Fotoaktive Tek molekül Takip Kullanma Canlı Bakteriyel Hücrelerde Protein-DNA Etkileşimleri görselleştirme

Bu prosedürün genel amacı, canlı bakteri hücrelerindeki DNA bağlayan proteinlerin aktivitesini doğrudan görüntülemek ve niceliksel olarak belirlemektir. Bu işlem, ilgilenilen bir DNA bağlayan proteine füzyonlanmış, foto-aktive edilebilir floresan bir protein eksprese eden hücrelerin görüntülenmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, görüntüleme sırasında foto-aktivasyona uğrayan tekil proteinlerin bir videosunun kaydedilmesidir.

Ardından, protein lokalizasyonlarını belirlemek ve tekil hücreler içindeki proteinleri takip etmek için veriler analiz edilir. DNA bağlanma olayları, tekil proteinlerin kromozomlarla temas ettiklerinde difüzyon katsayılarındaki değişimle tanımlanır. Nihayetinde sonuçlar, hücre başına bağlanan ve difüzyon halindeki proteinlerin sayısı sayılarak, tekil hücre düzeyindeki protein-DNA etkileşimlerine ilişkin kantitatif bir ölçüm sağlayabilir.

Bu yöntem, DNA onarım alanındaki in vivo onarım hızları ve onarım bölgelerinin uzaysal dağılımı gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Şimdi, canlı e coli hücrelerindeki DNA polimeraz bir'in onarım aktivitesini ölçerek yöntemi uygulamalı olarak göstereceğiz. Öncelikle, bir fırında 500 °C'de bir saat boyunca, arka planda floresan partikül içermeyen lameller hazırlayın. 1,5 numaralı kalınlıktaki lamellerden bir stok hazırlayıp bunları alüminyum folyo içerisinde oda sıcaklığında saklayın.

Bunlar önümüzdeki haftalar boyunca kullanılabilir. Ardından, AB 1157 poly a PA m cherry suşundan erken eksponansiyel fazdaki 1 mL E coli'yi 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde konsantre edin. Hücreleri 2.300 G'de beş dakika boyunca santrifüje tabi tutun.

Süpernatantı uzaklaştırın ve hücre peletini 20 µL artık besiyerinde yeniden süspande edin, ardından hücreleri çözeltiye getirmek için vorteksleyin. Daha sonra, distile su içerisinde %1,5 düşük floresanlığa sahip aros çözeltisi hazırlayın. Metil metan sülfonat veya MMS kullanılarak yapılacak DNA hasarı deneyleri için gerekli önlemleri alarak, eritilmiş aros'un 500 µL'sini 500 µL iki kat konsantrasyonlu minimal besiyeri ile birkaç kez nazikçe pipetleyerek karıştırın.

Karışım soğumadan önce, 500 mikrolitre minimal besiyerine 8.3 mikrolitre MMS ekleyin ve ardından bunu aros ile karıştırın. Yakılmış bir lam üzerine yayın. Hava kabarcığı oluşturmadan, merkezi ve eşit bir şekilde yayın.

Pedini ikinci bir yakılmış lamelle düzleştirin. Soğuduktan sonra, pedin üzerindeki üst kapağı kaldırın ve bir mikrolitre konsantre hücre süspansiyonu ekleyin. Pedin üzerini yeni bir yakılmış lamelle kapatıp çok nazikçe bastırarak hücreleri immobilize edin.

Hücreler, kurumadan önce 45 dakika içerisinde görüntülenmelidir. Bu süreyi uzatmak için, DNA Hasarı deneylerinde ped, bir silikon contanın içine mühürlenebilir. Hücreleri görüntülemeden önce, onları ped üzerinde 20 dakika boyunca inkübe edin.

Oda sıcaklığındaki nemlendirilmiş bir kap içerisinde bulunan mikroskop, 405 nanometrelik bir fotoaktivasyon lazerine ve 561 nanometrelik bir eksitasyon lazerine sahiptir. Yüksek eğimli aydınlatma kullanılarak yalnızca lam yüzeyinin üzerindeki ince bir kesitte bulunan floroforların uyarılmasıyla tek molekül hassasiyetine ulaşılır ve floresans emisyonu, elektron çarpanlı bir CCD kamera ile kaydedilir. Numuneyi mikroskop tablasına yerleştirin ve hücreleri odaklayın.

Geçirgen ışık aydınlatması altında, veri boyutunu azaltmak ve kamera okuma hızını artırmak için kırpılmış bir görüş alanı belirleyin. Numuneyi ortam ışığından koruyun ve tekil florofor tespiti için elektron çarpanlı CCD kamera kazancını açın. Kare hızını kare başına 15,26 milisaniye olarak ayarlayın.

Bu, 0,26 milisaniyelik kamera okuma süresini de içermektedir. Pozlama süreleri, çok az hareket bulanıklığıyla net floresan lekeler gözlemleyebilmek için yeterince kısa olmalıdır. Öte yandan, bağlı molekülleri difüzyona uğrayan moleküllerden net bir şekilde ayırt edebilmek için izlerin yeterince uzun zaman aralıklarıyla örneklenmesi gerekir. Şimdi, karanlık arka plan sinyalini kontrol etmek için kamera verilerini görüntüleyin.

