı kullanarak ilgili çerçeveyi ziyaret edin ve elle filopodyumun ucunu seçin. Not: Dışbükey gövde noktalarının bulunmadığı çerçeveler, GUI Penceresi # 2&#39;nin izleme penceresinde mavi bir bölge ile temsil edilecektir. Bu çerçeve içindeki düğüm koordinatlarına erişmek için izleme programı başlatılmadan önce &#39;Geçmiş izi&#39; düğmesini kontrol etmek zorunludur. </li><li> GUI Penceresi # 2&#39;de &lt;6f&gt; kullanarak referans noktalarını (taban ve ipucu) seçin. &#39;Tarama uzunluğu&#39;, &#39;Sonradan Hassas Ölüm&#39; ve &#39;maksimum eğme açısı&#39; gibi diğer parametreleri belirtin; 5.4-5.8 adımlarında açıklandığı gibi bu çerçeve için. </li><li> Yeni parametreleri kaydetmek için &lt;6i&gt; düğmesine tıklayın (bir kareye özgü). Adımlar mavi bölgenin gösterdiği tüm kareler için tekrarlanmalıdır. </li><li> İşiniz bittiğinde, &lt;7&gt; tuşunu kullanarak izleme prosedürünü yeniden başlatın. NOT: Bu düzeltme, program bir filmdeki bir filopodialden aniden geçiş yaparsa da kullanılabilir. Alternatif olarak, birden fazla filopodiyi içeren filmleri kırpmayı düşünün. </li></ol></li></ol> 6. Görüntü Analizi - 3. Adım: Spatio-temporal Protein Analizi <ol><li> Uzay-zaman analizi için, &lt;8b&gt; ile temsil edilen kutuyu ve ardından ilgili protein kanalı (&lt;8c&gt; ve / veya &lt;8d&gt; ve / veya &lt;8e&gt;) seçin. Not: Protein A referans olarak kullanıldığından, rasatometrik analizden (&lt;9a&gt;, &lt;9b&gt; ve / veya &lt;9c&gt;) önce Protein A seçilmesi zorunludur. </li><li> &lt;8a&gt; &#39;yı tıklayın5.9. Adımda üretilen izi kullanarak filopodial uzunluk boyunca protein izlemeyi başlatmak için. </li></ol> 7. Görüntü Analizi - 4. Adım: Oran-metrik Protein Analizi <ol><li> Uzay-zamansal oranlamalı grafiği elde etmek için &lt;9b&gt; veya &lt;9c&gt; onay kutusunu işaretleyin ve &lt;9a&gt; düğmesine tıklayın. NOT: Göreceli protein konsantrasyonunun yanlış gösterilmesini önlemek için, ratiyometrik görüntü X / Y olarak değil, log (X / Y) olarak çizilmemektedir. İleride kullanılması için, ratiyometrik grafiğe &#39;.png&#39; ve &#39;.fig&#39; format dosyaları verilir ve gebelik verisi &#39;dynamics.xlsx&#39; dosyası içinde saklanır. </li></ol> 8. Görüntü Analizi - Adım 5: Filopodial İpucu Analizi <ol><li> &lt;8f&gt; onay kutusunu işaretleyin ve ucu uzunluğunu ve eşik uzunluğunu &lt;8g&gt; ve &lt;8h&gt; kullanarak tabandan belirleyin. Verileri &#39;dynamics.xlsx&#39; dosyasına kaydetmek için &lt;basma düğmesine&gt; tıklayın. &lt;Protein yoğunluklarını analiz&gt; seçeneğini tıklayarakFilopodial ucun protein yoğunluklarının izini sürmek ve rasatiyometrik analiz için tasarruf sağlamaktır. NOT: İpucu uzunluğu, analiz için kullanılan uçtaki piksel sayısını belirler. Yazılım, her çerçevedeki uçtaki piksellerin ortalama yoğunluk değerini döndürür. Eşik uzunluğu, filopodyumun (filopodial ucu) büyümeye başladığı (ve program ucun yoğunluk değerini izlemeye başladığında) tabandan uca minimum mesafeyi belirler. Bu nedenle uç uzunluğu eşik uzunluğundan daha küçük olmalıdır. </li><li> &lt;9d&gt; veya &lt;9e&gt; kullanılarak analiz edilecek arzulanan oranı tıklayın. </li><li> Orantılı verileri oluşturmak için karşılaştırma düğmesini &lt;9a&gt; tıklayın. </li></ol>

