Nörotoksisite Testi İçin İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerin Nöronlar ve Glia Karışık Kültürlerine Ayrıştırılması Protokolü

Bu prosedürün genel amacı, insan kaynaklı pluripotent kök hücre kolonilerinden türetilen nöral kök hücreleri, nöronal ve glial hücrelerin karışık kültürlerine ayırmaktır. Bu model, ilaç ve kimyasal toksisite taraması için uygundur. Bu in vitro model, nöronal ve glial farklılaşma süreci sırasında aktive olan sinyal yollarının kimyasal kaynaklı bozulmalarını değerlendirmek için uygulanabilir.

Bu sistemin temel avantajı, geleneksel olarak kullanılan kanser hücrelerine ve hayvan birincil kültürlerine alternatif teşkil eden ve karışık nöronal ve glial hücre popülasyonunda nörotoksisiteyi incelemeye izin veren indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden türetilen bir insan modelinin kullanılmasıdır. Prosedür, doktora sonrası öğrencimiz Francesca Pistolato ve laboratuvarımızdan yüksek lisans öğrencisi Carolina Nunes tarafından gösterilecektir. HiPSC kolonilerini geçirerek başlayın.

Laminer akış kabininde dört X büyütmede stereoskopik mikroskop altında çalışarak, 30 gauge iğne ile bir mililitrelik bir şırınga kullanın. Kök hücre kolonilerini yaklaşık 200 mikronluk kareler halinde 200 mikronluk kareler halinde kesin. Kolonileri kesmek, eşit büyüklükte parçalar elde etmek için iyi el becerileri gerektirir.

Piyasada bulunan kesme aletlerinin kullanılması yardımcı olabilir. Ardından, koloni parçalarını tabak yüzeyinden ayırmak için 200 mikrolitrelik bir pipet kullanın ve parçaları kaldırmak için altındaki ortamı hafifçe pipetleyin. 100 kadar koloni parçasını, dört mililitre tam hiPSC ortamı ile doldurulmuş nitelikli bir matris DMEM F12 kaplı 60 milimetrelik bir kaba aktarın.

Daha sonra yeni yemeği 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Her gün toplam ortam değişikliği yapın ve dört X ve 10X büyütmede bir faz kontrast mikroskobu kullanarak kolonilerin morfolojisini inceleyin. Farklılaştırma prosedürünün sıfırıncı gününde, 60 milimetre petri kabı başına üç mililitre ortam ekleyerek hiPSC ortamını yenileyin.

Daha sonra 200 mikronluk parçaları daha önce olduğu gibi kesin ve ayırın. Ayrılan parçaları ve ortamı 15 mililitrelik bir tüpe pipetleyin. Çanağı iki mililitre tam hiPSC besiyeri ile durulayın ve tüm parçaları geri kazanın.

Daha sonra bir dakika boyunca 112 kez G'de santrifüjleyin. Santrifüjlemeyi takiben, süpernatanı aspire edin ve parçaları beş mililitre tam hiPSC EB ortamında nazikçe yeniden süspanse edin. Tam hacmi 60 milimetrelik ultra düşük bağlantılı bir doku kültürü kabına koyun.

Çanağı gece boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Ertesi gün hücreleri ters mikroskopla kontrol edin. Bir embriyoid cisimciklerin burada görüldüğü gibi yuvarlak ve birbirinden farklı görünmesi gerektiği gündür.

Daha sonra embriyoid cisimciklerini ve ortamı tabaktan pipetleyin ve 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Embriyoid cisimciklerini bir dakika boyunca 112 kez G'de santrifüjleyin. İkinci günde, önceden hazırlanmış 60 milimetrelik bir tabaktan standart matris kaplama solüsyonunu aspire edin ve tabağa beş mililitre tam nöroepitelyal indüksiyon ortamı veya NRI ekleyin.

Stereoskopik mikroskop altında dört X büyütmede ve 200 mikrolitrelik bir pipet kullanarak çalışarak, yaklaşık 50 yüzen embriyoid cisimciği toplayın ve kaplanmış bir kaba aktarın. Daha sonra çanağı 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Ertesi gün, farklılaşma prosedürünün üçüncü gününde, embriyoid cisimciklerinin hepsinin bağlı olduğundan emin olmak için çanağı mikroskop altında 10X büyütmede kontrol edin.