561 nanometre lazeri açın ve eksitasyon arka plan sinyalini kontrol edin. Paul one PA M cherry füzyon proteinlerinin fotoaktivasyonu için 405 nanometre lazeri açın ve tek moleküllerin floresan lekeleri görünene kadar yoğunluğu artırın. Şimdi, örneğin yalnızca ince bir kesitini aydınlatmak için eksitasyon ışınının açısını ayarlayın.

Kapak camı yüzeyini kapatın. Bu yöntem, tekil floresan proteinlerin tespitine ve hassas lokalizasyonuna dayalı olduğundan, mikroskobun optimal hizalaması ve hassasiyeti veri kalitesi açısından kritik olacaktır. Bu amaçla, lazer ışınını 100 x sayısal açıklığı 1.4 olan bir objektifin arka odak düzlemine odaklayın.

Odaklama lensini ışına dik olarak ötelemek, odağı objektifin merkezinden uzaklaştırarak ışının objektiften belli bir açıyla çıkmasına neden olur. Işını, floresan yoğunluğunu maksimize edecek ve arka planı minimize edecek şekilde ayarlayın. Geçirme ışığı mikroskopi modunda hücrelerin yeni bir görüş alanı bulun ve görüntüyü odaklayın.

Hücre dış hatlarını kaydetmek için kamera ile bir görüntü alın. 561 nanometre lazeri açın ve hücresel otoflorese ile lam üzerindeki arka plan lekelerini birkaç saniye boyunca beyazlatın.

Veri toplama işlemine başlamadan önce, sürekli 561 nanometre eksitasyon altında bir PALM filmi kaydını başlatın. 405 nanometre lazeri açın ve filmin ilerleyişi boyunca yoğunluğu kademeli olarak artırarak santimetrekare başına bir watt seviyesine ulaşın. Hücresel otofloresansa neden olan daha yüksek 405 nanometre yoğunluklarından kaçının.

Floresan moleküllerin yoğunluğuna dikkat edin. Floresan noktalarının her karede net bir şekilde izole olması için aktivasyon oranlarının düşük tutulması önemlidir. Her film için yaklaşık 10.000 kare kaydedin; bu işlem, kırpılmış bir görüş alanı ile tipik olarak üç dakikaya kadar sürer ve bir gigabayta kadar sabit disk alanı kaplar.

Bir görüş alanı görüntülendikten sonra, pa m cherry floroforlarının geri dönüşümsüz olarak ağardığını ve tekrar gözlemlenemeyeceğini unutmayın. Yine, aşağıdaki prosedür matlab'deki özel bir yazılımı kullanmaktadır. Tekil floroforlar, nokta yayılım fonksiyonları veya psf'ler olarak görünür.

Videoda, psf'ler ilk olarak yedi piksellik çapa sahip bir Gauss çekirdeği kullanılarak bant geçiren filtreli bir görüntüde tanımlanır; aday konumlar, piksel yoğunlukları arka plan standart sapmasının 4,5 katı üzerinde olan PSF'lere karşılık gelir. Her bir aday PSF için yerel olarak en parlak piksel, eliptik bir Gauss fonksiyonunun uydurulması (fitting) için başlangıç tahmini olarak kullanılır. Serbest uyum parametreleri X konumu, Y konumu, X genişliği, Y genişliği, rotasyon açısı, genlik ve arka plan kaymasıdır.

Eliptik Gauss maskesi, PSF grafiğini bulanıklaştıran ve deforme eden pozlama süresi boyunca gerçekleşen molekül hareketini hesaba katar. PALM filminin tüm karelerinden elde edilen sonuç XY lokalizasyonları, aynı görüş alanının iletim ışığı mikroskopi görüntüsü üzerine yerleştirildiğinde, PALM-Cherry lokalizasyonları E. coli hücrelerinin merkez alanında görünmelidir. Otomatik takip protein hareketini ölçer, ancak takip penceresinin doğru seçilmesi kritik öneme sahiptir.

Öncelikle, bir dizi izleme penceresi parametresi için izleme algoritmasını çalıştırın. İzlerin bölünmediği mümkün olan en küçük izleme penceresini belirlemek için hücre başına ölçülen iz sayısını izleme penceresine karşı grafiğe dökün ve sonuçlanan izleri aynı görüş alanının iletim ışığı mikroskopi görüntüsü üzerinde görüntüleyin. Hücre içindeki molekül hareketinin uzamsal dağılımını görselleştirmek için, tekil hücreler içinde sınırlı difüzyon gösteren izler görüntülenmelidir; eğer izlerin bir kısmı hücreler arasında geçiş yapıyor gibi görünüyorsa, bu durum izleme penceresinin çok büyük seçildiğini ve/veya fotoaktivasyon hızının çok yüksek olduğunu, dolayısıyla ayrı moleküllerin hatalı bir şekilde birbirine bağlandığını gösterir.