<ol><li>Dunaevsky, A., Tashiro, A., Majewska, A., Mason, C., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+regulation+of+spine+motility+in+the+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Developmental regulation of spine motility in the mammalian central nervous system.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (23), 13438-13443 (1999).</li>
<li>Matus, A., Brinkhaus, H., Wagner, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+dynamics+in+dendritic+spines%3A+a+form+of+regulated+plasticity+at+excitatory+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Actin dynamics in dendritic spines: a form of regulated plasticity at excitatory synapses.</a> Hippocampus. 10 (5), 555-560 (2000).</li>
<li>Galic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+recruitment+of+the+curvature-sensitive+protein+ArhGAP44+to+nanoscale+membrane+deformations+limits+exploratory+filopodia+initiation+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Dynamic recruitment of the curvature-sensitive protein ArhGAP44 to nanoscale membrane deformations limits exploratory filopodia initiation in neurons.</a> Elife. 3, e03116(2014).</li>
<li>Hotulainen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+mechanisms+of+actin+polymerization+and+depolymerization+during+dendritic+spine+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Defining mechanisms of actin polymerization and depolymerization during dendritic spine morphogenesis.</a> J Cell Biol. 185 (2), 323-339 (2009).</li>
<li>Leijnse, N., Oddershede, L. B., Bendix, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helical+buckling+of+actin+inside+filopodia+generates+traction%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Helical buckling of actin inside filopodia generates traction.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (1), 136-141 (2015).</li>
<li>Tsygankov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellGeo%3A+a+computational+platform+for+the+analysis+of+shape+changes+in+cells+with+complex+geometries%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">CellGeo: a computational platform for the analysis of shape changes in cells with complex geometries.</a> J Cell Biol. 204 (3), 443-460 (2014).</li>
<li>Xiong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+characterization+of+cell+shape+changes+during+amoeboid+motility+by+skeletonization%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">Automated characterization of cell shape changes during amoeboid motility by skeletonization.</a> BMC Syst Biol. 4, 33(2010).</li>
<li>Styner, M., Gerig, G., Lieberman, J., Jones, D., Weinberger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+shape+analysis+of+neuroanatomical+structures+based+on+medial+models%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Image+Anal%22%5BJournal%5D)">Statistical shape analysis of neuroanatomical structures based on medial models.</a> Med Image Anal. 7 (3), 207-220 (2003).</li>
<li>Blum, H. A transformation for extracting new descriptors of shape. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBlum%2C+H+%22Models+for+the+Perception+of+Speech+and+Visual+Form%3A+Proceedings+of+a+Symposium%22">Models for the Perception of Speech and Visual Form: Proceedings of a Symposium</a>. Wathen-Dunn, W. , MIT Press. Cambridge, MA. 362-380 (1967).</li>
<li>Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open+source+software+for+quantification+of+cell+migration%2C+protrusions%2C+and+fluorescence+intensities%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities.</a> J Cell Biol. 209 (1), 163-180 (2015).</li>
<li>Machacek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+Rho+GTPase+activities+during+cell+protrusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Coordination of Rho GTPase activities during cell protrusion.</a> Nature. 461 (7260), 99-103 (2009).</li>
<li>Saha, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+analysis+of+filopodial+length+and+spatially+resolved+protein+concentration+via+adaptive+shape+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Automated analysis of filopodial length and spatially resolved protein concentration via adaptive shape tracking.</a> Mol Biol Cell. 27 (22), 3616-3626 (2016).</li>
<li>Argiro, V., Bunge, M. B., Johnson, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+study+of+growth+cone+filopodial+extension%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">A quantitative study of growth cone filopodial extension.</a> J Neurosci Res. 13 (1-2), 149-162 (1985).</li>
<li>Mogilner, A., Rubinstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+physics+of+filopodial+protrusion%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">The physics of filopodial protrusion.</a> Biophys J. 89 (2), 782-795 (2005).</li>
<li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 2 (12), 905-909 (2005).</li>
<li>Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="https://imagescience.org/meijering/publications/download/bio2004.pdf">Image Processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).</li>
<li>Courtney, J., Woods, E., Scholz, D., Hall, W. W., Gautier, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MATtrack%3A+A+MATLAB-Based+Quantitative+Image+Analysis+Platform+for+Investigating+Real-Time+Photo-Converted+Fluorescent+Signals+in+Live+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">MATtrack: A MATLAB-Based Quantitative Image Analysis Platform for Investigating Real-Time Photo-Converted Fluorescent Signals in Live Cells.</a> PLoS One. 10 (10), e0140209(2015).</li>
<li>Schell, M. J., Erneux, C., Irvine, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+1%2C4%2C5-trisphosphate+3-kinase+A+associates+with+F-actin+and+dendritic+spines+via+its+N+terminus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Inositol 1,4,5-trisphosphate 3-kinase A associates with F-actin and dendritic spines via its N terminus.</a> J Biol Chem. 276 (40), 37537-37546 (2001).</li>
<li>Korobova, F., Svitkina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+architecture+of+synaptic+actin+cytoskeleton+in+hippocampal+neurons+reveals+a+mechanism+of+dendritic+spine+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular architecture of synaptic actin cytoskeleton in hippocampal neurons reveals a mechanism of dendritic spine morphogenesis.</a> Mol Biol Cell. 21 (1), 165-176 (2010).</li>
<li>Cheadle, L., Biederer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+novel+synaptogenic+protein+Farp1+links+postsynaptic+cytoskeletal+dynamics+and+transsynaptic+organization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The novel synaptogenic protein Farp1 links postsynaptic cytoskeletal dynamics and transsynaptic organization.</a> J Cell Biol. 199 (6), 985-1001 (2012).</li>
<li>Tarnok, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+tool+for+the+quantitative+analysis+of+dendritic+filopodial+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">A new tool for the quantitative analysis of dendritic filopodial motility.</a> Cytometry A. 87 (1), 89-96 (2015).</li>
<li>Hendricusdottir, R., Bergmann, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((F-dynamics%3A+automated+quantification+of+dendrite+filopodia+dynamics+in+living+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">F-dynamics: automated quantification of dendrite filopodia dynamics in living neurons.</a> J Neurosci Methods. 236, 148-156 (2014).</li>
<li>Fanti, Z., Martinez-Perez, M. E., De-Miguel, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NeuronGrowth%2C+a+software+for+automatic+quantification+of+neurite+and+filopodial+dynamics+from+time-lapse+sequences+of+digital+images%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">NeuronGrowth, a software for automatic quantification of neurite and filopodial dynamics from time-lapse sequences of digital images.</a> Dev Neurobiol. 71 (10), 870-881 (2011).</li>
<li>Costantino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semi-automated+quantification+of+filopodial+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Semi-automated quantification of filopodial dynamics.</a> J Neurosci Methods. 171 (1), 165-173 (2008).</li>
<li>Nilufar, S., Morrow, A. A., Lee, J. M., Perkins, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FiloDetect%3A+automatic+detection+of+filopodia+from+fluorescence+microscopy+images%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">FiloDetect: automatic detection of filopodia from fluorescence microscopy images.</a> BMC Syst Biol. 7, 66(2013).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Burada, filopodial büyüme dinamikleri ve konveks gövde algoritması yoluyla bu dinamik yapılardaki bağıl protein konsantrasyonlarının izlenmesi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Yazılımı kullanarak, iki kanalın ( yani proteinler) göreli konsantrasyonlarının uzatma / geri çekme çevrimi boyunca belirlendiği ve ayrı klasörler halinde görüntü ve veri dosyaları olarak depolandığı tek bir programda üç kanala tek tek karşılaştırılabilir. Yazılım, rutin işlemlere ek olarak, ilgili deney için analizin optimize edilm...

