Dinamik Hücresel Protrüzyonlarda Protein Konsantrasyonunun Yazılım Destekli Takibi için Grafiksel Bir Kullanıcı Arayüzü

Bu görüntü analiz yazılımının genel amacı, tüm filopodial uzunluk boyunca çıkıntı dinamiklerinin ve bağıl protein konsantrasyonunun paralel analizidir. Bu yöntem, hücre biyolojisindeki temel soruları, özellikle de filopodia'nın uzaması ve geri çekilmesinde rol oynayan bireysel proteinleri anlamamıza gerçekten yardımcı olabilir. Tekniğin ana avantajı, sağlanan uyarlanabilir şekil izleme algoritmasının, çıkıntı dinamiklerinin kantitatif değerlendirmesine ve uzamsal olarak çözülmüş protein lokalizasyonuna izin vermesidir.

Başlamak için, kültür nöronları, HeLa veya COS hücrelerini, metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi takviye edilmiş ortamda kültürleyin. %40 birleşmeye ulaşıldığında, üreticinin talimatlarına göre bir transveksiyon reaktifi kullanarak hücreleri tercih edilen yapılarla transvekte edin. Transveksiyonlu hücreleri 37 santigrat derece ve% 5 CO2'de 15 ila 18 saat boyunca bir inkübatörde tutun.

İnkübasyonun ardından, görüntü elde etme sırasında buharlaşmaya bağlı pH ve ozmolaritedeki değişiklikleri azaltmak için hücre kültürü odalarını 20 mili molar HEPES içeren 37 santigrat derece önceden ısıtılmış ortamla %90'a kadar doldurun. Kapağı kapatmak için, kapağın iç kısmına ince bir tabaka vakumlu gres uygulayın ve transvected hücreleri içeren kültür odasına hafifçe bastırın. Görüntü analizi için belki de en önemli kısım görüntü kalitesidir.

Dikkat etmemiz gereken bir şey, dörtten fazla olması gereken sinyal-gürültü oranıdır ve kameranın pozlama süresini ve lazer yoğunluğunu ve kuvvetini ayarlayarak kare hızının izlenmesini sağlayabiliriz. hertz'den daha fazla olmalıdır. Görüntüleri, 60x veya 100x objektifli ve piksel bükülmesi olmayan bir mikroskop kullanarak elde edin. Filopodial dinamikleri izlemek için bir hertz'den az olmayan edinim oranlarını kullanın.

Odak dışı artefaktları en aza indirmek için, fesleğen zarına yakın bir filopodial görüntüleyin. Sorunsuz izleme sağlamak için, kameranın pozlama süresini ve lazer yoğunluğunu, sinyal-gürültü oranı dörtten büyük olacak şekilde ayarlayın. Bu işlem tamamlandıktan sonra görüntü alımını başlatın.

Görüntü ön işlemenin ardından, metin protokolünde açıklandığı gibi, görüntü analizi için gerekli tüm dosyaları içeren sıkıştırılmış klasörü indirerek görüntüleri yükleyin. Dosyaları açın ve çalışma klasörüne kopyalayın. Kurulduktan sonra, filopodiaAnalysisM3.fig adlı dosyayı açarak grafik kullanıcı arayüzünü başlatın.

Tek tek proteinler için kaydedilen yığın TIFF dosyalarını grafik kullanıcı arayüzüne veya GUI'ye yükleyin. Protein A için 1B, protein B için 1C ve isteğe bağlı olarak protein C için 1D düğmelerini kullanarak.1A'ya tıklayarak protein kanallarından hücrenin üst üste binmiş bir görüntüsünü oluşturun. Ardından, ilk çerçeveyi atamak için 2A'ya tıklayın ve analiz için son çerçeveyi atamak için 2B'ye tıklayın.

İsteğe bağlı olarak, 2H düğmesini kullanarak ilgilenilen filopodyumu içeren ilgilenilen bölgeyi veya yatırım getirisini kırpın. 2I düğmesini kullanarak görüntüyü döndürün veya serbest elle çizim aracı olan 2J'yi kullanarak istenmeyen bölgeleri silin. Kalite kontrol ve filopodyumun tüm film boyunca net bir şekilde görünüp görünmediğini kontrol etmek için kaydırıcıyı, her kare için 2C'yi hareket ettirin.