Ardışık lokalizasyonlar arasındaki adım uzunluklarının kümülatif dağılımını çizin. Eğri, yeterince büyük takip pencereleri için sorunsuz bir şekilde yükselir ve doygunluğa ulaşır; ancak pencere çok küçük seçilmişse bir kesme kenarı gösterir. Uygun bir takip penceresi seçildikten sonra, Paul one'un difüzyon özellikleri analiz edilebilir.

n toplam adım içeren her iz için ardışık lokalizasyonlar arasındaki ortalama kare yer değiştirmeyi veya MSD'yi hesaplayın; MSD'nin istatistiksel belirsizliğini azaltmak için yalnızca en az beş lokalizasyona sahip izleri kullanın. Ardından, MSD üzerinden iz başına görünür difüzyon katsayısını hesaplayın. İkinci terim, tahmin edilen lokalizasyon hatasını düzeltir.

Bunlar ikinci terim için olan değerlerdir. Bu örnekte, hasarsız hücrelerdeki pol one ve MMS ile DNA hasarı tedavisi altındaki hücrelerdeki pol one için görüş alanındaki tüm izlerden ölçülen difüzyon katsayısı değerlerinin bir histogramını çizin; kırmızı çubuklar, kromozoma bağlı olduğu görünen ve saniyede 0,15 mikronkareden daha düşük bir hızla difüze olan bireysel pol one moleküllerinin popülasyonunu tanımlar. Buna karşılık, serbestçe difüze olan moleküller saniyede yaklaşık 0,9 mikronkare civarında hareket eder.

Bağlanmış Pol I molekülleri tanımlandıktan sonra, bağlanma bölgelerinin konumları hasarsız hücrelerde ve MMS hasarlı hücrelerde görselleştirilebilir. Bağlı izlerin toplam gözlemlenen iz sayısına oranı, pol'un DNA onarım aktivitesinin doğrudan nicel bir ölçütünü sağlar.

Canlı E. coli hücrelerinde, pol one PA m cherry füzyon proteinlerinin in vivo fotoaktivasyonu gerçekleştirilmiştir. Fotoaktivasyon, tek bir hücredeki tek bir PA m cherry floroforu ile sınırlandırılmış olabilir; daha yüksek fotoaktivasyon oranları daha fazla floresan molekülün ortaya çıkmasını sağlamıştır. Bir PALM videosunun her bir karesi için lokalizasyon analizi yapılmıştır.

Hassasiyet, fikse edilmiş hücrelerdeki hareketsiz moleküller veya canlı hücrelerdeki bağlanmış moleküller kullanılarak ölçülmüş ve teorik öngörüyle uyumlu olarak 40 nanometre olarak bulunmuştur. Ardından, çok düşük olduğunda lokalizasyon eşiği ayarlanmıştır. Arka plan gürültüsündeki rastgele pikler yanlışlıkla aday konumlar olarak seçilmiş, eşiğin çok yüksek olması durumunda ise bazı noktalar atlanmıştır.

Elde edilen Paul one lokalizasyonları hücrenin merkezi bölgesini kaplayarak, e coli nükleoidinin uzamsal organizasyonunu genel hatlarıyla yeniden yansıtmıştır. Hasarsız hücrelerdeki Paul one izlerinin çoğunluğu difüzyon göstermektedir. Tipik bir hücre, e coli hücresi başına yaklaşık 400 Paul one molekülü olan kopya sayısı ile uyumlu olacak şekilde, birkaç yüz Paul one izi içermektedir.

Farklı moleküler hareket türleri, bir dizi gecikme süresi boyunca MSD değerleri hesaplanarak belirlenebilir; yönlendirilmiş hareket parabolik bir eğri verir. Brown hareketi düz bir çizgi ile karakterize edilir. Sınırlı bir difüzyon eğrisi bir platoya ulaşır ve hareket etmeyen partiküller için MSD eğrisinin sapması lokalizasyon belirsizliğini temsil eder.

Paul one için elde edilen MSD eğrisi, brownian harekete işaret eden kısa gecikme süreleri için doğrusal olarak yükselmiş ve hücre hapsi nedeniyle daha uzun gecikme sürelerinde doygunluğa ulaşmıştır. Bu yöntemler kullanılarak, hasarsız hücrelerde eksojen DNA alkilasyon hasarına yanıt olarak Paul one'un DNA onarım aktivitesi ölçülmüştür. Paul one'un difüzyon katsayısı histogramı, difüze olan moleküllerden oluşan baskın bir popülasyon göstermektedir.

Sınırlı sayıdaki bağlı molekül, sürekli 100 milimolar MMS hasarı altında endojen DNA hasarının onarımında ve DNA replikasyonunda rol oynuyor olabilir. Sıfıra yakın difüzyon katsayılarına sahip izlerin sıklığı önemli ölçüde artmaktadır. Bu durum, mutajen varlığında DNA onarımına daha fazla Paul one molekülünün katılması gerektiği modelini desteklemektedir. Bu prosedürün ardından.

Hücre içindeki proteinlerin uzaysal dağılımını nicelleştirmek ve DNA onarımında yer alan daha büyük protein komplekslerinin varlığını incelemek amacıyla lokalizasyon ve kümelenme gibi diğer veri analiz yöntemleri uygulanabilir.