Name: Mikro Elektrod Dizilerinde Nöronal Hücre Kültürlerinin Uyarılmasına Ağ Yanıtına Zamana Bağlı Artış (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Keşfedin E17 fare nöronal dokusunun izolasyonu ve çoklu elektrod dizilerinde kültürü. Bu yöntem öğrenme ve hafıza mekanizmalarını incelemek için ağ dinamiklerini kaydetmeyi ve uyarmayı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma Ulusal Bilim Vakfı hibe CMMI-1300007 tarafından finanse edildi. Joseph J. Pancrazio, Dr. Hamid Charkhkar, Dr. Gretchen Knaack, bu protokollerin tasarımında yardımcı olan önceki laboratuar üyelerini ve beş yıldan uzun süre boyunca kültürlerin bakımını George Mason Üniversitesi&#39;nde kabul etmek istiyoruz. , Dr. Franz Hamilton, Michael Maquera ve Robert Graham.

<ol><li>Charkhkar, H., Frewin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+cortical+neuronal+networks+for+in+vitro+material+biocompatibility+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Use of cortical neuronal networks for in vitro material biocompatibility testing.</a> Biosens Bioelectron. 53, 316-323 (2014).</li>
<li>Bologna, L. L., Nieus, T., Tedesco, M., Chiappalone, M., Benfenati, F., Martinoia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-frequency+stimulation+enhances+burst+activity+in+cortical+cultures+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Low-frequency stimulation enhances burst activity in cortical cultures during development.</a> Neuroscience. 165 (3), 692-704 (2010).</li>
<li>Fröhlich, F., McCormick, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+electric+fields+may+guide+neocortical+network+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Endogenous electric fields may guide neocortical network activity.</a> Neuron. 67 (1), 129-143 (2010).</li>
<li>Anastassiou, C. A., Perin, R., Markram, H., Koch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ephaptic+coupling+of+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ephaptic coupling of cortical neurons.</a> Nature Neurosci. 14 (2), 217-223 (2011).</li>
<li>Ozen, S., Sirota, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcranial+electric+stimulation+entrains+cortical+neuronal+populations+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Transcranial electric stimulation entrains cortical neuronal populations in rats.</a> J. Neurosci. 30 (34), 11476-11485 (2010).</li>
<li>Wagenaar, D. A., Madhavan, R., Pine, J., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+bursting+in+cortical+cultures+with+closed-loop+multi-electrode+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Controlling bursting in cortical cultures with closed-loop multi-electrode stimulation.</a> J. Neurosci. 25 (3), 680-688 (2005).</li>
<li>Shahaf, G., Marom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+in+networks+of+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Learning in networks of cortical neurons.</a> J. Neurosci. 21 (22), 8782-8788 (2001).</li>
<li>Marom, S., Shahaf, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development%2C+learning+and+memory+in+large+random+networks+of+cortical+neurons%3A+lessons+beyond+anatomy%5BTitle%5D)+AND+%22Q+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">Development, learning and memory in large random networks of cortical neurons: lessons beyond anatomy.</a> Q Rev Biophys. 35 (1), 63-87 (2002).</li>
<li>Marom, S., Eytan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+in+ex-vivo+developing+networks+of+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Learning in ex-vivo developing networks of cortical neurons.</a> Prog Brain Res. 147, 189-199 (2005).</li>
<li>Li, Y., Zhou, W., Li, X., Zeng, S., Luo, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+learning+in+cultured+neuronal+networks+with+antagonists+of+glutamate+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Dynamics of learning in cultured neuronal networks with antagonists of glutamate receptors.</a> Biophys. J. 93 (12), 4151-4158 (2007).</li>