Aktin düzenleyici proteinlerin spatio-temporal kontrolü filopodium dinamikler 1 , 2 ile ilişkilidir. Zamanla tüm filopodial uzunluk boyunca uzaysal olarak çözülen protein konsantrasyonunun izlenmesi, bu dinamik yapıların başlatılması, uzatılması, stabilizasyonu veya çökmesinin altında yatan mekanizmaları anlamak için çok önemlidir 3 , 4 . Birçok hücre şekli değişikliğinin daha büyük bir ölçekte gerçekleştiği sitoplazmada protein analizinin aksine, filopodiya, sürekli olarak 5 virajını kavrayan ve virüs oluşturan dinamik mikro yapılar olup, bu nedenle çizgi tarama gibi basit bir yaklaşımla analiz yapılmamaktadır. Filopodial şekli izlemek için farklı yazılım özümleri mevcuttur 6 , 7 , 8 , 9 . LikewHücre gövdesi içerisindeki protein dinamiklerinin oraniyometrik izlenmesi için yazılım geliştirilmiştir. 10 , 11 . Filopodial şekil ve uzay-zamanlı protein analizinin otomatik izlenmesini birleştirmek için son zamanlarda konveks-gövde algoritmasına 12 dayalı bir görüntü analiz yazılımı geliştirdik. Bir grafiksel kullanıcı arabirimi (GUI) aracılığıyla çalıştırılan bu yeni analiz yöntemi, filopodial uzunluk ve büyüme hızı boyunca göreli protein konsantrasyonunu ilk kez birleştirir ve böylece uzay-temporal protein dağılımının bu ölçümlerin hareketlerinden bağımsız olarak doğru ölçümünü sağlar Dinamik yapılar 12 . Yazılımın arkasındaki fikir (kaynak kodu serbestçe bulunur, aşağıya bakınız), konveks gövdesinin köşelerinden biri filopodyumun ucuyla örtüşecektir ( Şekil 1A ). Sonraki çerçeveye bakarak,Dışbükey gövdenin en yakın tepe noktası, hareketli uç tüm film boyunca izlenebilir. Ucu her karede algılandıktan sonra, konumu, filopodyum tabanında bir referans noktası ile ucu birleştirerek bir eksen çizmek için kullanılır ( Şekil 1B ). Son olarak, konumları eksene dik olan çizgide maksimum yoğunluk ile medyan piksel ile belirlenen eşit uzaklıktaki düğüm noktaları kullanılarak, filopodial şekli takip eden omurga belirlenir. Bu adaptif omurgadan yararlanarak, filopodial uzunluk boyunca üç kanala kadar filopodial büyüme ve protein konsantrasyonlarını izlemek için bir kymograph oluşturulur ( Şekil 1C ). <img alt="Şekil 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55653/55653fig1.jpg" /> Şekil 1: Görüntü Analiz Yazılımının Çalışma Prensibi. ( A ) Arkasındaki algoritmayazılım. Adım1&#39;de kullanıcı, filopodyumun referansını (tabanı) ve tepeyi (ucu) belirtir. Adım 2-1&#39;de, filopodyumun omurgası, maksimum yoğunluk değerine sahip medyan piksel kullanılarak elde edilir. Adım 3&#39;te omurga mekansal protein yoğunluğu profili için kullanılır. Adım 2-2&#39;de, yazılım otomatik olarak sonraki çerçevedeki ucu izler. Bütün prosedür tekrarlanır. ( B ) İzlem için kullanılan konveks gövde gibi önemli elementleri sunan gerçek filopodyumlu algoritmanın anlık görüntüsü. ( C ) Algoritma ile ölçülebilen parametrelere genel bakış. Bu rakam referans 12&#39;den değiştirildi. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55653/55653fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> Görüntü analiz yazılımı, grafiksel bir kullanım yoluyla Matlab&#39;da (programlama yazılımı olarak anılır) çalıştırılırR arabirimi. Belli deneysel ayarlar için esneklik ve dayanıklılığı en üst düzeye çıkarmak için kullanıcı bir dizi izleme parametresini ayarlayabilir ( örneğin, izin verilen eğme açısı ve çerçeve içi hareketi) ve filmlerde bazı düzeltmeler yapabilir ( örneğin, kırpma, döndürme, istenmeyen nesnelerin giderilmesi) ( Şekil 2A ve Tablo 1) . <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> GUI </td><td> Yok hayır. </td><td> Zorunlu </td><td colspan="5"> Açıklama </td><td> İsim (GUI&#39;de) </td></tr><tr><td> 1. </td><td> 1 A </td><td> Y </td><td colspan="5"> Hücre gövdesini (kutu işaretli olarak) gösteren yığınlanmış .tiff dosyasını yüklemek veya kanallardan üst üste yerleştirilen hücre gövdesi oluşturmak </td><td> Vücut hücresi </td></tr><tr><td> 1. </td><td> 1b </td><td> Y </td><td colspan=&quot;5&quot;&gt; Proteine ​​1 karşılık gelen istiflenmiş resim dosyası yükleniyor </td><td> Protein 1 </td></tr><tr><td> 1. </td><td> 1c </td><td> Y </td><td colspan="5"> Protein 2&#39;ye karşılık gelen yığılmış görüntü dosyasını yükleme </td><td> Protein 2 </td></tr><tr><td> 1. </td><td> 1d </td><td> Y </td><td colspan="5"> Protein 3&#39;e karşılık gelen yığınlanmış görüntü dosyasını yükleme </td><td> Protein 3 </td></tr><tr><td> 1. </td><td> 1e </td><td> N- </td><td colspan="5"> Önceden yüklenmiş yığılmış görüntü dosyalarına her şeyi sıfırlar </td><td> Reset </td></tr><tr><td> 1. </td><td> 2a </td><td> Y </td><td colspan="5"> GUI penceresinde # 2 analiz için ilk kareyi belirlemek için kaydırma çubuğu </td><td> NA </td></tr><tr><td> 1. </td><td> 2b </td><td> Y </td><td colspan="5"> GUI penceresinde # 2 analiz için son kareyi belirlemek için kaydırma çubuğu </td><td> NA </td></tr><tr><td> 1. </td><td> 2c </td><td> Y </td><td colspan="5"> Curre&#39;yi temsil eden kaydırma çubuğuNt çerçevesi </td><td> NA </td></tr><tr><td> 1. </td><td> 2d </td><td> N- </td><td colspan="5"> Tüm piksellerin altında sıfıra ayarlanacağı