Fotoaktive Tek molekül Takip Kullanma Canlı Bakteriyel Hücrelerde Protein-DNA Etkileşimleri görselleştirme

Bu prosedürün genel amacı, canlı bakteri hücrelerindeki DNA bağlayıcı proteinlerin aktivitesini doğrudan görselleştirmek ve ölçmektir. Bu, ilgilenilen bir DNA bağlayıcı proteine kaynaşmış foto-aktive edilmiş bir floresan proteini ifade eden hücrelerin görselleştirilmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, görüntülenirken fotoğrafın aktive edildiği tek tek proteinlerin bir filmini elde etmektir.

Daha sonra veriler, protein lokalizasyonlarını belirlemek ve tek hücrelerin içindeki proteinleri izlemek için analiz edilir. DNA bağlanma olayları, tek proteinlerin kromozomlarla temas ettiklerinde difüzyon katsayısındaki değişiklikle tanımlanır. Sonuç olarak, sonuçlar, hücre başına bağlı ve difüzyon yapan proteinlerin sayısını sayarak tek hücre düzeyinde protein DNA etkileşimlerinin nicel bir ölçümünü sağlayabilir.

Bu yöntem, in vivo onarım oranları ve onarım bölgelerinin mekansal dağılımı gibi DNA onarım alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Şimdi, hayatta bir kez daha bulunan DNA polimeraz e coli hücrelerinin onarım aktivitesini ölçerek yöntemi göstereceğiz: İlk olarak, bir saat boyunca 500 santigrat derecede bir fırında arka plan floresan parçacıkları olmadan kapak fişleri yapın. 1.5 numaralı kalınlıktaki lamel kapakları stokta yakın, oda sıcaklığında alüminyum folyoda saklayın.

Gelecek haftalar için iyiler. Daha sonra, suşun 1.5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpünde bir mililitre erken üstel faz E coli'ye konsantre edin. AB 1157 poli a PA m kiraz hücreleri beş dakika boyunca 2.300 G'de santrifüjleyin.

Süpernatanı çıkarın ve hücre peletini 20 mikrolitre artık ortamda yeniden süspanse edin ve hücreleri çözeltiye girdaplayın. Daha sonra, damıtılmış suda% 1.5 düşük floresan aros çözeltisi yapın. Metil metan sülfonat veya MMS kullanarak DNA hasarı deneyleri için önlem alarak 500 mikrolitre erimiş aeros'u 500 mikrolitre iki x minimal ortamla birkaç kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın.

Karışım soğumadan önce aros ile karıştırmadan önce 500 mikrolitre minimum ortama 8,3 mikrolitre MMS ekleyin. Yanmış bir kapak fişi üzerine yayın. Kabarcık yapmadan eşit şekilde ve ortalayarak yayın.

Pedi ikinci bir yanmış kapak fişi ile düzleştirin. Soğuduktan sonra, üst kapağı pedden çıkarın ve bir mikrolitre konsantre hücre süspansiyonu ekleyin. Pedi yeni bir yanmış örtü astarı ile kaplayarak ve çok hafifçe bastırarak hücreleri hareketsiz hale getirin.

Hücreler kurumadan önce 45 dakika içinde görüntülenmelidir. Bu süreyi uzatmak için, ped, DNA Hasarı deneyleri için bir silikon conta içine kapatılabilir. Hücreleri görüntülemeden önce, 20 dakika boyunca ped üzerinde inkübe edin.

Oda sıcaklığında nemlendirilmiş bir kapta, mikroskop 405 nanometre foto aktivasyon lazeri ve 561 nanometre uyarma lazeri içerir. Tek molekül hassasiyetine, yüksek eğimli aydınlatma kullanılarak kapak kayma yüzeyinin üzerindeki ince bir kesit içinde sadece floro dörtlüsünün heyecanlandırılmasıyla ulaşılır, floresan emisyonu elektron çarpan bir CCD kameraya kaydedilir. Numuneyi mikroskop sahnesine yerleştirin ve hücreleri odak noktasına getirin.

İletilen ışık aydınlatması altında, veri boyutunu küçültmek ve kamera okuma hızını artırmak için kırpılmış bir görüş alanı tanımlayın. Numuneyi ortam ışığından kapatın ve tek floro dört algılama için elektron çarpan CCD kamera kazancını açın. Kare hızını kare başına 15,26 milisaniye olarak ayarlayın.

Bu, 0,26 milisaniyelik kamera okuma Süresini içerir: Pozlama sürelerinin, çok az hareketle keskin floresan noktaları gözlemlemek için yeterince kısa olması gerekir. Öte yandan, bağlı molekülü yayılan moleküllerden net bir şekilde ayırt etmek için izlerin yeterince uzun zaman aralıklarında örneklenmesi gerekir. Şimdi koyu arka plan sinyalini kontrol etmek için kamera verilerini görüntüleyin.