İzlemeyi oluşturmak için, önce GUI penceresi iki'yi açmak için GUI penceresindeki 3A düğmesine tıklayın. 1A'ya tıkladıktan sonra GUI penceresi birinde oluşturulan üst üste binen hücre gövdesinin kütlesini oluşturmak için GUI penceresi ikideki dört düğmesine tıklayın. Deneysel veri kümeniz için segment sayısı, tarama genişliği ve tarama yarıçapı gibi parametreleri optimize etmek için biraz zaman ayırmanızı öneririz.

Filopodial ucun ilk olarak nerede göründüğünü kontrol etmek için iki numaralı penceredeki kaydırıcıyı hareket ettirin. Ardından, beşinci düğmeye tıklayın ve imleç görünecektir. Filopodial ucun mesafesinin ölçüldüğü tabanı seçmek için imleci kullanın.

Ardından filopodia'nın ucu ilk göründüğü çerçevede. Ardından, 6C kullanarak filopodia'nın büküleceği eşik uzunluğunu seçin. Ardından, 6A kutusunda filopodia'nın şeklini yaklaşık olarak tahmin etmek için kullanılan segment sayısını belirtin.

Düğümleri 6B'ye yerleştirmek için yatay tarayıcı görevi gören tarama genişliğini belirtin. Tarama yarıçapını belirtin 6D kutusunda, gözlemlenen çerçeveler arası uç yer değiştirmesinden yaklaşık %50 daha büyük bir değer kullanın. Ardından, kutu 6E'de bükülme açısını belirtin.

Tüm izleme protokolünü ileride başvurmak üzere kaydetmek için GUI penceresi iki'deki kutunun geçmiş izlemesini kontrol edin ve ardından izlemeye başlamak için izle ve analiz et düğmesine tıklayın. Uzamsal zamansal analiz için, 8B ile temsil edilen kutuyu ve ardından ilgilenilen protein kanalını seçin. Daha önce oluşturulan izi kullanarak filopodial uzunluk boyunca protein takibini başlatmak için 8A'ya tıklayın.

Oransal protein analizi için, 9B veya 9C kutusunu işaretleyin ve uzamsal zamansal oransal grafiği elde etmek için 9A düğmesine tıklayın. Filopodial uç analizini gerçekleştirmek için 8F kutusunu işaretleyin ve 8G ve 8H kullanarak tabandan uç uzunluğunu ve eşik uzunluğunu belirtin. Verileri dynamics.xlsx adlı bir excel dosyasına kaydetmek için basma düğmesine tıklayın.

Ardından, filopodial ucun protein yoğunluklarının izini oluşturmak ve oransal analiz için kaydetmek için protein yoğunluklarını analiz et'e tıklayın. 9D veya 9E kullanarak analiz edilecek istenen orana tıklayın. Son olarak, oransal verileri oluşturmak için karşılaştır düğmesine 9A'ya tıklayın.

Kırmızı renkte filamentli aktin için bir markör ve yeşil renkte bir sitozolik referans ile transveksiyona tabi tutulan COS hücrelerinin analizi, aktin açısından zengin filopodial çıkıntıları ortaya çıkarır. Bir zaman serisi, aktin açısından zengin filopodial çıkıntıların hızla uzadığını ve geri çekildiğini gösterir. Görüntü analiz yazılımı kullanılarak, bireysel filopodia izlendi.

Görüntü analiz yazılımı, filopodial uzantıyı güvenilir bir şekilde izler, tek bir filopodyanın büyüme ve geri çekilme oranlarına ek olarak, kemigraflar ayrıca sitozolik referansa normalize edilmiş aktin konsantrasyonunu da gösterir. Doğru kullanılırsa, bu teknik, filopodia boyunca çıkıntı dinamiklerinin ve uzamsal olarak çözülmüş protein konsantrasyonunun kantitatif analizine izin verir. Prosedürü denerken, tek tek görüntüleri doygunlaştırmadan, çekim hızını hatırlamak ve sinyal-gürültü oranını dörtten büyük tutmak önemlidir.