piksellerin gri değeri </td><td> NA </td></tr><tr><td> 1. </td><td> 2e </td><td> N- </td><td colspan="5"> Yukarıdaki tüm piksellerin maksimum değerlere ayarlanacağı piksellerin gri değeri </td><td> NA </td></tr><tr><td> 1. </td><td> 2f </td><td> N- </td><td colspan="5"> &lt;2e&gt; &amp; &lt;2f&gt; ile belirtilen piksellerin yoğunluk değerlerini ayarlayın. </td><td> Set </td></tr><tr><td> 1. </td><td> 2 g </td><td> N- </td><td colspan="5"> Yoğunluğu ayarlanmış filmi oynat </td><td> Oyun </td></tr><tr><td> 1. </td><td> 2s </td><td> N- </td><td colspan="5"> Görüntüyü kırp </td><td> ekin </td></tr><tr><td> 1. </td><td> 2i </td><td> N- </td><td colspan="5"> Resmi Döndür </td><td> Döndürme </td></tr><tr><td> 1. </td><td> 2j </td><td> N- </td><td colspan="5">Tüm yığında bölgeleri sil </td><td> Bölgeleri sil </td></tr><tr><td> 1. </td><td> 3 A </td><td> Y </td><td colspan="5"> &#39;Analiz Penceresi&#39;ni açmak için tıklayın (GUI penceresi # 2) </td><td> İzleme Penceresi </td></tr><tr><td> 1. </td><td> 3b </td><td> Y </td><td colspan="5"> Mikron cinsinden bir piksel boyutunu girin </td><td> Piksel boyutunu girin </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 4 </td><td> Y </td><td colspan="5"> Üst üste yerleştirilen hücre gövdesinin sınır / kenar görüntüsünü oluşturmak için tıklayın </td><td> Sınır </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 5 </td><td> Y </td><td colspan="5"> Filopodiyanın taban ve ucunu seçmek için tıklayın </td><td> Referernce </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 6a </td><td> Y </td><td colspan="5"> Segmentlerin veya düğümlerin sayısını girin </td><td> Segment sayısı </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 6b </td><td> Y </td><td colspan="5"> Tarama uzunluğunu girin (eksene dik olarak) </td><td> Tarama Genişliği </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 6c </td><td> Y </td><td colspan="5"> Filopodinin yukarıya doğru bükülmeye başlama uzunluğunu girin </td><td> Sonra Doğru Ölçümler </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 6d </td><td> Y </td><td colspan="5"> İpucu algılama çemberinin yarıçapını girin (yani, vertex&#39;in bir sonraki çerçevede lokalize edilebileceği alan) </td><td> İpucu algılama yarıçapı </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 6e </td><td> Y </td><td colspan="5"> Filopodium&#39;un dikey eksenden kıvrılabileceği maksimum açıyı girin </td><td> Açı Eşiği </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 6f </td><td> N- </td><td colspan="5"> Belirli çerçeve için taban ve uç için referans noktaları ekleyin </td><td> Referans seç </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 6g </td><td> N- </td><td colspan="5"> Belli bir çerçeve için filopodinin bükülmeye başlandığı uzunluğu girin </td><td> Sonra Doğru Ölçümler </td></tr><tr><td> 2. </td> &lt;td&gt; 6h </td><td> N- </td><td colspan="5"> Belirli çerçeve için algılama çemberinin yarıçapını girin </td><td> İpucu algılama yarıçapı </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 6i </td><td> N- </td><td colspan="5"> Belirli bir çerçeve için tüm parametreleri girdikten sonra, daha sonraki referanslar için bellek ve dosyalara değerleri depolamak için tıklayın. </td><td> Eklemek </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 6j&#39;nin </td><td> N- </td><td colspan="5"> Bu karenin elle ayar parametrelerini silmek için tıklayın </td><td> silmek </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 6k </td><td> N- </td><td colspan="5"> Tüm kareler için &#39;isteğe bağlı özellikler paneli&#39; kullanılarak manuel olarak saklanan tüm parametreleri silmek için tıklayın </td><td> Reset </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 6l </td><td> N- </td><td colspan="5"> Gelecekteki referans için tüm izleme sonuçlarını belleğe kaydetmek için izleme işleminden önce kontrol edin </td><td> Geçmiş izi </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 7 </td><td> Y </td><td colspan="5"> İzlemeyi başlatmak için tıklayın </td><td> Takip ve Analiz </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 8a </td><td> N- </td><td colspan="5"> Protein kanalı yoğunluğunu izlemeye başlamak için tıklayın </td><td> Protein yoğunluklarını analiz edin </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 8b </td><td> N- </td><td colspan="5"> Filopodial uzunluk boyunca protein kanal yoğunluğunu izlemek için kontrol edin </td><td> Bütün filopodi </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 8c </td><td> N- </td><td colspan="5"> Referans proteinini veya protein A&#39;yı izlemek için kontrol edin </td><td> Protein A </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 8d </td><td> N- </td><td colspan="5"> B proteinini izlemek için kontrol edin </td><td> ProteinB </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 8e </td><td> N- </td><td colspan="5"> Proteini C izlemek için kontrol edin </td><td> ProteinC </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 8f </td><td> N- </td><td colspan="5"> Ortalama protein yoğunluğunu izlemek için kontrol edin.E uç </td><td> Öne çıkan ipucu </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 8g </td><td> N- </td><td colspan="5"> İpucunun uzunluğunu girin </td><td> İpucu Uzunluğu </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 8h </td><td> N- </td><td colspan="5"> Ucun üstünde şekillendirme başladığı minimum mesafeyi girin </td><td> eşik </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 8i </td><td> N- </td><td colspan="5"> Öncü ipucu analiz sonuçlarını dosyaya kaydetmek için tıklayın. </td><td> Butona basınız </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 9a </td><td> N- </td><td colspan="5"> Ratiyometrik protein analizi başlatmak için tıklayın </td><td> Karşılaştırmak </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 9b </td><td> N- </td><td colspan="5"> A proteinine B proteinini karşılaştırmak için giriş yapın. </td><td> log 10 (B / A) </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 9c </td><td> N- </td><td colspan="5"> Protein C&#39;yi A&#39;ya göre karşılaştırmak için kontrol edin </td><td> log 10 (C / A) </td></tr><tr><td> 2. </td> &lt;td&gt; 9d </td><td> N- </td><td colspan="5"> Protein B&#39;yi uçtaki A&#39;ya göre karşılaştırmak için kontrol edin </td><td> log 10 (B / A) </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 9e </td><td> N- </td><td colspan="5"> Protein C&#39;yi uçtaki A&#39;ya göre karşılaştırmak için kontrol edin </td><td> log 10 (C / A) </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 10a </td><td> N- </td><td colspan="5"> Diğer renk haritasını seçin (varsayılan: Jetplot) </td><td> Renk Haritası </td></tr><tr><td> 2. </td><td> 10b </td><td> N- </td><td colspan="5"> Renk haritasını düzenle </td><td> Renk haritasını düzenle </td></tr></tbody></table> Tablo 1: GUI&#39;de Bulunan Tüm İşlevlere Genel Bakış Windows # 1 ve # 2. Bu gerçekleştirildiğinde, program bir konveks gövde oluşturur ve film boyunca ucu otomatik olarak izler. Filmden çıkarılan parametreler, örneğin bir sıçanometrik kymograph, büyüme hızı ve filopodial uzunluk aYeniden görüntülenir ve iş klasörüne görüntüler ve veri dosyaları olarak saklanır. Filopodial yaşam süresi, büyüme hızı ve geri çekme oranı gibi diğer parametreler daha sonra çıkarılabilir ve depolanmış veri dosyalarından daha fazla analiz edilebilir ( Şekil 2B ). <img alt="şekil 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55653/55653fig2.jpg" /> Şekil 2: Görüntü Analiz Yazılımının Kullanımı için Grafik Kullanıcı Arayüzü. ( A ) GUI Penceresi # 1, resim yüklemek ve işlemek için kullanılır. Program 3 kanala kadar yükleyebilir, böylece 2 kanal karşılaştırılır. Pencere, izlemeden önce görüntülerin ön işleme tabi tutulması için zorunlu (mavi) ve isteğe bağlı özellikler (yeşil) ile birlikte gelir ( B ) GUI Pencere # 2, filopodyumun yanı sıra zamansal ve oran-metrik protein analizi izlemek için kullanılır. Yine, isteğe bağlı özellikler yeşil olarak işaretlenmiştir. Bu rakam modifi olduKaynakça 12 . <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55653/55653fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> Burada, örnek hazırlama ve yazılım kullanımı için ayrıntılı bir protokol sunmaktayız. Hücrelerin kültürlenmesi ve görüntü analizi için optimize edilmiş filmlerin edinilmesi ile ilgili ayrıntılı talimatlarla başlayacağız. Veri edinimi ile ilgili bu bölüm, görüntü analiz yazılımını çalıştırmak için ayrıntılı bir açıklama izliyor. Protokol boyunca, verileri toplamak ve işlemek için dikkate alınması gereken kritik adımları ve isteğe bağlı özellikleri tanıtmaktayız. Son olarak, açıklanan görüntü analiz yazılımının filopodial niceleme için mevcut olan diğer programlarla karşılaştırılması ve sınırlamalar ve geleceğe yönelik bir tartışma ile kapanmadan önce, filopodiyi görüntü analiz yazılımı ile farklı model sistemlerinden analiz ediyoruz.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>%10 Fetal sığır serumu</td><td>Biochrom AG</td><td>L11-044</td><td></td></tr><tr><td>Lipofektamin 2000</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11668-027</td><td></td></tr><tr><td>%1 penisilin / streptomisin</td><td>Biochrom AG</td><td>12212</td><td></td></tr><tr><td>Nörobazal Orta Yaşam Teknolojileri</td><td></td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M stok çözümü)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>Sitrin-N1</td><td>Addgene</td><td>54593</td><td></td></tr><tr><td>Labtech</td><td>Thermo</td><td>155411</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax-I</td><td>Thermo</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Hela</td><td>Leibniz Enstitüsü DSMZ</td><td>ACC-57</td><td></td></tr><tr><td>COS 7</td><td>Leibniz Enstitü DSMZ</td><td>ACC-60</td><td></td></tr><tr><td>3T3 hücreleri</td><td>Leibniz Enstitüsü DSMZ</td><td>ACC-59</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Nicon Eclipse</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kamera</td><td>Andor</td><td>DU888 Ultra</td><td></td></tr><tr><td>Konfokal</td><td>Ünite Yokagawa</td><td>CSU-X1</td><td></td></tr><tr><td>Piruvat</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td></td></tr></tbody></table>

