Name: Fotoaktive Tek molekül Takip Kullanma Canlı Bakteriyel Hücrelerde Protein-DNA Etkileşimleri görselleştirme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-10T20:30:00.000+00:00
Duration: 16 min 21 s
Description: Öğrenin canlı bakteriyel hücrelerde protein-DNA etkileşimlerini PALM ve tek molekül takip yöntemiyle görselleştirmeyi. Escherichia coli hücrelerinde DNA bağlayıcı protein aktivitesini nicel olarak ölçün.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz yerelleştirme yazılım için ısmarlama mikroskop ve Seamus Holden inşaatı ile yardım için Justin Pinkney ve Johannes Hohlbein kabul. Rodrigo Reyes-Lamothe E. sağlamak için teşekkür etti coli suşu. Araştırma Avrupa Komisyonu Yedinci Çerçeve Programı Hibe FP7/2007-2013 SAĞLIK-F4-2008-201418, UK Biyoteknoloji ve Biyolojik Bilimler Araştırma Konseyi Grant BB/H01795X/1 ve ANK Avrupa Araştırma Konseyi Grant 261227 tarafından finanse edildi. DJS bir Wellcome Trust Programı Hibe WT083469 tarafından finanse edildi. SU Bir MathWorks doktora bursu ile desteklenmiştir.