<li>Li, Y., Zhou, W., Li, X., Zeng, S., Liu, M., Luo, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+synchronized+bursts+in+cultured+hippocampal+neuronal+networks+with+learning+training+on+microelectrode+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Characterization of synchronized bursts in cultured hippocampal neuronal networks with learning training on microelectrode arrays.</a> Biosens Bioelectron. 22 (12), 2976-2982 (2007).</li>
<li>Chiappalone, M., Massobrio, P., Martinoia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+plasticity+in+cortical+assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Network plasticity in cortical assemblies.</a> Eur. J. Neurosci. 28 (1), 221-237 (2008).</li>
<li>le Feber, J., Stegenga, J., Rutten, W. L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+slow+electrical+stimuli+to+achieve+learning+in+cultured+networks+of+rat+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">The effect of slow electrical stimuli to achieve learning in cultured networks of rat cortical neurons.</a> PloS one. 5 (1), 8871(2010).</li>
<li>Ruaro, M. E., Bonifazi, P., Torre, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+the+neurocomputer%3A+image+processing+and+pattern+recognition+with+neuronal+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Toward the neurocomputer: image processing and pattern recognition with neuronal cultures.</a> IEEE Trans Biomed Eng. 52 (3), 371-383 (2005).</li>
<li>Hamilton, F., Graham, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-Dependent+Increase+in+Network+Response+to+Stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Time-Dependent Increase in Network Response to Stimulation.</a> PloS one. 10 (11), 0142399(2015).</li>
<li>Guidelines for Euthanasia of Rodents Using Carbon Dioxide. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://oacu.oir.nih.gov/sites/default/files/uploads/arac-guidelines/rodent_euthanasia_adult.pdf">https://oacu.oir.nih.gov/sites/default/files/uploads/arac-guidelines/rodent_euthanasia_adult.pdf</a> (2016).</li>
<li>Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="https://mitpress.mit.edu/books/culturing-nerve-cells">Culturing Nerve Cells: Business Source</a>. , MIT Press. Cambridge. (1998).</li>
<li>Gullo, F., Maffezzoli, A., Dossi, E., Wanke, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-latency+cross-and+autocorrelation+identify+clusters+of+interacting+cortical+neurons+recorded+from+multi-electrode+array%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Short-latency cross-and autocorrelation identify clusters of interacting cortical neurons recorded from multi-electrode array.</a> J. Neurosci. Methods. 181, 186-198 (2009).</li>
<li>Eytan, D., Brenner, N., Marom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+Adaptation+in+Networks+of+Cortical+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Selective Adaptation in Networks of Cortical Neurons.</a> J. Neurosci. 23 (28), (2003).</li>
<li>Bonifazi, P., Ruaro, M. E., Torre, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+properties+of+information+processing+in+neuronal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Statistical properties of information processing in neuronal networks.</a> Eur. J. Neurosci. 22 (11), 2953-2964 (2005).