dinamik hücresel protrüzyonlarda protein konsantrasyonunun yazılım destekli takibi için grafiksel bir kullanıcı arayüzü

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia, göç ve hücre-hücre iletişimi ile ilişkili dinamik, parmak benzeri hücresel çıkıntılardır. Filopodial başlatma, uzama ve daha sonra stabilizasyon veya geri çekmenin altında yatan karmaşık sinyal mekanizmalarını daha iyi anlamak için, bu dinamik yapılarda uzay-zamansal protein aktivitesinin belirlenmesi çok önemlidir. Filopodiya&#39;daki protein fonksiyonunu analiz etmek için kısa bir süre önce filopodial şekil değişikliklerine uyum sağlayan yarı otomatikleştirilmiş bir izleme algoritması geliştirdik ve böylece tüm filopodial uzunluk boyunca çıkıntı dinamiklerinin ve göreceli protein konsantrasyonunun paralel analizine izin verdik. Burada, optimize hücre işleme, görüntü toplama ve yazılım analizi için ayrıntılı bir adım adım protokol sunuyoruz. Ayrıca görüntü analizi ve veri sunumu sırasında isteğe bağlı özelliklerin kullanımı ile ilgili talimatların yanı sıra yol boyunca tüm kritik adımlar için giderme yönergeleri sağlıyoruz. Son olarak, aynı zamanda dFilopodia niceleme için hazır bulunan diğer programlarla birlikte görüntü analiz yazılımını hazırlar. Sunulan protokol, birlikte görüntü analizi yazılımı kullanarak filopodial çıkıntılar protein dinamikleri doğru analiz için bir çerçeve sağlar.