561 nanometre lazeri açın ve uyarma arka plan sinyalini kontrol edin. Paul one PA M kiraz füzyon proteinlerinin fotoaktivasyonu için 405 nanometre lazeri açın ve tek moleküllerin floresan lekeleri görünene kadar yoğunluğu artırın. Şimdi, numunenin yalnızca ince bir bölümünü aydınlatmak için uyarma ışınının açısını ayarlayın.

Kapak kayma yüzeyini kapatın. Bu yöntem, tek floresan proteinlerin tespitine ve hassas lokalizasyonuna dayanır, bu nedenle mikroskobun optimum hizalaması ve hassasiyeti veri kalitesi için çok önemli olacaktır. Bu amaçla, lazer ışınını 100 x sayısal açıklık 1.4 objektifin arka odak düzlemine odaklayın.

Odaklama merceğini ışına dik olarak çevirmek, odağı hedefin merkezinden uzaklaştırarak ışının nesneden belirli bir açıyla çıkmasına neden olur. Işının floresan yoğunluğunu en üst düzeye çıkarmasını ve arka planı en aza indirmesini hedefleyin. İletilen ışık mikroskobu modunda hücrelerin yeni bir görüş alanı bulun ve görüntüyü odaklayın.

Hücre ana hatlarını kaydetmek için bir kamera anlık görüntüsü alın. 561 nanometre lazeri açın ve kapaktaki hücresel otofloresan ve arka plan lekelerini ağartın. Birkaç saniye kaydırın.

Veri toplamaya başlamadan önce, sürekli 561 nanometre uyarma altında bir avuç içi filmi almaya başlayın. 405 nanometre lazeri açın ve film boyunca yoğunluğu kademeli olarak artırın ve santimetre kare başına bir watt'a kadar ulaşın. Hücresel otofloresansa neden olan daha yüksek 405 nanometre yoğunluklarından kaçının.

Floresan moleküllerinin yoğunluğuna dikkat edin. Floresan noktaların her çerçevede net bir şekilde izole edilmesi için aktivasyon oranlarını düşük tutmak önemlidir. Film başına yaklaşık 10.000 kare kaydedin, bu da kırpılmış bir görüş alanıyla genellikle üç dakikaya kadar sürer ve bir gigabayta kadar sabit disk alanı oluşturur.

Bir görüş alanı görüntülendikten sonra, pa m kiraz floroforlarının geri dönüşü olmayan bir şekilde ağartıldığını ve gözlemlenemeyeceğini unutmayın. Yine, aşağıdaki prosedür matlab'da özel yazılım kullanır. Tek floroforlar, nokta yayılma fonksiyonları veya psfs olarak görünür.

Filmde, psf'ler ilk olarak, arka planın standart sapmasının 4,5 kat üzerinde tepe piksel yoğunluklarına sahip P SFS'ye karşılık gelen yedi piksel çapı aday konumuna sahip bir Gauss çekirdeği kullanılarak bant geçiren filtrelenmiş bir görüntüde tanımlanır. Aday PSF başına yerel olarak en parlak piksel, eliptik bir Gauss fonksiyonunun takılması için bir ilk tahmin görevi görür. Serbest sığdırma parametreleri X konumu y, konum X genişliği, Y genişliği dönüşü, açı, genlik ve arka plan ofsetidir.

Eliptik Gauss maskesi, pozlama süresi boyunca molekül hareketini hesaba katar ve bu da PSF grafiğini bulanıklaştırır ve deforme eder. Avuç içi filminin tüm karelerinden elde edilen XY lokalizasyonları, Paul one PAM Cherry'nin aynı görüş alanı lokalizasyonlarının iletilen ışık mikroskobu görüntüsü üzerine e coli hücrelerinin merkezi alanı içinde görünmelidir. Otomatik izleme, proteinlerin hareketini ölçer, ancak bir izleme penceresinin başarılı bir şekilde seçilmesi çok önemlidir.

İlk olarak, bir dizi izleme penceresi parametresi için izleme algoritmasını çalıştırın. İzleri bölmeyen mümkün olan en küçük izleme penceresini belirlemek için hücre başına ölçülen iz sayısını izleme penceresine göre çizin, elde edilen izleri aynı görüş alanının iletilen ışık mikroskobu görüntüsünde görüntüleyin. Hücreler içindeki molekül hareketinin uzamsal dağılımını görselleştirmek için, P bir iz, hücreler arasında bir parça geçiyor gibi görünüyorsa, tek hücreler içinde sınırlı difüzyonu göstermelidir, bu, izleme penceresinin çok büyük seçilmesi ve/veya foto aktivasyon oranı çok yüksek olması nedeniyle ayrı moleküllerin hatalı bir şekilde bağlandığını gösterir.