Ardından, eksiksiz NRI ortamı ile nazikçe toplam orta değişikliği gerçekleştirin. NRI ortamını, rozet benzeri nöroepitelyal agregatların görünür olması gereken yedinci güne kadar her gün değiştirin. Yedinci günde, kültür ortamında seyreltilmiş 100 mikrolitre standart matrisi her bir oyuğa pipetleyerek 96 oyuklu bir plakayı kaplayın.

Sekizinci günde, rozet benzeri agregaları steril koşullarda 10X büyütmede stereoskopik mikroskop altında parçalara ayırın. Rozetlerin iğne ile dokunulduğunda tabaktan kolayca ayrılma eğiliminde olduğunu unutmayın. Bu durumda, ayrılan rozeti iğne ucu ile kısmen ayırın.

Rozetler kısmen takılı kalacaksa, rozet parçalarının ayrılmasını tamamlamak için 200 mikrolitrelik bir pipet kullanın. Rozet kesimleri, nöreksidermal türevlerin kesilmesini önlemek için iyi manuel beceriler ve hassasiyet gerektirir. Daha sonra rozet parçalarını ve ortamlarını 15 mililitrelik konik bir tüpe toplayın.

Tüm parçaları geri kazanmak için çanağı iki mililitre NRI ortamı ile durulayın. Daha sonra rozet parçalarını bir veya iki dakika boyunca 112 kez G'de döndürün. Süpernatanı aspire ettikten sonra, peleti kalsiyum ve magnezyum içermeyen bir mililitre önceden ısıtılmış bir X DPBS'de nazikçe yeniden süspanse edin.

Rozet parçalarını kısmen ayırmak için nazikçe yukarı ve aşağı pipetleyin. Daha sonra dört mililitre tam NRI ortamı ekleyin ve tripan mavisi ve otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın. Daha sonra, 96 oyuklu plakadan standart matris kaplama çözeltisini aspire edin ve hücreleri, NRI ortamında santimetre kare başına yaklaşık 15.000 hücre yoğunluğunda kuyucuklara bırakın.

Plakayı gece boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. 10. günde, tam nöronal farklılaşma ortamını kullanarak toplam ortam değişikliği gerçekleştirin. Bu temsili görüntü, 12 gün sonra yeşil renkte nestin ve kırmızı renkte beta üç tübülin için in vitro olarak boyanmış rozetleri göstermektedir.

Burada, in vitro olarak 28 gün boyunca büyütülen hücreler, kırmızı beta üç tübülin ve yeşil renkte NF200 için boyanmıştır. Bu temsili görüntü, 21 gün sonra NSC'lerden farklılaşan nöronal hücreleri göstermektedir in vitro NF200 için kırmızı renkte boyanmış ve yeşil renkte çekilmiştir. Burada, aynı kültürden alınan glial hücreler, GFAP için kırmızı renkte boyanır.

Bu histogram, IMR90 hiPSC türevlerinde ve IMR90 hiPSC'den türetilmiş NSC'lerden farklılaşan hücrelerde nestin, MAP iki, GFAP, gama-amino bütirik asit, veziküler glutamat taşıyıcı bir ve tirozin hidroksilaz pozitif hücrelerin miktar tayinini karşılaştırır. 10X objektif kullanılarak alınan bu faz kontrast görüntüleri, 21 gün boyunca farklılaşmaya uğrayan nöronal kök hücreleri göstermektedir. Bu prosedürleri izleyerek, nöronal ve glial hücrelerin fizyolojisini ve fenotipini değerlendirmek ve kimyasalların etkisini değerlendirmek için kantitatif gerçek zamanlı PCR ve çok taraflı yeniden analiz gibi diğer okumalar yapılabilir.

Kimyasal bileşiklerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın. Bu nedenle, özellikle kimyasal işlemler yapılırken, akış başlığının altında her zaman gözlük, eldiven veya maske kullanarak ilgili önlemlerinizi almalısınız. Bu videoyu izledikten sonra, nörotoksisite testi geliştirme için uygun modeli, in vitro modeli temsil eden insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden başlayarak karışık farklılaşmış nöron ve glial hücre popülasyonunun nasıl elde edileceğini iyi anlamış olmalısınız.