Filamentöz aktin (f-traktin 18 , kırmızı) ve sitosolik referans (yeşil) için bir markör ile transfekte edilmiş COS hücrelerini kullanarak, aktin bakımından zengin filopodial çıkıntıları bulduk ( Şekil 3A , üst panel). Zaman serileri, filopodinin hızla uzaması ve geri çekilmesi olduğunu gösterdi ( Şekil 3A , orta panel). Görüntü analiz yazılımını kullanarak, bireysel filopodiyi izledik. El ile görüntü anal...

Dinamik hücresel çıkıntıların uzunluğu boyunca göreli protein yoğunluğunun yarı otomatik olarak izlenmesi için bir yazılım çözümü sunmaktayız.

Dinamik Hücresel Protrüzyonlarda Protein Konsantrasyonunun Yazılım Destekli Takibi için Grafiksel Bir Kullanıcı Arayüzü

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Bu görüntü analiz yazılımının genel amacı, tüm filopodial uzunluk boyunca çıkıntı dinamiklerinin ve bağıl protein konsantrasyonunun paralel analizidir. Bu yöntem, hücre biyolojisindeki temel soruları, özellikle de filopodia'nın uzaması ve geri çekilmesinde rol oynayan bireysel proteinleri anlamamıza gerçekten yardımcı olabilir. Tekniğin ana avantajı, sağlanan uyarlanabilir şekil izleme algoritmasının, çıkıntı dinamiklerinin kantitatif değerlendirmesine ve uzamsal olarak çözülmüş protein lokalizasyonuna izin vermesidir.Başlamak için, kültür nöronları, HeLa veya COS hücrelerini, metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi takviye edilmiş ortamda kültürleyin. %40 birleşmeye ulaşıldığında, üreticinin talimatlarına göre bir transveksiyon reaktifi kullanarak hücreleri tercih edilen yapılarla transvekte edin. Transveksiyonlu hücreleri 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de 15 ila 18 saat boyunca bir inkübatörde tutun.İnkübasyonun ardından, görüntü elde etme sırasında buharlaşmaya bağlı pH ve ozmolaritedeki değişiklikleri azaltmak için hücre kültürü odalarını 20 mili molar HEPES içeren 37 santigrat derece önceden ısıtılmış ortamla %90'a kadar doldurun. Kapağı kapatmak için, kapağın iç kısmına ince bir tabaka vakumlu gres uygulayın ve transvected hücreleri içeren kültür odasına hafifçe bastırın. Görüntü analizi için belki de en önemli kısım görüntü kalitesidir.Dikkat etmemiz gereken bir şey, dörtten fazla olması gereken sinyal-gürültü oranıdır ve kameranın pozlama süresini ve lazer yoğunluğunu ve kuvvetini ayarlayarak kare hızının izlenmesini sağlayabiliriz. hertz'den daha fazla olmalıdır. Görüntüleri, 60x veya 100x objektifli ve piksel bükülmesi olmayan bir mikroskop kullanarak elde edin. Filopodial dinamikleri izlemek için bir hertz'den az olmayan edinim oranlarını kullanın.Odak dışı artefaktları en aza indirmek için, fesleğen zarına yakın bir filopodial görüntüleyin. Sorunsuz izleme sağlamak için, kameranın pozlama süresini ve lazer yoğunluğunu, sinyal-gürültü oranı dörtten büyük olacak şekilde ayarlayın. Bu işlem tamamlandıktan sonra görüntü alımını başlatın.Görüntü ön işlemenin ardından, metin protokolünde açıklandığı gibi, görüntü analizi için gerekli tüm dosyaları içeren sıkıştırılmış klasörü indirerek görüntüleri yükleyin. Dosyaları açın ve çalışma klasörüne kopyalayın. Kurulduktan sonra, filopodiaAnalysisM3.fig adlı dosyayı açarak grafik kullanıcı arayüzünü başlatın.Tek tek proteinler için kaydedilen yığın TIFF dosyalarını grafik kullanıcı arayüzüne veya GUI'ye yükleyin. Protein A için 1B, protein B için 1C ve isteğe bağlı olarak protein C için 1D düğmelerini kullanarak.1A'ya tıklayarak protein kanallarından hücrenin üst üste binmiş bir görüntüsünü oluşturun. Ardından, ilk çerçeveyi atamak için 2A'ya tıklayın ve analiz için son çerçeveyi atamak için 2B'ye tıklayın.İsteğe bağlı olarak, 2H düğmesini kullanarak ilgilenilen filopodyumu içeren ilgilenilen bölgeyi veya yatırım getirisini kırpın. 2I düğmesini kullanarak görüntüyü döndürün veya serbest elle çizim aracı olan 2J'yi kullanarak istenmeyen bölgeleri silin. Kalite kontrol ve filopodyumun tüm film boyunca net bir şekilde görünüp görünmediğini kontrol etmek için kaydırıcıyı, her kare için 2C'yi hareket ettirin.İzlemeyi oluşturmak için, önce GUI penceresi iki'yi açmak için GUI penceresindeki 3A düğmesine tıklayın. 1A'ya tıkladıktan sonra GUI penceresi birinde oluşturulan üst üste binen hücre gövdesinin kütlesini oluşturmak için GUI penceresi ikideki dört düğmesine tıklayın. Deneysel veri kümeniz için segment sayısı, tarama genişliği ve tarama yarıçapı gibi parametreleri optimize etmek için biraz zaman ayırmanızı öneririz.Filopodial ucun ilk olarak nerede göründüğünü kontrol etmek için iki numaralı penceredeki kaydırıcıyı hareket ettirin. Ardından, beşinci düğmeye tıklayın ve imleç görünecektir. Filopodial ucun mesafesinin ölçüldüğü tabanı seçmek için imleci kullanın.Ardından filopodia'nın ucu ilk göründüğü çerçevede. Ardından, 6C kullanarak filopodia'nın büküleceği eşik uzunluğunu seçin. Ardından, 6A kutusunda filopodia'nın şeklini yaklaşık olarak tahmin etmek için kullanılan segment sayısını belirtin.Düğümleri 6B'ye yerleştirmek için yatay tarayıcı görevi gören tarama genişliğini belirtin. Tarama yarıçapını belirtin 6D kutusunda, gözlemlenen çerçeveler arası uç yer değiştirmesinden yaklaşık %50 daha büyük bir değer kullanın. Ardından, kutu 6E'de bükülme açısını belirtin.Tüm izleme protokolünü ileride başvurmak üzere kaydetmek için GUI penceresi iki'deki kutunun geçmiş izlemesini kontrol edin ve ardından izlemeye başlamak için izle ve analiz et düğmesine tıklayın. Uzamsal zamansal analiz için, 8B ile temsil edilen kutuyu ve ardından ilgilenilen protein kanalını seçin. Daha önce oluşturulan izi kullanarak filopodial uzunluk boyunca protein takibini başlatmak için 8A'ya tıklayın.Oransal protein analizi için, 9B veya 9C kutusunu işaretleyin ve uzamsal zamansal oransal grafiği elde etmek için 9A düğmesine tıklayın. Filopodial uç analizini gerçekleştirmek için 8F kutusunu işaretleyin ve 8G ve 8H kullanarak tabandan uç uzunluğunu ve eşik uzunluğunu belirtin. Verileri dynamics.xlsx adlı bir excel dosyasına kaydetmek için basma düğmesine tıklayın.Ardından, filopodial ucun protein yoğunluklarının izini oluşturmak ve oransal analiz için kaydetmek için protein yoğunluklarını analiz et'e tıklayın. 9D veya 9E kullanarak analiz edilecek istenen orana tıklayın. Son olarak, oransal verileri oluşturmak için karşılaştır düğmesine 9A'ya tıklayın.Kırmızı renkte filamentli aktin için bir markör ve yeşil renkte bir sitozolik referans ile transveksiyona tabi tutulan COS hücrelerinin analizi, aktin açısından zengin filopodial çıkıntıları ortaya çıkarır. Bir zaman serisi, aktin açısından zengin filopodial çıkıntıların hızla uzadığını ve geri çekildiğini gösterir. Görüntü analiz yazılımı kullanılarak, bireysel filopodia izlendi.Görüntü analiz yazılımı, filopodial uzantıyı güvenilir bir şekilde izler, tek bir filopodyanın büyüme ve geri çekilme oranlarına ek olarak, kemigraflar ayrıca sitozolik referansa normalize edilmiş aktin konsantrasyonunu da gösterir. Doğru kullanılırsa, bu teknik, filopodia boyunca çıkıntı dinamiklerinin ve uzamsal olarak çözülmüş protein konsantrasyonunun kantitatif analizine izin verir. Prosedürü denerken, tek tek görüntüleri doygunlaştırmadan, çekim hızını hatırlamak ve sinyal-gürültü oranını dörtten büyük tutmak önemlidir.

a-graphical-user-interface-for-software-assisted-tracking-protein

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Tek molekül izleme ile kombine Fotoaktive yerelleştirme mikroskobu (PALM) verir canlı Escherichia coli hücrelerinde protein-DNA etkileşimleri doğrudan gözlem ve ölçümü.