1.. Hücre Kültürü Steril kültür tüpleri ve pipet ipuçlarını kullanın. E. E. coli suşu AB1157 Pola-PAmCherry Pol1 bir C-terminal füzyon PAmCherry taşır. Füzyon et al Datsenko tarif edildiği gibi lambda-Red rekombinasyon kullanılarak yabani tip geni değiştirerek doğal kromozom sokulmuştur. Hücresel büyüme ve DNA hasar madde metil duyarlılık ile belirlendiği üzere, füzyon proteininin 8 İşlevsellik doğrulandı metansülfonat (MMS). Hücre soyunun yapımı hakkında daha fazla bilgi Uphoff et al. 7 bulunabilir, Datsenko et al. 8 ve Reyes-Lamothe et al. 9 hücre kültürleri otoflüoresanı azaltmak ve mikroskop lamı üzerine arka plan parçacıkların bulunduğu M9 minimal bir ortam içinde büyütülür. Alternatif olarak, besleyici açısından zengin tanımlanmış ortam 10 kullanılabilir. <ol><li> Çizgi E. coli suşu AB1157 seçici antibiyotik (burada, 25 ug / ml kanamisin) bir Luria Broth (LB) agaroz plaka üzerinde dondurulmuş gliserol stokundan Pola-PAmCherry ve gece boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Tek bir hücre koloniden bir 5 ml LB kültürü inoküle ve 3 saat boyunca 220 rpm&#39;de çalkalanarak 37 ° C&#39;de büyür. </li><li> 5 ml kültür 1:10,000 seyreltin minimal ortam (M9 aracı, MEM amino asit + prolin, MEM vitaminleri,% 0.2 gliserol) ve 37 ° C, gece boyunca 220 rpm &#39;de çalkalanarak inkübe edin. </li><li> Sonraki sabah, bir spektrofotometre kullanılarak optik yoğunluğun (OD) ölçmek ve OD 0.025, 5 ml taze minimal ortam kültür seyreltin. Erken üslü fazda (OD 0.1) 220 rpm&#39;de çalkalanarak 37 ° C&#39;de 2 saat boyunca büyütün. </li><li> 5 dakika boyunca 2300 x g&#39;de santrifüj ile bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde hücre 1 ml konsantre edin. Süpernatantı ve 20 ul artık orta ve vorteks hücre pelletini. </li></ol> 2. Mikroskop Slide preparatiyon <ol><li> DH 2 O.% 1,5 düşük floresan agaroz çözüm hazırlayın Çözelti berraklaşıncaya kadar agaroz eritmek için bir mikrodalga kullanarak. Hafifçe yukarı pipetleme ve aşağı birkaç kez 2x minimal ortamda 500 ul ile erimiş agaroz çözüm 500 ul karıştırın. </li><li> Bir mikroskop lamel (Hayır 1.5 kalınlık) merkezine eşit agaroz çözüm yaymak. Bu agaroz soğutur önce kabarcıklar kaçınarak, hızlı bir şekilde yapılmalıdır. </li><li> Ikinci bir lamel (Hayır 1.5 kalınlık) ile pad düzleştirmek. Arka plan flüoresan partikülleri çıkarmak için, lamelleri önce 1 saat boyunca 500 ° C&#39;de bir fırın içinde yakıldı. Yakılan lamelleri alüminyum folyo ile kaplanmış, oda sıcaklığında hafta boyunca depolanabilir. </li><li> DNA hasarı deneyler için, 100 mM MMS ihtiva eden bir agaroz ped hazırlar. Adımda 2,1-2,3 in prosedürü izleyin, ama 100 mM M bir son konsantrasyon için, eritilmiş% 1.5 agaroz 500 ul ile karıştırılmadan önce, M9 ortam 500 ul 8.3 ul ekle MMSMS. (Dikkat! MMS toksik ve mutajenik ve eldiven, maske, gözlük, ve laboratuvar önlüğü ile ele alınması gerekir). </li><li> Yastığın en üst slayt çıkarın ve ped üzerine konsantre edilmiş hücre süspansiyonu 1 ul ekle. Kullanılmayan bir yandı lamel (Hayır 1.5 kalınlık, mikroskop objektif özelliklerini eşleşen) ile pad kaplayarak ve slayt çok hafifçe basarak hücrelerin hareketsiz. Hücreler agaroz ped kurumadan immobilizasyonun 45 dakika içinde görüntülü olmalıdır. Daha deneyler sırasında kurumasını önlemek için, agaroz yastıkları silikon contalar kullanılarak kapatılabilir. </li><li> DNA-hasar deneyler için, görüntüleme önce oda sıcaklığında nemli bir kap içinde 20 dakika boyunca 100 mM MMS ihtiva eden agaroz ped üzerinde hareketsiz hücreler inkübe edilir. </li></ol> 3. Mikroskopi Veri Toplama hazırlanıyor PALM algılama ve tek floresan proteinleri kesin lokalizasyonu dayanır. Duyarlılığı ve optimal hizalamaMikroskop, veri kalitesi için kritik öneme sahiptir. Tek molekül floresan mikroskoplar genellikle lamel yüzeyinden ince bir bölümünde heyecanlı sadece floroforlar tarafından sinyal-gürültü oranını artırmak için Toplam İç Yansıma (TIR) ​​aydınlatma kullanır. E. içinde İşte, görüntüleme coli derece hafifçe uyarma ışık açısını azaltarak bir TIRF mikroskop elde edilebilir eğimli aydınlatma 11 gerektirir. PAmCherry görüntüleme bundan başka, bir foto-aktifleştirme 405 nm lazeri ve 561 nm bir uyarım lazer gerektirir. Floresans emisyon 114,5 nm / piksellik bir piksel uzunluğunda elde büyütülerek CCD (EMCCD) kamera çarparak bir elektron kaydedilir. Optimum yerelleştirme hassasiyet için, piksel boyutu yaklaşık çok sayıda piksel üzerinde sinyal yayma olmadan yeterli örnekleme sağlamak PSF standart sapma genişliği aynı olmalıdır. Şekil 3 minimal PALM kurulum şemasını göstermektedir. Movie 1ısmarlama mikroskop inşa sürecinin bir izlenim verir,. aletin ayrıntılı bilgi için Uphoff ark 7&#39;ye bakın. <ol><li> Rutin mikroskop hizalama yapılması. 405 nm ve objektif önünde 561 nm sürekli dalga lazer yoğunluklarını ölçün. 3,5 mW (~ 400 W / cm 2) ve 10 μW (~ 1 W / cm 2) 405 nm yoğunluğu için 561 nm yoğunluğunu ayarlayın. 0-10 μW 405 nm yoğunluğu kademeli olarak ayarlanmasını sağlayan bir sürekli değişken nötr yoğunluk filtresi tekerleğini kullanın. Deney başlangıcına kadar lazer aydınlatmasını kapatın. </li><li> Mikroskop sahnede örnek yerleştirin ve iletilen ışık mikroskobu modu (Şekil 4A) odağa hücreleri getirmek. EMCCD kamera kazanç aşırı maruz kalma tarafından kameraya zarar görmesini önlemek için kapalı olması gerekir. </li><li> Veri boyutunu azaltmak ve kamera Okuması hızını artırmak için bir kırpılmış FOV&#39;yi tanımlayın. </li><li> Ortam ışığına ve sviç, numuneyi KapakEMCCD kamera kazanç ch. </li><li> (0.26 msn kamera okuma süresi dahil) 15.26 msn / kareye kare hızını ayarlamak. Tartışma bölümünde &quot;Pozlama süresi ve uyarım yoğunluklarını&quot; Bkz. </li><li> Karanlık bir arka plan sinyali (Şekil 4B) kontrol etmek için kamera verilerini görüntüler. </li><li> 561 nm lazer açın ve uyarma arka plan sinyali (Şekil 4C) kontrol edin. </li><li> Pol1-PAmCherry füzyon proteinlerinin fotoaktivasyonu için 405 nm lazer açın ve floresan PSFs görünen kadar yoğunluğunu artırabilir. </li><li> Lamel yüzeyine yakın numunenin sadece ince bir bölümünü aydınlatmaya uyarma ışın açısını ayarlayın. <ol><li> Bu amaçla, lazer ışını bir 100X NA 1.4 amacın arka odak düzlemi (Şekil 3) içine odaklanmıştır. Kirişin dik bir odaklama lensi tercüme uzak bir açı altında amaç çıkmak için ışın neden olan amaç merkezinden odağı taşır. </li><li> Aifloresans yoğunluğunu en üst düzeye çıkarmak ve arka plan sinyalinin en aza indirmek için m. Katı TIR uyarma lamel yüzeyin 100 nm olan görüntü florofor için uygun olduğuna dikkat edin, ancak, görüntüleme DNA-bağlama proteinleri E ile ilişkili coli nucleoid 0.8 um derin aydınlatma kadar gerektirir. </li></ol></li></ol> 4. Veri Toplama Burada, bir PALM film edinimi için genel protokol açıklar. Aynı prosedür, hasar E&#39;de Pol1-PAmCherry füzyon proteinleri görüntüleme için de geçerlidir coli hücreleri ve MMS ile sürekli DNA hasarı tedavi altında. Hücre başına farklı molekül ağırlıklı ya da kopya sayısının füzyon proteinleri için olan yöntemin uygulanması (Tartışma bölümüne bakınız) elde etme, farklı ayarları gerektirir. <ol><li> Iletilen ışık mikroskobu modunda hücrelerin yeni bir görüş alanı (FOV) bulun ve görüntü odak. Hücre anahatları (Şekil 4A) kaydetmek için bir kamera görüntüsünü alın.