Lipid çift katmanlarında tek proteinlerin floresan mikroskopisi kullanılarak takibi

Proteinler karmaşık bir durum alanında çalışır ve bunun büyük bir kısmı gizlidir. Bu durumları ortaya çıkarmak için tek moleküllü görüntüleme kullanıyoruz. Bir lipid çift katmanında tek zarlı proteinleri takip ederken, ana zorluklar örnek hazırlama, foto ağartma ve zaman çözünürlüğüdür.

Başlamak için, dondurucudan lipid sapı çözeltilerini çıkarın ve oda sıcaklığına ulaşmasına izin verin. Fırından temiz bir 10 mililitrelik şişe alın ve oda sıcaklığına soğumasına izin verin. Soğutulmuş yuvarlak taban şişesine 900 mikrolitre spektroskopik kalitede kloroform ve 100 mikrolitre spektroskopik kalitede metanol ekleyin.

Sonra her lipidden uygun miktarı mataşa ekleyin ve iyice karıştırın. Şimdi yuvarlak tabanlı şişenin üstüne bir vakum damıtma konnektörü yerleştirin ve azot kurutma hattına takın. Sonra azot gazını aç ve basıncı ayarlayarak akış elin arkasında neredeyse hissedilmeyecek kadar ayarlanır.

Her beş mikromol toplam lipid için bir mililitre tampon pipetleyin, yuvarlak alt şişe. Şişeye bir cam tıpçı yerleştirin ve parafin filmiyle mühürleyin. Mataşa ve bir kelepçeyi bir halka standına yerleştirin ve altını 60 derece Celsius sonikator banyosuna batırın.

Çözeltinin opak hale geldiğini ve şişenin iç duvarına hiç lipid tutunmadığını doğrulayın. Bir saatlik kuluçkadan sonra sonikeri açın ve genliği en yüksek seviyeye ayarlayın. Şişeyi banyo içinde hareket ettirerek solüsyolun gözle görülür şekilde çarpıp şöleye sıçradığı en yoğun kayıntı noktasını bulun.

Çözeltiyi 30 dakika sonikle geçirin. Opaktan şeffaflığa ve hafif opalesans'a geçişi gözlemliyor. Lipid çözeltisini mataradan çıkarıp mikro santrifüj tüpüne aktarın.

Tüpü 100.000 G'de bir saat boyunca dört derece Celsius'ta santrifüj yapın. Santrifüjlemeden sonra süpernatantı çıkarıp yeni bir santrifüj tüpüne aktarın. 25 milimetrelik kuvars kapak kapaklarını bir beğene yerleştirin ve eşit hacimde nano saf su, %30 hidrojen peroksit ve konsantre nitrik asit ekleyin.

Kapak parçalarını hazırlanmış çözeltide 30 dakika ısıtın, köpürme başlayana kadar. Çözeltiyi her 10 dakikada bir kontrol edin ve kapak örtülerinin birbirine yapışmasını önlemek için nazikçe döndürün. Girip sırasında kapak kaymalarının ayrıldığını ve ayrıldığını gözlemleyin.

Ayrıldıktan sonra, ayrılmayı korumak için girdap hızını kademeli olarak azaltın ve köpüklü çözeltinin kapak kaymalarını eşit şekilde kaplamasına izin verin. Sonra kapak kapaklarını saf su ile iyice durulayın ve tüm kimyasal kalıntıları nazikçe döndürerek çıkarabilirsiniz. Alternatif olarak, kuvars kapak kapaklarını n-heksan ve ardından metanol ile temizleyin, her çözücü için lens dokusuyla silin.

Kaplama kapaklarını UV ozon temizleyicisinin içine yerleştirin, işlem yapılacak yüzey lambaya bakacak şekilde yerleştirilin. Beş dakika boyunca oksijenin inç kare başına beş pound hızla odaya akmasına izin verin. Sonra oksijen akışını kapatın.