Fotoaktive Tek molekül Takip Kullanma Canlı Bakteriyel Hücrelerde Protein-DNA Etkileşimleri görselleştirme

Bu protokol, canlı hücrelerin yüzeyindeki tek reseptörleri görselleştirmek ve izlemek ve böylece reseptör yanal hareketliliğini, reseptör komplekslerinin boyutunu analiz etmek ve ayrıca geçici reseptör-reseptör etkileşimlerini görselleştirmek için toplam iç yansıma floresan mikroskobunun nasıl kullanılacağını açıklar. Bu protokol diğer zar proteinlerine genişletilebilir.

Tek molekül Floresan Mikroskopi Reseptör Dinamiği Yüksek çözünürlüklü Spatiotemporal Analizi

Bu video protokolünde, modifiye edilmiş iki fotonlu bir mikroskopta orbital izleme yöntemini kullanarak, canlı hücreler içindeki floresan olarak işaretlenmiş lizozomları - yüksek hızda ve üç boyutta - izliyoruz.

Modifiye İki foton mikroskop 3D Orbital Takip: Hücre içi veziküllerin İzlemeye Bir Uygulama

Klatrin aracılı endositoz, hızlı ve oldukça dinamik bir süreç, sinyal reseptörleri de dahil olmak üzere birçok proteini içselleştirir. Burada açıklanan protokol, bireysel endositik olayların kinetiğini doğrudan görselleştirir. Bu, endositik makinenin çekirdek üyelerinin birbirleriyle nasıl koordine olduğunu ve protein yükünün bu süreci nasıl etkilediğini anlamak için gereklidir.

TIRF Mikroskopi ile Tek olay ebatları da G protein-bağlanmış alıcılar üzerinden Klatrin dolayımlı endositoz görselleştirme

Burada, tek parçacık kantitatif değerlendirilmesi Difüzyon katsayıları, Floresans mikroskobu tarafından algılanan tek parçacıkların hareket ve küme boyutları türleri sağlar görüntü analizi izleme için bir iletişim kuralı mevcut.

Görüntü membran reseptörleri Floresans mikroskobu tarafından küme boyutunu ve Difüzyon analizi için protokol işleme

3D tek moleküllü lokalizasyon mikroskopisi, yaşayan bakteri hücrelerinde floresan olarak etiketlenmiş proteinlerin mekansal konumlarını ve hareket yörüngelerini araştırmak için kullanılır. Burada açıklanan deneysel ve veri analizi protokolü, sitosolik proteinlerin havuzhalinde ki tek moleküllü yörüngelere dayalı yaygın diffüzif davranışlarını belirler.

Tek Moleküllü İzleme Mikroskobu - Sitosolik Moleküllerin Diffüz Durumlarını Belirlemede Bir Araç

Bu makalede, geniş alan floresan mikroskopisi kullanılarak mobil, tek moleküllü Förster rezonans enerji transferi (smFRET) tabanlı probların mekansal analizi için bir yöntem sunulmaktadır. Yeni geliştirilen yazılım araç seti, doğru FRET verimliliği ve moleküler konumlar da dahil olmak üzere hareketli probların smFRET zaman izlerinin zamanın işlevleri olarak belirlenmesini sağlar.

Mobil Tek Moleküllü FRET Problarının Otomatik İki Boyutlu Mekansal Analizi

Bu protokol, yayılan hücrelerin kenarındaki çıkıntıların dinamik parametrelerini (çıkıntılar, geri çekmeler, fırfırlar) ölçmeyi amaçlamaktadır.

Canlı Hücre Mikroskobu ile Yayılma Sırasında Hücre-Kenar Çıkıntı Dinamiğinin Ölçülmesi

Bu protokol, moleküler kütlenin ve lipit membranlarla etkileşime giren makromoleküllerin difüzyon davranışının eşzamanlı olarak araştırılmasını sağlayan iSCAT tabanlı bir görüntü işleme ve tek parçacık izleme yaklaşımını açıklar. Numune hazırlama, kütleden kontrasta dönüştürme, film edinme ve son işleme için adım adım talimatlar, olası tuzakları önlemek için talimatlarla birlikte sağlanır.

Membranla İlişkili Makromolekül Dinamiğini Karakterize Etmek için Kütleye Duyarlı Partikül İzleme

Bu makale, katı destekli lipid çift katmanlarında tek protein izleme için örnekler nasıl oluşturulacağına dair ayrıntılı bir açıklama sunmaktadır. Ayrıca, tek molekül hassasiyeti ve hızlı kare hızına sahip basit bir floresan mikroskobu da açıklar. Son olarak, tek protein yörüngelerinin çıkarılması prosedürünü özetliyoruz.

Lipid çift katmanlarında tek proteinlerin floresan mikroskopisi kullanılarak takibi

Öğrenin filopodial çıkıntılarda protein dinamiklerini yarı otomatik görüntü analizi yazılımı ile analiz etmeyi. Bu yöntem, uzamsal çözünürlüklü protein konsantrasyonunu ve çıkıntı dinamiklerini eş zamanlı nicelendirir.

Dinamik Hücresel Protrüzyonlarda Protein Konsantrasyonunun Yazılım Destekli Takibi için Grafiksel Bir Kullanıcı Arayüzü

Daha fazla video keşfet