</li><li> Ortam ışıktan örnek kapak ve EMCCD kamera kazanç açın. </li><li> 561 nm lazer açın ve veri toplama başlamadan önce birkaç saniye için lamel hücresel otoflüoresanı ve arka plan noktalar çamaşır suyu. Hücreler için yetiştirilen ve M9 ortam içinde görüntülenmiş ve çok az floresan arka plan genellikle yoktur lamelleri yanmış kullanarak, ancak prebleaching örneğin LB olarak zengin Hücreler büyüme ortamı içinde görüntülenmesi için yararlı olabilir. Yoğun bir aydınlatma kadar prebleaching minimumda tutulmalıdır hücreler için toksik olduğuna dikkat edin. </li><li> 15.26 msn / karede sürekli 561 nm uyarma altında bir PALM film satın alma başlayın. </li><li> 405 nm lazer açın ve yavaş yavaş / cm 2 1 W kadar ulaşan, film boyunca yoğunluğunu artırabilir. Hücresel otoflüoresanı neden yüksek 405 nm şiddetleri kaçının. Floresan moleküllerin yoğunluğu dikkat - bu düşük aktivasyon oranları tutmak için önemlidir PSFs açıkça böyleHer bir çerçeve (Şekil 4D-F) izole edilmiştir. </li><li> 10,000 kare / film (hücre başına yansıması için moleküllerinin sayısına bağlı olarak) kaydedin; bir film tipik olarak 2-3 dakika sürer ve FOV boyutuna bağlı olarak sabit disk alanı 0.5-1 GB gerektirir. </li><li> Birden FOV için satın alma işlemi tekrarlayın. Her FOV PAmCherry flüoroforlar fotoaktive olsun, çünkü sadece bir kez görüntülenmiş ve geri dönüşümsüz beyazlatılmış unutmayın. </li></ol> 5. Veri Analizi Bir otomatik ve sağlam veri analizi çerçeve yönteminin performansı ve verimliliği için gereklidir. Biz MATLAB yazılmış özel yazılımı kullanın. <ol><li> Crocker et al. 12 &#39;de tarif algoritmaları kullanarak lokalizasyonu analizi yapın, Holden ve ark. 13 HoldenI et al. 14 ve Wieser et al. 15 PSFs ilk 7 piksel ile bir Gauss çekirdek kullanarak bir bant geçiren filtre görüntüde tespit edilirs çapı (Şekil 5A). Aday pozisyonları arka plan sinyali (Şekil 5B) ve 4.5 kat, standart sapma üzerinde olan en yüksek piksel yoğunluğunun PSFs karşılık gelir. Aday PSF başına lokal parlak piksel eliptik bir Gauss fonksiyonu (Şekil 5C) takılması için ilk tahmin olarak hizmet vermektedir. Serbest formda parametreler şunlardır: x-konumunda, y-konumunda, x-genişliği, y-genişliği, dönme açısı, genlik ve arka plan ofset. Eliptik Gauss maskesi PSF bulanıklaştırır ve deforme pozlama süresi sırasında molekül oluşturmaktadır. </li><li> Aynı FOV iletilen ışık mikroskobu görüntü üzerine PALM filmin bütün çerçeveler de elde edilen (x, y) lokalizasyonu çizilir. Pol1-PAmCherry Yerleşimleri E. merkezi alanı içinde görünmelidir coli hücreleri (Şekil 6A). Birçok lokalizasyonu hücrelerin dışında görünüyorsa, yerelleştirme eşiği çok düşük ayarlanmış veya numune arka plan floresan parçacıklar içeriyordu. </li><li> Otomatik izleme analizi için, Crocker et açıklanan algoritması MATLAB uygulama ark. 12. (Tartışma bölümünde &quot;Difüzyon analizi&quot; bakınız) kullanılabilir. Bir kullanıcı-tanımlı izleme penceresi içinde sonraki karelerde görünen pozisyonları bir yörünge oluşturmak için bağlanır. Çok bölgedeki aynı pencerede meydana durumda, parça benzersiz adım uzunlukları toplamı minimize tarafından atanır. Tek parçacık izleme verilerinden difüzyon katsayıları hesaplanırken çeşitli hususlar ayrıntılı bir tartışma için, Wieser vd. 15 bkz <ol><li> Algoritması bir parça sırasında geçici yanıp sönen veya cevapsız lokalizasyonu için hesap için bir bellek parametresini kullanır. Burada, 1 kare bellek parametresi; yüksek değerler uzun ömürlü koyu devletleriyle florosforlar izleme için kullanılabilir. </li><li> Aşağıdaki kalibrasyon adımları dayanan uygun bir izleme penceresi seçin. Pol1 için, 0.57 mikron (5 piksel) kullanabilirsiniz.</li><li> Pencere parametrelerini izleme aralığı için izleme algoritması çalıştırın. Parça (Şekil 6B) bölünmüş değildir mümkün olan en küçük izleme penceresi belirlemek için izleme penceresinin bir fonksiyonu olarak ölçülen, hücre başına parça sayısını hesaplayın. </li><li> Hücre içindeki molekül hareketinin dağılımını görselleştirmek için aynı FOV iletilen ışık mikroskobu görüntü üzerinde elde edilen parça çizilir. Pol1 parça tek hücre (Şekil 6C-D) içinde sınırlı difüzyon göstermesi gerekir. </li><li> Parça bir kısmı hücreler arasında çapraz görünüyorsa bu izleme penceresi çok büyük ve / veya fotoaktivasyon oranı (Şekil 6E) çok yüksek olduğu seçildi çünkü ayrı moleküller yanlışlıkla bağlantılı olduğunu göstermektedir. </li><li> Ardışık lokalizasyonu (Şekil 6F) arasındaki adım uzunluklarının kümülatif dağılımını çiziniz. Eğrisi yükselir ve yeterince büyük izleme pencereler için sorunsuz doyururPencere çok küçük seçildi eğer bir kesme kenarı gösterir. </li></ol></li><li> Pol1 difüzyon özelliklerini analiz etmek, N adımların toplamda her parça için ardışık yerleşimli arasındaki ortalama karesel deplasman (MSD)) hesaplamak: MSD = 1 / (N-1), i = 1 Σ N-1 (X i +1 - x i) 2 + (y i +1 - y i) 2. Sadece MSD değerleri istatistiksel belirsizliği azaltmak için en az 4 adım (N ≥ 5 yerelleştirmeler) ile izler içerir. </li><li> Birden fazla kare (Şekil 6G) üzerinde deplasmanları hesaplayarak lag kez aralığında MSD değerleri eğrisi çizilir. MSD eğrisinin şekli gözlenen moleküler hareket (Şekil 6H) sınıflandırmak için yardımcı olabilir. </li><li> MSD parça başına görünür difüzyon katsayısı D * hesaplayın: D * = MSD / (4 Dt) - loc 2 / ¨ t σ. İkinci term (Wieser vd. 15 bakın, burada σ loc = 40 nm ve Dt = 15.26 msn) tahmin yerelleştirme hata düzeltir. </li><li> FOV (Şekil 7A) Tüm parçalar arasındaki ölçülen D * değerleri bir histogram çizilir. </li><li> Parça başına ölçülen D * değere dayalı kromozoma bağlı görünen bireysel Pol1 molekülleri tanımlamak. Bağın popülasyonları ayırmak (merkezli keskin dağıtım D * ~ 0 mikron 2 / sn) ve D * &lt;0,15 mikron 2 / sn bir eşik ayarlayarak serbestçe difüzyon moleküller (geniş dağıtım D merkezli * ~ 0.9 mikron 2 / sn) ( Şekil 7A ve 7D) kırmızı barlar. </li><li> Hasarsız hücrelerinin (Şekil 7A-C) ve MMS (Şekil 7D-E) ile DNA hasarı tedavi altında hücrelerde lokalizasyonu, izleme, ve Pol1 için difüzyon analizi yürütmek. Ciltli parça fraksiyonu DN doğrudan sayısal olarak ölçülmesini sağlarIn vivo Pol1 bir onarım aktivitesi. </li></ol>