Şimdi ultraviyole ışıkları 15 dakika açın, ardından ozonun dağılması için kapak kapaklarını en az 10 dakika dinlendirin. Taze temizlenmiş bir kapak kılıfı 25 milimetrelik numune tutucuya yerleştirin. Çeyrek inçlik SM bir lens tüpü kullanarak, sekiz milimetre çapında çift katmanlı par film contasını kesin ve numune tutucusunun ortasına yerleştirin.

Sekiz milimetrelik contanın ortasına küçük Unilamellar veziküllerden oluşan 50 mikrolitrelik bir damla uygulayın. Odayı kapattıktan sonra, 37 derece Celsius'ta bir saat kuluçka yapın. İnkubasyon sonrası çözeltiyi pipet kullanarak durulayın.

Çift katmana 50 mikrolitre taze tampon ekleyin ve bu işlemi toplamda 10 kez tekrarlayın. Son durulamadan sonra, numune tutucusundan tamponu çıkarın. Deterjana istenen proteinden 50 mikrolitre aliquot ekleyin, böylece konsantrasyonun kritik misella konsantrasyonu altında veya altında olduğundan emin olun.

Numuneyi proteinin katılımına izin vermek için en az bir saat boyunca 37 derece Celsius'ta inkübe yapın, numuneyi tampon ile durulayarak dahil edilmemiş protein ve deterjan çıkarabilirsiniz. Dikey piksel kaydırma hızını yaklaşık 600 nanosaniyeye ayarlayın ve overclock modunu kullanarak dikey saat voltajını artırın. Sonra yatay piksel okumasını maksimum hızına ayarlayın.

Pre amplifikatör kazancını ikiye ayarlayın. Amplifikatör çıkışını elektron çarpımı için ayarlayın ve elektron çarpan kazancını en yüksek seviyeye ayarlayın. Sonra pozlama süresini 25 milisaniyeye ayarlayın.

Gerçek kare hızının pozlama süresini biraz aştığını doğrulayın. Şimdi lazer gücünü sinyalin arka plan gürültüsünden açıkça belirgin hale getirene kadar ayarla. Her örnek için en az 1000 parça elde edecek kadar görüntüleme verisi toplamak.

İzleme analizi için, tüm veri setlerini tutarlı bir boyuta kırpın ve Image J.In Fiji ile arka plan düzeltmesi yapın, analiz edilmesi gereken filmi sürükleyip bırakın veya analiz edilmesi gereken TIFF dosyasını arayüze yerleştirin. Piksel kalibrasyon detaylarını girmek için analiz sekmesine gidin, Ölçeği ayarla seçin ve cihaza özgü piksel mesafe kalibrasyonunu uygulayın. Sonra veri setinin bir kopyasını kaydederek orijinali koruyun ve yapılan değişiklikleri takip edin.

İlgi alanındaki seçilmiş bir bölgeden arka planı çıkarıp orijinal verinin kaydedilen kopyasına uygulayın. Süreç sekmesine gidin ve arka planı çıkar'ı seçin. Eklentiler sekmesinde trackmate'i seçin, ardından trackmate seçeneğini seçin ve trackmate ile trackmate diyalog penceresini başlatın.

AQP dört tetramer için etiketleme derecesi UV görünür spektrometri kullanılarak 4.12 olarak hesaplandı ve Poisson dağılım analizi, Tetramerlerin %98'inin en az bir floresan boya molekülü taşıdığını gösterdi. Histogram, farklı boyuttaki ortogonal parçacık dizilerinin difüzyonu ile uyumlu geniş bir adım boyutları dağılımını göstermekte olup, hesaplanan ortalama difüzyon katsayısı saniyede 0,0143 mikrometrekaredir. Bu videoda, akvaporin dört düzenlemesi ve bunlara bağlı termodinamik kuvvetler için önemli olan anahtar durumları belirledik.

Bu protokol, zaman geçişli tek molekül takibi için uygun olan saflaştırılmış transmembran proteinlerle biyomimetik zarlar oluştururken tahminleri ortadan kaldırır. Dönüş noktalarında çalışan protein makineleri, zaman geçişli bir protein takibi, stokastik yolların, dalların ve çıkmaz uçların doğrudan gözlemlenmesini sağlar.