Ardışık yerelleştirmeler arasındaki adım uzunluklarının kümülatif dağılımını çizin. Eğri, yeterince büyük izleme pencereleri için düzgün bir şekilde yükselir ve doyurulur, ancak pencere çok küçük seçilmişse bir kesme kenarı gösterir. Uygun bir izleme penceresi seçildikten sonra, Paul One'ın difüzyon özellikleri analiz edilebilir.

Toplam n adımla her bir parça için ardışık yerelleştirmeler arasındaki ortalama kare yer değiştirmeyi veya MSD'yi hesaplayın, MSD'nin istatistiksel belirsizliğini azaltmak için yalnızca en az beş yerelleştirmeye sahip parçaları kullanın. Ardından, MSD'den parça başına görünen difüzyon katsayısını hesaplayın. İkinci terim, tahmini yerelleştirme hatasını düzeltir.

Bunlar ikinci dönem için değerlerdir. Bu örnekte, şimdi görüş alanındaki tüm izlerden ölçülen difüzyon katsayısı değerlerinin bir histogramını çizin Hasar görmemiş hücrelerde pol one ve MMS ile DNA hasarı tedavisi altındaki hücrelerde pol one için kırmızı çubuklar, kromozoma bağlı görünen ve saniyede 0.15 mikron kareden daha az yayılan tek tek pol one moleküllerinin popülasyonunu tanımlar. Serbestçe yayılan moleküller ise saniyede yaklaşık 0.9 mikron kare hareket eder.

Bağlanan Paul'den sonra bir molekül tanımlanmıştır. Bağlanma bölgelerinin pozisyonları, hasar görmemiş hücrelerde ve mm MS hasarı olan hücrelerde görüntülenebilir. Gözlemlenen toplam iz sayısına göre bağlı izlerin oranı, pol'ün DNA onarım aktivitesinin doğrudan kantitatif bir ölçümünü sağlar.

Pol one PA m kiraz füzyon proteinlerinin bir in vivo fotoaktivasyonu canlı e coli hücrelerinde gerçekleştirildi. Foto aktivasyon, bir hücrede tek bir PA m kiraz floroforu ile sınırlı olabilir, daha yüksek foto aktivasyon oranları daha fazla floresan molekülü ortaya çıkardı. Bir avuç içi filminin her karesi için yerelleştirme analizi yapıldı.

Hassasiyet, sabit hücrelerde hareketsiz moleküller veya canlı hücrelerde bağlı moleküller kullanılarak ölçüldü ve teorik tahminle uyumlu olarak 40 nanometre olduğu bulundu. Daha sonra, yerelleştirme eşiği çok düşük olduğunda ayarlandı. Arka plan gürültüsündeki rastgele zirveler hatalı bir şekilde aday pozisyonlar olarak seçilirken, eşik çok yüksekse bazı noktalar kaçırıldı.

Ortaya çıkan Paul one lokalizasyonları, hücrenin merkezi alanını işgal etti ve e coli nükleoidinin uzamsal organizasyonunu geniş ölçüde özetledi. Paul'ün hasar görmemiş hücrelerdeki izlerinin çoğu difüzyon gösterir. Tipik bir hücre, e coli hücresi başına yaklaşık 400 Paul bir molekül olan kopya sayısıyla tutarlı birkaç yüz Paul bir iz içerir.

Farklı moleküler hareket türleri, bir dizi gecikme süresi boyunca MSD değerleri hesaplanarak tanımlanabilir: yönlendirilmiş hareket parabolik bir eğri verir. Brown hareketi düz bir çizgi ile karakterize edilir. Sınırlı bir difüzyon eğrisi bir platoya ulaşır ve hareketsiz parçacıklar için MSD eğrisinin bir ofseti, lokalizasyon belirsizliğini temsil eder.

Paul one için ortaya çıkan MSD eğrisi, brown hareketinin göstergesi olan kısa gecikme süreleri için doğrusal olarak yükseldi ve hücre hapsi nedeniyle daha uzun gecikme sürelerinde doygunluğa ulaştı. Bu yöntemler kullanılarak, hasar görmemiş hücrelerde ekzojen DNA alkilasyon hasarına yanıt olarak Paul'un DNA onarım aktivitesi ölçüldü. Paul one'ın difüzyon katsayısı histogramı, baskın bir yayılan molekül popülasyonunu gösterir.

Birkaç bağlı molekül, sürekli 100 milimolar MMS hasarı altında DNA replikasyonu ve endojen DNA hasarının onarımında rol oynayabilir. Sıfıra yakın difüzyon katsayılarına sahip izlerin frekansı önemli ölçüde artar. Bu, bu prosedürü takiben mutajen ile DNA onarımında daha fazla Paul molekülünün yer alması gerektiği modelini desteklemektedir.

Lokalizasyon, kümeleme gibi diğer veri analiz yöntemleri, hücredeki proteinlerin uzamsal dağılımını ölçmek ve DNA onarımında yer alan daha büyük protein komplekslerinin varlığını araştırmak için gerçekleştirilebilir.