<ol><li>Friedberg, E. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFriedberg%2C+EC+%22DNA+Repair+and+Mutagenesis%22">DNA Repair and Mutagenesis</a>. , American Society for Microbiology. Washington, DC. (2006).</li>
<li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+spatial+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer spatial resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li>
<li>Mortensen, K. I., Churchman, L. S., Spudich, J. A., Flyvbjerg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+localization+analysis+for+single-molecule+tracking+and+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimized localization analysis for single-molecule tracking and super-resolution microscopy.</a> Nat. Methods. 7 (5), 377-381 (2010).</li>
<li>Manley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density+mapping+of+single-molecule+trajectories+with+photoactivated+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy.</a> Nat. Methods. 5 (2), 155-157 (2008).</li>
<li>English, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+investigations+of+the+stringent+response+machinery+in+living+bacterial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Single-molecule investigations of the stringent response machinery in living bacterial cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (31), (2011).</li>
<li>Subach, F. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivatable+mCherry+for+high-resolution+two-color+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Photoactivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy.</a> Nat. Methods. 6 (2), 153-159 (2009).</li>
<li>Uphoff, S., Reyes-Lamothe, R., Garza de Leon, F., Sherratt, D. J., Kapanidis, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+DNA+repair+in+live+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Single-molecule DNA repair in live bacteria.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110 (20), 8063-8068 (2013).</li>
<li>Datsenko, K. A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+inactivation+of+chromosomal+genes+in+Escherichia+coli+K-12+using+PCR+products%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (12), 6640-6645 (2000).</li>
<li>Reyes-Lamothe, R., Possoz, C., Danilova, O., Sherratt, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+positioning+and+action+of+Escherichia+coli+replisomes+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Independent positioning and action of Escherichia coli replisomes in live cells.</a> Cell. 133 (1), 90-102 (2008).</li>
<li>Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+medium+for+enterobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Culture medium for enterobacteria.</a> J. Bacteriol. 119 (3), 736-747 (1974).</li>
<li>Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+inclined+thin+illumination+enables+clear+single-molecule+imaging+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells.</a> Nat. Methods. 5 (2), 159-161 (2008).</li>
<li>Crocker, J. C., Grier, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+digital+video+microscopy+for+colloidal+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Colloid.+Interface.+Sci%22%5BJournal%5D)">Methods of digital video microscopy for colloidal studies.</a> J. Colloid. Interface. Sci. 179 (1), 298-310 (1996).</li>
<li>Holden, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+limits+of+single+molecule+FRET+resolution+in+TIRF+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Defining the limits of single molecule FRET resolution in TIRF microscopy.</a> Biophys. J. 99 (9), 3102-3111 (2010).</li>
<li>Holden, S. J., Uphoff, S., Kapanidis, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DAOSTORM%3A+an+algorithm+for+high-density+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">DAOSTORM: an algorithm for high-density super-resolution microscopy.</a> Nat. Methods. 8 (4), 279-280 (2011).</li>
<li>Wieser, S., Schütz, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+single+molecules+in+the+live+cell+plasma+membrane-Do%27s+and+Don%27t%27s%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Tracking single molecules in the live cell plasma membrane-Do's and Don't's.</a> Methods. 46 (2), 131-140 (2008).</li>
<li>Arnauld, S., Nicolas, B., Hervé, R., Didier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple-target+tracing+%28MTT%29+algorithm+probes+molecular+dynamics+at+cell+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Protoc.+Exch%22%5BJournal%5D)">Multiple-target tracing (MTT) algorithm probes molecular dynamics at cell surface.</a> Protoc. Exch. , Available from:
 
 <a target="_blank" href="http://dx.doi.org/10.1038/nprot.2008.128">http://dx.doi.org/10.1038/nprot.2008.128</a> (2008).</li>
<li>Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivatable+fluorescent+proteins+for+diffraction-limited+and+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Photoactivatable fluorescent proteins for diffraction-limited and super-resolution imaging.</a> Trends Cell Biol. (11), 555-565 (2009).</li>
<li>Elmore, S., Müller, M., Vischer, N., Odijk, T., Woldringh, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-particle+tracking+of+oriC-GFP+fluorescent+spots+during+chromosome+segregation+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-particle tracking of oriC-GFP fluorescent spots during chromosome segregation in Escherichia coli.</a> J. Struct. Biol. 151 (3), 275-287 (2005).</li>
<li>Badrinarayanan, A., Reyes-Lamothe, R., Uphoff, S., Leake, M. C., Sherratt, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+architecture+and+action+of+bacterial+Structural+Maintenance+of+Chromosome+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vivo architecture and action of bacterial Structural Maintenance of Chromosome proteins.</a> Science. 338 (6106), 528-531 (2012).</li>
</ol>

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarları var beyan.

Biz deney başarısı için birkaç önemli konuları tartışmak. Seçim ve floresan füzyon proteininin ifadesi: foto-aktifleştirilebilen ve photoswitchable floresan proteinleri 17 büyük bir palet bulunmaktadır. Özel seçim mikroskop özellikleri, mevcut özellikle lazerler ve filtreler bağlıdır. 405 nm ve 561 nm kombinasyonu yaygın ışıkla aktive floresan proteinleri için idealdir. Biz monomerik olduğu için PAmCherry 6 seçtik ve hücrelerde herhangi bir toplama gösterdi. Ayrıca, geri dönüşü olmayan bir foto-aktifleştirme hücre başına protein kopya sayısını ölçmek için aktif florofor sayısını sayma sağlar. Bunun yerine bir plazmidden füzyon proteini ifade nedeniyle, vahşi tip lokusta füzyon proteinini kodlayan genin kromozom ekleme tercih ederim. Bu floresan ettik ile ilgili proteinin tam yerine sağlarrsion ve vahşi tip ekspresyon seviyesini korur. Foto-aktifleştirme oranı: Bu ortalama hücre başına daha az bir molekül filmin herhangi bir çerçeve içinde floresan halde olduğu gibi foto-aktifleştirme hızını ayarlamak için önemlidir. Bu, 405 nm yoğunluğuna bağlıdır ve moleküllerin sayısı etkinleştirilmesini yaptı. Çok düşük görüntüleme yoğunluklarda, ancak, tüm moleküller filmin sonundan önce görüntülenmiş olacak ya da çok uzun bir film satın gerekir. Filmin kaydedilen çerçeve sayısı hücre başına füzyon proteinleri ve ikinci uyarma koşullarında PAmCherry ortalama ışıkla ağartma ömür boyu kopya sayısına bağlıdır. Pol1 ait kopya sayısı ~ 400 molekül / hücre 1 ile üstel ışıkla ağartma süresi dağılımının ortalama değeri ~ 4 kare olmuştur. Kademeli olarak 405 nm yoğunluğunu arttırarak, aktivasyon eşit filmin 10000 çerçeveler üzerinden dağıtılır. Bu nedenle, her bir hücre occupPSFs ve 10,000 kare bir film izleme komplikasyonların küçük üst üste sağlanması, ~ 1.600 kare bir toplam floresan moleküller ile ied. Pozlama süresi ve uyarım şiddetleri: En önemlisi, pozlama süreleri az hareket bulanıklığı ile keskin PSFs gözlemlemek için yeterince kısa olması gerekir. Ancak, kare hızı yerelleştirme belirsizlik ötesinde ardışık çerçeveler arasında gözlemlenebilir moleküler hareket verecek şekilde seçilmelidir, aksi takdirde önemli fotonlar takip oversampling tarafından israf edilmektedir. Bağlanmamış moleküllerinin hareketi lokalizasyonu belirsizlik nedeniyle bağlanan moleküllerin belirgin hareketi açıkça ayırt edilebilir olması için yeterince uzun bir zaman aralıklarında örneklenir gerekir. Maruz kalma süresi ayarlandığında, PSF şiddeti ayarlanabilir olmalıdır. PSF lokalizasyonu hassas bir çerçeve süresi boyunca algılanan fotonların sayısı ile artar. Yükseköğretim uyarma yoğunlukları foton emisyon oranı met artırmakt da photobleaching hızı ve arka plan sinyali. İstenilen yerelleştirme hassasiyet verir düşük uyarım yoğunluğunu kullanın. Pol1-PAmCherry için biz 15.26 msn / çerçeve ve 3,5 mW 561 nm uyarma (400 W / cm 2) seçti. Bu (Uphoff ve ark. 7 Tamamlayıcı bilgiler bakınız) veri toplama öncesi ve sonrası hücre büyümesini ve morfolojisi izleyerek belirli görüntüleme koşulları için hücre canlılığı teyit etmek önemlidir. Pol1 in vivo 7 aralıklı bir DNA alt tabakasına ~ 2 sn bağlayıcı bir zamanı sergiler; bu nedenle moleküllerin çoğunluğu bir parçanın tüm süre boyunca ilişkili veya ilişkisiz devlet ya olmasını bekliyoruz. Kromozom siteleri sitoplazmada Pol1 difüzyon (~ 1 mikron 2 daha difüzyon katsayı büyüklüğü alt birkaç siparişleri (~ 10 -5 mikron 2 / sn, Elmore ve diğ. 18) çünkü bağlı moleküller aslında hareketsiz görünür </skadar&gt; / sn). Difüzyon analizi: görünür difüzyon katsayısı D * tek tek parçaları MSD hesaplanır, istatistiksel hatayı azaltmak için 4 adımda (5 kare) az üzerinde ortalama. O ~ moleküllerinin% 75 tanımlanan görüntüleme koşulları için en az 5 kare içinde çamaşır suyu edin. Gibi kısa parçalar ilişkili ve ilişkisiz molekülleri ayırt etmek için yeterli istatistiksel kesinlik vermemektedir. Bununla birlikte, protein aktivitesi rapor bağlanmış ve bağlanmamış moleküllerinin nispi fraksiyonları analiz parçaların toplam sayısının bağımsızdır. Belirsizlik bir molekülün 15 her lokalizasyonu için belirgin bir rasgele adım ekler, çünkü D * hesaplanmasında PSF yerelleştirme hatası (σ loc) için hesap yararlıdır. Bağlı ve difüzyon moleküllerin sınıflandırılması artırmak için, D * bot hesaplanması tavsiyeİki çerçeve, zaman içinde tek aşamalı değiştirmeler ve yer değiştirmeler h. Bu iki ayrı D * eşikleri ayarlamak mümkün olur: D * (15 msn) &lt;0,15 mikron 2 / sn ve D * (30 msn) &lt;0.075 mikron 2 / sn. D * pozlama süresinde nedeniyle difüzyon bulanıklık parçaları ve hareket hücre hapsinde etkilenir belirgin difüzyon katsayısı olduğunu unutmayın. Doğru, tarafsız difüzyon katsayıları ayıklamak için, bir stokastik Brown hareketi modeli 5,7 dayalı simüle verilere gözlenen hareketini karşılaştırmak yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Simüle veriler de veri analizi prosedürlerini test etmek için kullanılır. Bu yöntemin olası uygulamalar: Bu kromozoma bağlanması üzerine bir proteinin hareketliliğinde değişiklik ile in vivo koşullarında protein-DNA etkileşim görselleştirme ve miktarının belirlenmesi için genel bir yaklaşım açıklanmıştır. DNA-ya da etkinlikleriOnarımında yer alan RNA bağlayıcı proteinler, replikasyon, transkripsiyon ve kromozom bakım böylece optik kırılma sınırın altında bir uzamsal çözünürlük ile tek-hücre seviyesinde gerçek zamanlı olarak takip edilebilir. Fotoaktive tek molekül izleme hücre başına birkaç işaretli moleküllerin kısıtlanır geleneksel izleme yöntemlerinin uzanır. In vivo moleküler difüzyon ölçen alternatif bir yöntem (sıkı bağlamak) Photobleaching sonra Floresan Kurtarma olduğunu. FRAP büyük hücreler küresel difüzyon özelliklerini ölçmek için çok yararlı olsa da, özellikle küçük bakteri hücreleri için, uzamsal olarak heterojen bir ortamda farklı hareketlilik ile çeşitli moleküler türlerin çözmek için yeteneği sınırlıdır. Bu DNA-bağlama aktiviteleri ve E içinde farklı protein bir dizi alt-hücresel lokalizasyon ölçmek için izleme ışıkla aktive edilen tek molekül uyguladık coli Pol1, DNA ligaz, FIS protein, DNA da dahil olmak üzerepolimeraz III 7, hem de kromozomlar protein MukB, E, ve F 19 yapısal bakımı. Bu yöntem aynı zamanda, diğer hücre tiplerine adapte edilebilir tahmin ediyoruz.

Bu protokol, Escherichia coli canlı hücreler protein-DNA etkileşimlerin doğrudan ölçülmesini anlatır. Bu kromozom (Şekil 1) bağlanan olarak teknik, tek bir floresan etiketli proteinin yayılma katsayısındaki bir değişiklik kullanır. Biz DNA polimeraz gecikmeli iplikçik çoğaltma ve eksizyon onarım yollar 1 DNA boşlukları doldurur I (Pol1), bir prototip DNA-bağlayıcı protein kullanmak yöntemini göstermek için. Süper çözünürlüklü floresan mikroskopi gelişi nanometre çözünürlükte hücrelerde moleküler yapıların görüntülenmesini sağlar. Fotoaktive Yerelleştirme Mikroskobu (PALM) bir floresan devlet (Şekil 2) için bir başlangıç ​​karanlık durumdan aktif edilebilir floresan proteinleri kullanır. Sadece, tüm işaretli moleküllerin bir alt kümesi, bağımsız bir şekilde t, sıralı bir şekilde konumlarını belirlemek için herhangi bir zamanda devreyeo örnek 2&#39;de işaretli moleküllerin konsantrasyonu toplam. Molekül başına lokalizasyonu hassas esas olarak floresan Point Spread Fonksiyonu (PSF) büyüklüğüne bağlıdır toplanmış, fotonların sayısı ve arka plan sinyali 3. Bu yöntemin bir çok uygulama hücresel yapıların görselleştirmenin geliştirilmesi üzerinde odaklanır. Izleme PALM tek molekül ile birleştirilebilir gerçekleştirilmesi 4, doğrudan canlı hücreler içinde etiketlenmiş proteinlerin rasgele sayı hareketini izlemek için yeni yollar açılmıştır. Artan duyarlılık ve floresan mikroskoplar zamansal çözünürlüğü şimdi bakteriyel sitoplazmada 5 tek difüzyon floresan proteinleri izlenmesine izin. Burada, PAmCherry, geri dönüşü olmayan 405 nm ışık 6 ile ışıma üzerine bir floresan duruma özelliğine sahip olmayan bir başlangıç ​​durumundan dönüştüren bir mühendislik floresan proteini kullanır. Aktive PAmCherry flüoroforlar görüntü olabilir561 nm uyarma ve photobleaching kadar birkaç kare için izlenen tarafından d. Biz Pol1 ve PAmCherry bir füzyon kullanan tek proteinlerin geçici DNA-bağlama olayları tanımlamak için yöntemin yeteneğini göstermektedir. Metil metansülfonat (MMS) ile hücrelerin tedavisi baz eksizyon onarım enzimleri ile aralıklı DNA alt tabakalar haline getirilmiştir DNA metilasyon hasara neden olur. Bizim yöntem MMS hasara 7 yanıt tek Pol1 moleküllerin bağlanma açıkça göstermektedir.

<table><tbody><tr>Lambda>Red <td>rekombinasyonu</td>MEM amino <td>asitleri tarafından oluşturulan bir PAmCherry DNA bağlayıcı füzyon proteini için kromozomal bir ekleme taşıyan <emE. coli suşu</td> Invitrogen 11130-051 minimal orta takviyesi MEM vitaminleri Invitrogen 11120-052 minimal orta takviyesi Agarose BioRad 161-3100 <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>sertifikalı moleküler biyoloji sınıfı</td></tr><tr><td>Mikroskop lameller No 1.5 kalınlık</td><td>Menzel</td><td>BB024060SC</td><td>slaytları fırında 500 ° C'de ısıtarak arka plan parçacıklarını çıkarın; 1 saat boyunca C</td></tr><tr><td>Metil metansülfonat (MMS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>129925</td><td>DİKKAT:</td></tr><tr><td>Uphoff et al.7MATLAB'da açıklanan</td> <td>toksik</td><td></td><td>PALM kurulumu</td></tr> Veri <tr><td></td><td>analizi ve görselleştirme için</td><td>MathWorks</td><td></td></tr><tr><td>Yerelleştirme yazılımı</td><td>Özel olarak yazılmış, çevrimiçi</td> <td>olarak mevcutturhttp://www.physics.ox.ac.uk/Users/kapanidis/Group/Main.Software.html</td><td>Yerelleştirme analizi için uyarlanabilen MATLAB ve C++ yazılım paketi. Yayında kullanılıyorsa, Holden et al.13 alıntı yapın.</td></tr><tr>Çevrimiçi <td>olarak sunulan</td> <td>izleme yazılımı</td><td><a href="http://physics.georgetown.edu/matlab/">http://physics.georgetown.edu/matlab/</a></td><td>Blair ve Dufresne tarafından MATLAB uygulaması. Alıntı Crocker & Grier12 yayında kullanılıyorsa.</td></tr></tbody></table>

fotoaktive tek molekül takip kullanma canlı bakteriyel hücrelerde protein-dna etkileşimleri görselleştirme

Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking

Protein-DNA etkileşimleri birçok temel hücresel süreçlerin merkezinde yer alıyor. Örneğin, DNA replikasyonu, transkripsiyon, onarım ve kromozom organizasyon In vitro deneyler, DNA-bağlayıcı proteinlerin birçok çeşit fonksiyonu için ayrıntılı modeller oluşturmak için yardımcı olmuştur. Spesifik DNA yapıları ya da dizileri tanıyan DNA bağlayıcı proteinler tarafından yönetilir, henüz edilir , canlı hücresinin karmaşık ortamda bu süreçlerin ve onların örgütün kesin mekanizmaları çok daha az anlaşılır kalır. Yakın zamanda Fotoaktive Localization Mikroskopisi tek molekül izleme ile birleştirilmiş (PALM) kullanılarak canlı Escherichia coli hücrelerinde DNA tamir faaliyetleri ölçülmesi için bir yöntem geliştirmiştir. Bizim genel yaklaşım kromozomu ile dernek üzerine tek bir proteinin hareketlilik değişiklikle bireysel DNA-bağlama olayları tanımlar. Bağlı moleküllerinin protein fraksiyonu hareket için bir doğrudan niceliksel ölçümünü sağlartek hücre düzeyinde ivity ve alt-tabakalar ya da bağlanma siteleri bolluk. Burada, biz yöntemi kavramını açıklamak ve örnek hazırlama, veri toplama ve veri analizi işlemlerini göstermektedir.

In vivo olarak, protein-DNA etkileşimlerini incelemek için izleme ışıkla aktive edilen tek bir molekül kavramı, Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir. PAmCherry füzyon proteinleri, canlı E&#39;de algılanır Bir seferde, hücre başına daha az bir molekül bir frekansta 405 nm ışık ile davranışsal tek moleküller, ışıkla aktive olan bir sıralı bir şekilde coli hücreleri. Aktive moleküller sürekli 561 nm uyarma altında görüntülenmiş. Hücrede moleküler hareketin geri dönülmez ağartmanın kadar bir dizi kare yakındaki bölgeselleştirmelerini bağlayarak izlenebilir. DNA bağlayıcı proteinlerin difüzyon kromozom bağlanması üzerine yavaşlatıldığı için, D * iz başına elde edilen, görünen yayılma katsayısının doğrudan bireysel protein-DNA etkileşim ve raporlar. Şekil 2, canlı E&#39;de Pol1-PAmCherry füzyon proteinlerinin foto-aktifleşmesini gösteriyor coli hücreleri. O 405 nm yoğunluğunun etkisin floresan moleküllerin yoğunluğu, Şekil 4&#39;te görülebilir. Yoğunluk sadece 405 nm yoğunluğu ile ancak ek aktivasyonu için kullanılabilir moleküllerin sayısına göre belirlenir değil unutmayın; kalan moleküllerin havuzu PALM film boyunca tüketilir. Lokalizasyon analizi Şekil 5&#39;te gösterildiği gibi bir PALM filmin her bir çerçevesi için gerçekleştirilir. Bu canlı hücrelerde, sabit hücrelerde veya bağlı moleküllerinde hareketsiz molekülleri kullanarak lokalizasyonu hassas ölçülür. Bizim satın alma ayarları teorik tahmini 3 ile anlaşarak, σ loc = 40 nm bir yerelleştirme kesinlik verdi. Elde edilen Pol1 lokalizasyonları genel olarak E uzaysal organizasyonu yansıtan, hücrenin merkezi alan (Şekil 6A) işgal coli 7 nucleoid. Pol1 çoğunluğu dif ekran hasar görmemiş hücrelerde izlerŞekil 6C&#39;de gösterildiği gibi füzyon. Tipik bir hücre E başına yaklaşık 400 Pol1 moleküllerinin kopya sayısı ile uyumlu birkaç yüz Pol1 parça (Şekil 6D) içerir . coli hücre 1. 6B ve Şekiller 6E-F, uygun bir izleme penceresi parametresini seçiminde rehberlik - izleme penceresi çok büyük ise, farklı moleküller yanlışlıkla bir parçaya bağlı olma olasılığı daha yüksektir; izleme penceresi çok küçük ise, parça uzun adımlarla bölünecektir. Pol1 için MSD eğrisi hücre hapsi (Şekil 6G) nedeniyle daha uzun gecikme süreleri kısa gecikme süreleri ve saturatları için doğrusal yükselir. Moleküler hareket farklı türleri MSD analizi ile tespit edilebilir. Directed hareket parabolik eğri verir, Brown hareketi düz bir çizgi ile karakterize edilir, kapalı difüzyon eğri bir düzlüğe ulaşır; hareketsiz parçacıklar için MSD eğrisinin bir kaydırmada l temsil ederocalization belirsizlik (Şekil 6H). Tek parçacık izleme ve sorun giderme ipuçları hakkında ek bilgi Arnauld vd. 16 bulunabilir Daha önce eksojen DNA alkilleme hasarı 7 yanıt olarak Pol1 DNA onarım aktivitesini ölçmek için yöntem uygulanır. Pol1 of D * histogram molekülleri (Şekil 7A-C) difüzyon baskın bir nüfus gösterir hasar görmemiş hücrelerde izler. % 2.7 bağlı Pol1 moleküllerinin küçük bir kısmı muhtemelen gecikmeli iplikçik çoğaltma ve endojen DNA hasarının onarımı yer almaktadır. Sürekli 100 mM MMS hasar altında,% 13.8 (Şekil 7D) D * ~ 0 mikron 2 / sn artış ile parça nüfusu. Bu izler baz eksizyon tamir yolunun bir parçası olarak tek nükleotid boşlukları doldurmak için DNA onarım sentezini gerçekleştirerek bireysel Pol1 moleküllerini temsil eder. Ciltli parça pozisyonları bireysel konumlarını göstermekDNA hasarı ve onarımı siteleri (Şekil 7E-F). <img alt="Şekil 1" fo:content-width="2.5in" src="/files/ftp_upload/51177/51177fig1highres.jpg" width="300" /> Şekil 1. Yöntemin grafik gösterimi. (A) floresan protein PAmCherry 405 nm ışık ile ışıma üzerine özelliğine sahip olmayan bir başlangıç ​​durumundan ışıkla aktive edilebilir. Parlak devlet 561 nm heyecanlı ve geri dönüşümsüz flüoroforun ağartıcılarının kadar 600 nm civarında floresan yayar. (B) fotoaktivasyon oranını kontrol sağlar görüntüleme herhangi bir zamanda yalnızca hücre başına tek bir davranışsal aktive PAmCherry füzyon proteini karanlık durumunda kalır henüz aktif edilmemiş ya da zaten ağartılmış moleküllere keyfi büyük havuz ise. (C) floresan molekülünün pozisyon izole PSF ve tr merkezinden belirlenirPhotobleaching kadar birkaç kare için acked. Birçok moleküllerin (D) parçalar sıralı bir şekilde kaydedilir. (EF), bir kromozom hedef sekans veya yapı ile bir DNA bağlayıcı proteinin etkileşim rastgele dağılan hareketi durur. Bağlanmış ve bağlanmamış molekülleri D * bir parça elde görünen yayılma katsayısı ile ayırt edilir. Bağlı moleküllerinin elde edilen fraksiyon, in vivo olarak bir DNA bağlayıcı proteinin aktivitesi için bir nicel ölçü verir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51177/51177fig1highres.jpg" target="_blank">büyük resim görüntülemek için.</a> <img alt="Şekil 2," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51177/51177fig2highres.jpg" width="600" /> Şekil 2. Canlı E. Pol1-PAmCherry Foto-aktifleştirme bölgesinin coli hücreleri. Ölçek çubukları: 1 mikron. Şemalar her panelin altında gösterilmiştir. (<html> A) agaroz pad üzerinde hareketsiz hücrelerin ışık mikroskobu görüntüsü Bulaşan. (B) bir hücre içinde, tek bir PAmCherry flüorofor Phototactivating. (C) daha yüksek bir kuru foto-aktifleştirme flüoresan moleküllerinin sayısını artırır. (D) Bir PALM film Entegre PAmCherry floresan. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51177/51177fig2highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın.</a> <img alt="Şekil 3," fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51177/51177fig3highres.jpg" width="400" /> Şekil 3,. Işıkla aktive olan ve görüntüleme PAmCherry füzyon proteinleri için bir asgari PALM kurulum şematik D1:. Dikroyik ayna (örneğin 550 nm uzun geçiş). D2: Dichroic ayna (örneğin 570 nm uzun geçiş). L1: Ayarlama merceği. L2: TIR lens. L3: Tüp lens.1177/51177fig3highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın. <img alt="Şekil 4," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51177/51177fig4highres.jpg" width="500" /> Şekil 4. . 15.26 msn / çerçeve Ölçek çubukları ile bir PALM film Temsilcisi görüntüler: 1 mikron. (A) agaroz pad üzerinde hareketsiz hücrelerin ışık görüntüsünü Bulaşan. (B) lazerler ile EMCCD kamera ölçülen karanlık arka plan görüntüsü kapatılır. Fotoaktivasyonu önce sürekli 561 nm uyarma altında (C) Uyarma arka plan görüntüsü. (DF) Artmış 405 nm yoğunluğu sürekli 561 nm uyarma altında görüntülü PAmCherry yüksek fotoaktivasyon oranlarına yol açar. Kutulu alanlar aşağıda büyütülmüş gösterilmiştir. (D) Düşük 405 nm yoğunluğu (&lt;1 μW) aktif FOV başına çok az floresan moleküller. (E) Orta 405yerelleştirme ve izleme analizleri için iyi bir PSF yoğunluğu nm yoğunluğu (~ 2 μW) fotoaktivasyon sonuçları. (F) Yükseköğretim 405 nm yoğunluğu (~ 10 μW) yerelleştirme ve izleme analizleri karartan bazı hücrelerde birden fazla floresan molekülü harekete geçirir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51177/51177fig4highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın.</a> <img alt="Şekil 5," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51177/51177fig5highres.jpg" width="500" /> Şekil 5,. Yerelleştirme analizi İllüstrasyon. Ölçek çubukları: 1 mikron (A) Band-pass filtreleme sahte piksel gürültü kaldırır ve FOV genelinde yoğunluk Degradeleri düzleşir.. (B) Aday PSFs yanlış pozitif ve yanlış negatif algılamaları en aza indirmek için seçilmiş olan bir kullanıcı-tanımlı eşik dayalı filtrelenmiş görüntü tespit edilmiştir. Threshold arka standart sapma (sinyal-gürültü oranı, SNR) bölünmesiyle elde edilen bir aday pikselin en az yoğunluğuna karşılık gelir. (C) eşik iki boyutlu eliptik Gauss oturması için ilk yerelleştirme tahmin (turuncu çapraz) olarak hizmet geçer yerel parlak piksel. Ölçek çubukları: 0,5 mikron. Oluşan süper çözünürlük yerelleştirme (mavi çapraz) σ loc ortalama hassasiyete sahiptir = 40 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51177/51177fig5highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın.</a> <img alt="Şekil 6," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51177/51177fig6highres.jpg" width="500" /> .. Izleme analizi Şekil 6 İllüstrasyon Ölçek çubukları: 1 mikron. (A) bir örnek hücre içinde Pol1-PAmCherry her tespit lokalizasyonu. (B) iz sayısı tespitİzleme penceresinin bir fonksiyonu olarak, örneğin hücrede ed. Küçük izleme pencereleri parça yüksek sayıda artifaktüel yol açar molekül yörüngeleri, bölünmüş. Kesikli çizgi izleme penceresi parametresi (0.57 mikron, 5 piksel) bizim seçim gösterir - bu adımları tam dağılımını tespit ve sağlam farklı moleküllerin yörüngeleri tutmak arasında iyi bir uzlaşma sağlar. Tek Pol1-PAmCherry molekülünün (C) Örnek parça. (D) rastgele renklerle gösterilen tüm ölçülen izler. Izleme penceresi seçilmiş ise (E) İzleme eserler (burada 0.8 um, 7 piksel) veya kare başına PSFs yoğunluğu çok yüksek, çok büyük. Izleme pencereler için adım uzunlukları (F) kümülatif dağılımları: 0.34 mikron (3 piksel, kırmızı çizgi), 0.57 mikron (5 piksel, mavi çizgi), ve 0.80 mikron (7 piksel, yeşil hat). 0.34 mikron izleme penceresi 0,34 mikron daha uzun adımlar keser unutmayın ki açıkçaadımların tam dağılımını keser. 0.80 mikron izleme penceresi olduğu gibi 0.57 mikron izleme penceresi adımlar hemen hemen aynı dağılımı algılar. (G) MSD eğri Pol1 sınırlıydı difüzyon gösterir. Yönlü hareketi, Brown hareketi, sınırlı difüzyon ve hareketsiz partiküller için (H) şematik MSD eğrileri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51177/51177fig6highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın.</a> <img alt="Şekil 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51177/51177fig7highres.jpg" width="500" /> Şekil 7. Canlı E. Pol1 DNA tamir aktivitesinin doğrudan ölçümü . coli hücreleri Ölçek çubukları: 1 mm. (A) bir hasar görmemiş hücrelerin FOV (N = 4162 parça) 4 veya daha fazla adım tüm parçalar için görünür difüzyon katsayısı D * Histogram. B olarak sınıflandırılan moleküllerinin popülasyonunun<html> ound kırmızı vurgulanır. Pol1-PAmCherry (BC), parçalar iletilen ışık mikroskobu görüntü üzerinde gösterilmiştir. Kendi difüzyon katsayısı göre bağlı olarak sınıflandırılan parçalar kırmızı ile gösterilmiştir. (D) D * (N = 2128 parça) görüntüleme önce 100 mM MMS ile bir agaroz ped üzerinde immobilize edilir ve 20 dakika inkübe edilen hücrelerde ölçülen Pol1 parçaları için histogram. DNA tamir yapan bağlı moleküllerin nüfusu kırmızı gösterilir. (EF) Pol1-PAmCherry kırmızı tek Pol1 DNA onarım olayların izlerini gösteren iletilen ışık mikroskobu görüntüde izler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51177/51177fig7highres.jpg" target="_blank">resmi büyütmek için buraya tıklayın.</a> <img alt="Video 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51177/video.jpg" width="400" /> Film 1. Bir ısmarlama PALM kurulum bina.JoVE_Uphoff_Movie1.avi &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Videoyu izlemek için buraya tıklayın.

Tek molekül izleme ile kombine Fotoaktive yerelleştirme mikroskobu (PALM) verir canlı Escherichia coli hücrelerinde protein-DNA etkileşimleri doğrudan gözlem ve ölçümü.

Fotoaktive Tek molekül Takip Kullanma Canlı Bakteriyel Hücrelerde Protein-DNA Etkileşimleri görselleştirme

Protein-DNA interactions are at the heart of many fundamental cellular processes. For example, DNA replication, transcription, repair, and chromosome ...

Bu prosedürün genel amacı, canlı bakteri hücrelerindeki DNA bağlayan proteinlerin aktivitesini doğrudan görüntülemek ve niceliksel olarak belirlemektir. Bu işlem, ilgilenilen bir DNA bağlayan proteine füzyonlanmış, foto-aktive edilebilir floresan bir protein eksprese eden hücrelerin görüntülenmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, görüntüleme sırasında foto-aktivasyona uğrayan tekil proteinlerin bir videosunun kaydedilmesidir.Ardından, protein lokalizasyonlarını belirlemek ve tekil hücreler içindeki proteinleri takip etmek için veriler analiz edilir. DNA bağlanma olayları, tekil proteinlerin kromozomlarla temas ettiklerinde difüzyon katsayılarındaki değişimle tanımlanır. Nihayetinde sonuçlar, hücre başına bağlanan ve difüzyon halindeki proteinlerin sayısı sayılarak, tekil hücre düzeyindeki protein-DNA etkileşimlerine ilişkin kantitatif bir ölçüm sağlayabilir.Bu yöntem, DNA onarım alanındaki in vivo onarım hızları ve onarım bölgelerinin uzaysal dağılımı gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Şimdi, canlı e coli hücrelerindeki DNA polimeraz bir'in onarım aktivitesini ölçerek yöntemi uygulamalı olarak göstereceğiz. Öncelikle, bir fırında 500 °C'de bir saat boyunca, arka planda floresan partikül içermeyen lameller hazırlayın. 1,5 numaralı kalınlıktaki lamellerden bir stok hazırlayıp bunları alüminyum folyo içerisinde oda sıcaklığında saklayın.Bunlar önümüzdeki haftalar boyunca kullanılabilir. Ardından, AB 1157 poly a PA m cherry suşundan erken eksponansiyel fazdaki 1 mL E coli'yi 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde konsantre edin. Hücreleri 2.300 G'de beş dakika boyunca santrifüje tabi tutun.Süpernatantı uzaklaştırın ve hücre peletini 20 µL artık besiyerinde yeniden süspande edin, ardından hücreleri çözeltiye getirmek için vorteksleyin. Daha sonra, distile su içerisinde %1,5 düşük floresanlığa sahip aros çözeltisi hazırlayın. Metil metan sülfonat veya MMS kullanılarak yapılacak DNA hasarı deneyleri için gerekli önlemleri alarak, eritilmiş aros'un 500 µL'sini 500 µL iki kat konsantrasyonlu minimal besiyeri ile birkaç kez nazikçe pipetleyerek karıştırın.Karışım soğumadan önce, 500 mikrolitre minimal besiyerine 8.3 mikrolitre MMS ekleyin ve ardından bunu aros ile karıştırın. Yakılmış bir lam üzerine yayın. Hava kabarcığı oluşturmadan, merkezi ve eşit bir şekilde yayın.Pedini ikinci bir yakılmış lamelle düzleştirin. Soğuduktan sonra, pedin üzerindeki üst kapağı kaldırın ve bir mikrolitre konsantre hücre süspansiyonu ekleyin. Pedin üzerini yeni bir yakılmış lamelle kapatıp çok nazikçe bastırarak hücreleri immobilize edin.Hücreler, kurumadan önce 45 dakika içerisinde görüntülenmelidir. Bu süreyi uzatmak için, DNA Hasarı deneylerinde ped, bir silikon contanın içine mühürlenebilir. Hücreleri görüntülemeden önce, onları ped üzerinde 20 dakika boyunca inkübe edin.Oda sıcaklığındaki nemlendirilmiş bir kap içerisinde bulunan mikroskop, 405 nanometrelik bir fotoaktivasyon lazerine ve 561 nanometrelik bir eksitasyon lazerine sahiptir. Yüksek eğimli aydınlatma kullanılarak yalnızca lam yüzeyinin üzerindeki ince bir kesitte bulunan floroforların uyarılmasıyla tek molekül hassasiyetine ulaşılır ve floresans emisyonu, elektron çarpanlı bir CCD kamera ile kaydedilir. Numuneyi mikroskop tablasına yerleştirin ve hücreleri odaklayın.Geçirgen ışık aydınlatması altında, veri boyutunu azaltmak ve kamera okuma hızını artırmak için kırpılmış bir görüş alanı belirleyin. Numuneyi ortam ışığından koruyun ve tekil florofor tespiti için elektron çarpanlı CCD kamera kazancını açın. Kare hızını kare başına 15,26 milisaniye olarak ayarlayın.Bu, 0,26 milisaniyelik kamera okuma süresini de içermektedir. Pozlama süreleri, çok az hareket bulanıklığıyla net floresan lekeler gözlemleyebilmek için yeterince kısa olmalıdır. Öte yandan, bağlı molekülleri difüzyona uğrayan moleküllerden net bir şekilde ayırt edebilmek için izlerin yeterince uzun zaman aralıklarıyla örneklenmesi gerekir. Şimdi, karanlık arka plan sinyalini kontrol etmek için kamera verilerini görüntüleyin.561 nanometre lazeri açın ve eksitasyon arka plan sinyalini kontrol edin. Paul one PA M cherry füzyon proteinlerinin fotoaktivasyonu için 405 nanometre lazeri açın ve tek moleküllerin floresan lekeleri görünene kadar yoğunluğu artırın. Şimdi, örneğin yalnızca ince bir kesitini aydınlatmak için eksitasyon ışınının açısını ayarlayın.Kapak camı yüzeyini kapatın. Bu yöntem, tekil floresan proteinlerin tespitine ve hassas lokalizasyonuna dayalı olduğundan, mikroskobun optimal hizalaması ve hassasiyeti veri kalitesi açısından kritik olacaktır. Bu amaçla, lazer ışınını 100 x sayısal açıklığı 1.4 olan bir objektifin arka odak düzlemine odaklayın.Odaklama lensini ışına dik olarak ötelemek, odağı objektifin merkezinden uzaklaştırarak ışının objektiften belli bir açıyla çıkmasına neden olur. Işını, floresan yoğunluğunu maksimize edecek ve arka planı minimize edecek şekilde ayarlayın. Geçirme ışığı mikroskopi modunda hücrelerin yeni bir görüş alanı bulun ve görüntüyü odaklayın.Hücre dış hatlarını kaydetmek için kamera ile bir görüntü alın. 561 nanometre lazeri açın ve hücresel otoflorese ile lam üzerindeki arka plan lekelerini birkaç saniye boyunca beyazlatın.Veri toplama işlemine başlamadan önce, sürekli 561 nanometre eksitasyon altında bir PALM filmi kaydını başlatın. 405 nanometre lazeri açın ve filmin ilerleyişi boyunca yoğunluğu kademeli olarak artırarak santimetrekare başına bir watt seviyesine ulaşın. Hücresel otofloresansa neden olan daha yüksek 405 nanometre yoğunluklarından kaçının.Floresan moleküllerin yoğunluğuna dikkat edin. Floresan noktalarının her karede net bir şekilde izole olması için aktivasyon oranlarının düşük tutulması önemlidir. Her film için yaklaşık 10.000 kare kaydedin; bu işlem, kırpılmış bir görüş alanı ile tipik olarak üç dakikaya kadar sürer ve bir gigabayta kadar sabit disk alanı kaplar.Bir görüş alanı görüntülendikten sonra, pa m cherry floroforlarının geri dönüşümsüz olarak ağardığını ve tekrar gözlemlenemeyeceğini unutmayın. Yine, aşağıdaki prosedür matlab'deki özel bir yazılımı kullanmaktadır. Tekil floroforlar, nokta yayılım fonksiyonları veya psf'ler olarak görünür.Videoda, psf'ler ilk olarak yedi piksellik çapa sahip bir Gauss çekirdeği kullanılarak bant geçiren filtreli bir görüntüde tanımlanır; aday konumlar, piksel yoğunlukları arka plan standart sapmasının 4,5 katı üzerinde olan PSF'lere karşılık gelir. Her bir aday PSF için yerel olarak en parlak piksel, eliptik bir Gauss fonksiyonunun uydurulması (fitting) için başlangıç tahmini olarak kullanılır. Serbest uyum parametreleri X konumu, Y konumu, X genişliği, Y genişliği, rotasyon açısı, genlik ve arka plan kaymasıdır.Eliptik Gauss maskesi, PSF grafiğini bulanıklaştıran ve deforme eden pozlama süresi boyunca gerçekleşen molekül hareketini hesaba katar. PALM filminin tüm karelerinden elde edilen sonuç XY lokalizasyonları, aynı görüş alanının iletim ışığı mikroskopi görüntüsü üzerine yerleştirildiğinde, PALM-Cherry lokalizasyonları E. coli hücrelerinin merkez alanında görünmelidir. Otomatik takip protein hareketini ölçer, ancak takip penceresinin doğru seçilmesi kritik öneme sahiptir.Öncelikle, bir dizi izleme penceresi parametresi için izleme algoritmasını çalıştırın. İzlerin bölünmediği mümkün olan en küçük izleme penceresini belirlemek için hücre başına ölçülen iz sayısını izleme penceresine karşı grafiğe dökün ve sonuçlanan izleri aynı görüş alanının iletim ışığı mikroskopi görüntüsü üzerinde görüntüleyin. Hücre içindeki molekül hareketinin uzamsal dağılımını görselleştirmek için, tekil hücreler içinde sınırlı difüzyon gösteren izler görüntülenmelidir; eğer izlerin bir kısmı hücreler arasında geçiş yapıyor gibi görünüyorsa, bu durum izleme penceresinin çok büyük seçildiğini ve/veya fotoaktivasyon hızının çok yüksek olduğunu, dolayısıyla ayrı moleküllerin hatalı bir şekilde birbirine bağlandığını gösterir.Ardışık lokalizasyonlar arasındaki adım uzunluklarının kümülatif dağılımını çizin. Eğri, yeterince büyük takip pencereleri için sorunsuz bir şekilde yükselir ve doygunluğa ulaşır; ancak pencere çok küçük seçilmişse bir kesme kenarı gösterir. Uygun bir takip penceresi seçildikten sonra, Paul one'un difüzyon özellikleri analiz edilebilir.n toplam adım içeren her iz için ardışık lokalizasyonlar arasındaki ortalama kare yer değiştirmeyi veya MSD'yi hesaplayın; MSD'nin istatistiksel belirsizliğini azaltmak için yalnızca en az beş lokalizasyona sahip izleri kullanın. Ardından, MSD üzerinden iz başına görünür difüzyon katsayısını hesaplayın. İkinci terim, tahmin edilen lokalizasyon hatasını düzeltir.Bunlar ikinci terim için olan değerlerdir. Bu örnekte, hasarsız hücrelerdeki pol one ve MMS ile DNA hasarı tedavisi altındaki hücrelerdeki pol one için görüş alanındaki tüm izlerden ölçülen difüzyon katsayısı değerlerinin bir histogramını çizin; kırmızı çubuklar, kromozoma bağlı olduğu görünen ve saniyede 0,15 mikronkareden daha düşük bir hızla difüze olan bireysel pol one moleküllerinin popülasyonunu tanımlar. Buna karşılık, serbestçe difüze olan moleküller saniyede yaklaşık 0,9 mikronkare civarında hareket eder.Bağlanmış Pol I molekülleri tanımlandıktan sonra, bağlanma bölgelerinin konumları hasarsız hücrelerde ve MMS hasarlı hücrelerde görselleştirilebilir. Bağlı izlerin toplam gözlemlenen iz sayısına oranı, pol'un DNA onarım aktivitesinin doğrudan nicel bir ölçütünü sağlar.Canlı E. coli hücrelerinde, pol one PA m cherry füzyon proteinlerinin in vivo fotoaktivasyonu gerçekleştirilmiştir. Fotoaktivasyon, tek bir hücredeki tek bir PA m cherry floroforu ile sınırlandırılmış olabilir; daha yüksek fotoaktivasyon oranları daha fazla floresan molekülün ortaya çıkmasını sağlamıştır. Bir PALM videosunun her bir karesi için lokalizasyon analizi yapılmıştır.Hassasiyet, fikse edilmiş hücrelerdeki hareketsiz moleküller veya canlı hücrelerdeki bağlanmış moleküller kullanılarak ölçülmüş ve teorik öngörüyle uyumlu olarak 40 nanometre olarak bulunmuştur. Ardından, çok düşük olduğunda lokalizasyon eşiği ayarlanmıştır. Arka plan gürültüsündeki rastgele pikler yanlışlıkla aday konumlar olarak seçilmiş, eşiğin çok yüksek olması durumunda ise bazı noktalar atlanmıştır.Elde edilen Paul one lokalizasyonları hücrenin merkezi bölgesini kaplayarak, e coli nükleoidinin uzamsal organizasyonunu genel hatlarıyla yeniden yansıtmıştır. Hasarsız hücrelerdeki Paul one izlerinin çoğunluğu difüzyon göstermektedir. Tipik bir hücre, e coli hücresi başına yaklaşık 400 Paul one molekülü olan kopya sayısı ile uyumlu olacak şekilde, birkaç yüz Paul one izi içermektedir.Farklı moleküler hareket türleri, bir dizi gecikme süresi boyunca MSD değerleri hesaplanarak belirlenebilir; yönlendirilmiş hareket parabolik bir eğri verir. Brown hareketi düz bir çizgi ile karakterize edilir. Sınırlı bir difüzyon eğrisi bir platoya ulaşır ve hareket etmeyen partiküller için MSD eğrisinin sapması lokalizasyon belirsizliğini temsil eder.Paul one için elde edilen MSD eğrisi, brownian harekete işaret eden kısa gecikme süreleri için doğrusal olarak yükselmiş ve hücre hapsi nedeniyle daha uzun gecikme sürelerinde doygunluğa ulaşmıştır. Bu yöntemler kullanılarak, hasarsız hücrelerde eksojen DNA alkilasyon hasarına yanıt olarak Paul one'un DNA onarım aktivitesi ölçülmüştür. Paul one'un difüzyon katsayısı histogramı, difüze olan moleküllerden oluşan baskın bir popülasyon göstermektedir.Sınırlı sayıdaki bağlı molekül, sürekli 100 milimolar MMS hasarı altında endojen DNA hasarının onarımında ve DNA replikasyonunda rol oynuyor olabilir. Sıfıra yakın difüzyon katsayılarına sahip izlerin sıklığı önemli ölçüde artmaktadır. Bu durum, mutajen varlığında DNA onarımına daha fazla Paul one molekülünün katılması gerektiği modelini desteklemektedir. Bu prosedürün ardından.Hücre içindeki proteinlerin uzaysal dağılımını nicelleştirmek ve DNA onarımında yer alan daha büyük protein komplekslerinin varlığını incelemek amacıyla lokalizasyon ve kümelenme gibi diğer veri analiz yöntemleri uygulanabilir.

visualizing-protein-dna-interactions-live-bacterial-cells-using

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Burada izlenir ve sayısal, fonksiyonel moleküler kompleksler tespit sağlamak için canlı bakteri hücreleri tek-molekül floresan mikroskopi gerçekleştirmek için protokolleri göstermektedir.

Tek Moleküler Kompleksleri görselleştirme In Vivo Gelişmiş Floresan Mikroskopi

Kaynak: Bratton, B. P. ve ark., Doğru hücresel temsiller ve hassas protein lokalizasyonu için bakteriyel hücrelerin üç boyutlu görüntülemesi. J. Vis. Exp. (2019)Bu video, tek hücre düzeyinde protein organizasyonunu incelemek için bakteriyel hücrelerin üç boyutlu floresan görüntülerini edinme ve analiz etme yöntemini göstermektedir.

Floresans görüntüleme ile bakteriyel protein dağılımının üç boyutlu görselleştirilmesi

Video, floresan proteinler, bir donör eGFP ve alıcı mCherry ile etiketlenmiş sitoplazmik proteinleri eksprese eden canlı bakterilerde protein-protein etkileşimini belirlemek için FLIM-FRET görüntüleme tekniğini açıklar. Kombine teknik ayrıca etkileşen proteinlerin miktarının belirlenmesine de izin verir.

Canlı Bakterilerde Protein-Protein Etkileşimlerinin Karakterizasyonu için FLIM-FRET Görüntüleme

Burada iki optik kapalı kalmış mikro-arasında asılı tek bir DNA molekülü ile etkileşim tek floresan etiketli protein molekülü tespit etmek için cihazları ve yöntemleri tarif etmektedir.

Protein-DNA Etkileşiminin Çalışmaları Tek molekül Manipülasyon ve Görüntüleme birleştiren

Polietilen glikol (PEG) ve avidin kaplı cam yüzeye bağlanmış ve mikroakışkan kesme akışlarıyla gerilmiş floresan protein DNA bağlayıcı peptit (FP-DBP) ile boyanmış büyük DNA moleküllerini görselleştirmek için bir yaklaşım sunuyoruz.

Peptit bağlanma floresan protein DNA ile yüzey-gergin büyük DNA moleküllerinin Görselleştirme

Burada, DNA-protein etkileşimleri site-specifically değiştirilmiş λ DNA substrat ve protein etiketli bir kuantum nokta kullanarak toplam iç yansıma floresans mikroskobu tarafından (TIRFM) eğitim için bir iletişim kuralı mevcut.

Qdot etiketli Protein ve Site-specifically tarihinde λ DNA molekülünü düzeyinde arasındaki etkileşimi görüntülenmesi

3D tek moleküllü lokalizasyon mikroskopisi, yaşayan bakteri hücrelerinde floresan olarak etiketlenmiş proteinlerin mekansal konumlarını ve hareket yörüngelerini araştırmak için kullanılır. Burada açıklanan deneysel ve veri analizi protokolü, sitosolik proteinlerin havuzhalinde ki tek moleküllü yörüngelere dayalı yaygın diffüzif davranışlarını belirler.

Tek Moleküllü İzleme Mikroskobu - Sitosolik Moleküllerin Diffüz Durumlarını Belirlemede Bir Araç

Bu canlı-bakteriyel hücre görüntüleme protokolü zaman içinde tek hücre düzeyinde birden fazla bakteri türü arasındaki etkileşimlerin görselleştirilmesiiçin izin verir. Hızlandırılmış görüntüleme, tek tek kültür veya ortak kültürdeki her bakteri türünün gözlemlenmesine olanak sağlar ve bireysel hücre hareketliliği ve canlılığı da dahil olmak üzere çok türler arası bakteri topluluklarındaki türler arası etkileşimleri sorgular.

Tek Hücreli Türler Arası Bakteri Etkileşimlerinin Kinetik Görselleştirilmesi

Doğası gereği düzensiz birçok proteinin, çok sayıda hücresel süreç için önemli bir davranış olan oldukça dinamik biyomoleküler kondensatların oluşumuna katıldığı gösterilmiştir. Burada, canlı hücrelerdeki biyomoleküler kondensatlarda proteinlerin birbirleriyle etkileşime girdiği dinamikleri ölçmek için tek moleküllü görüntüleme tabanlı bir yöntem sunuyoruz.

Biyomoleküler Kondensatlarda Protein Etkileşim Dinamiğinin Tek Moleküllü Ölçümü

Bu makale, katı destekli lipid çift katmanlarında tek protein izleme için örnekler nasıl oluşturulacağına dair ayrıntılı bir açıklama sunmaktadır. Ayrıca, tek molekül hassasiyeti ve hızlı kare hızına sahip basit bir floresan mikroskobu da açıklar. Son olarak, tek protein yörüngelerinin çıkarılması prosedürünü özetliyoruz.

Lipid çift katmanlarında tek proteinlerin floresan mikroskopisi kullanılarak takibi

Öğrenin canlı bakteriyel hücrelerde protein-DNA etkileşimlerini PALM ve tek molekül takip yöntemiyle görselleştirmeyi. Escherichia coli hücrelerinde DNA bağlayıcı protein aktivitesini nicel olarak ölçün.

Fotoaktive Tek molekül Takip Kullanma Canlı Bakteriyel Hücrelerde Protein-DNA Etkileşimleri görselleştirme

Daha fazla video keşfet