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Bu protokolde özetlenen adımlar, yeni başlayanlar için kendi nöronal kültürlerini ÇÇ&#39;lar üzerine yerleştirip ağ etkinliklerini kaydetmek için yeterli ayrıntı sağlar. Bu protokol, kültürlerin düzgün bir şekilde yapışmasını sağlamaya, elektrot dizileri üzerinde bir halı hücre tabakası oluşturmaya ve aylardır sağlıklı ve kirletici olmamasına yardımcı olacaktır. Protokolün tüm bölümlerine uymak en iyisi olsa da, süreç boyunca başarılı sonuç için kritik öneme sahip adımlar vardır. Tüm süreç boyunca aseptik tekniğin kullanılması, kültürlerin kontamine olmasını önlemek için zorunludur. Yeni ÇÇA&#39;lar, protokolde tarif edildiği gibi hidrofil hale getirilmelidir veya yoksul hücre yapışması ortaya çıkar. Ayrıştırma sırasında sert pipetleme ve hava kabarcıklarının oluşmasını önlemek, hasar gören hücrelerin sayısını azaltacak ve daha yüksek ve daha sağlıklı bir verim sağlayacaktır. İlk önce DMEM 5/5&#39;ten DMEM +&#39;ye geçmeBeslenme de önemlidir. DMEM 5/5 at serumu içerir; bu, eğer glial hücrelerin devamlı kullanılması halinde kültüre egemenlik kazandıracak ve kültürler zayıf nöronal aktiviteye neden olacaktır, ancak kültürler sağlıklı görünecektir 17 . Kültürleri planlandığı gibi besleme ve bunları uygun kuluçka koşullarında tutmak da çok önemlidir. ÇÇA&#39;larda hücre kültürlerinin plaklanması, optimal sonuçların altında kalmasına neden olabilecek birçok değişkeni içerir. Hedef, hücrelerin mükemmel bir &quot;halı&quot; olmasına rağmen, yukarıda bahsedilen kritik adımları atlama başarısızlığı yetersiz hücre olgunlaşması veya bulaşma ile sonuçlanır. Fakir hücre adezyonu, fakir hücre olgunlaşmasından farklıdır, aynı zamanda bir endişe kaynağıdır. Bunun nedeni, kaplamadan önce zayıf MEA hazırlığı veya eski ortamın kullanılması da dahil olmak üzere birçok faktörden kaynaklanabilir. Eğer nöral hücre kültürü için stabilize edilmiş L-glutamin ve serum içermeyen bir form içeren eski ortam varsa (bkz. Malzeme Tablosu) Kullanılır, hücreler başlangıçta yapışır, ancak yaklaşık iki hafta sonra kaybolurlar. Bakteri kontaminasyonu kalıcı bir sorundaysa, ampisilin veya kalem strep gibi bir antibiyotik ortama ilave edilebilir. Mantar kontaminasyonunu tedavi etmek için mevcut fungisitler de mevcuttur. Bunlar, kültürlerin sonucunu etkileyebilecek daha yaygın değişkenlerden bazılarıdır. Yalnızca zaman ve deneyim sonrasında karşılaşılacak diğer pek çok şey vardır. Cam mikroelektrodlarının kullanımıyla kıyaslandığında, bu teknik ağ dinamikleri ve farmakolojik cevapların incelenmesi için mükemmeldir. Birçok farklı uzaysal ve zamansal uyarılma modelinin kullanılmasını sağlar ve aynı anda birden çok bölgedeki nöronal yanıtların kaydedilmesini sağlar. Önceki gruplar burada açıklananlara benzer protokoller kullanarak ilginç sonuçlar verdi 18 . Kültürler hafta veya ay sürer ve aynı kültürler tekrar kullanılabilir olduğundan, bu teknik aynı zamandaAynı ağ üzerinde zamanla çoklu denemeler için geçerlidir. Bununla birlikte, bu tekniğin sınırları vardır. ÇÇA&#39;lar invaziv değildir. Bu nedenle, yalnızca pipet ile yama tutma veya hücre içi kayıt yerine, hücre dışı aktiviteyi kaydedebilirler. Dahası, bir dizideki her elektrod birkaç hücre ile kaplandığından, tek bir nöronun etkinliğini çözmek mümkün değildir. Tersine, bunlar in vitro kültürler olduğundan, beyindeki ağların yapısal özelliklerini tam olarak üretemezler. Ayrıca, aktivite, hücrelerin pH dengesini korumak için CO2 atmosferi sağlayan bazı mekanizmalar olmaksızın, aynı anda 30 dakikadan az sürede kaydedilebilir. Bu tekniğe hakim olunca, elektrik stimülasyonlu veya elektriksel uyarı olmadan farmakolojik manipülasyonlar araştırılabilir. Nöronal ağlarda öğrenmeyi ve hafıza oluşumunu araştıran yeni protokoller de birlikte tasarlanabilir ve test edilebilirHipokampal veya omurilik ağları için rotokolatlar. Şebekelerin teşvik edilmesi ve eğitimi için protokoller daha önce yayınlanmış ve bunlardan bazıları, Eytan ve diğerleri tarafından önerilen &quot;seçici adaptasyon&quot; gibi in vivo protokollerle daha da geliştirilmiştir . 19 . Birkaç protokol test edildi. Bununla birlikte, sadece burada 2005 yılında Ruaro tarafından önerilen tetanoz prosedürüne yapılan bir değişiklik 14,20&#39;de sunulmuştur.

Mikro elektrot dizileri (MEA&#39;lar) ilaç toksisitesini araştırmak, yeni nesil kişiselleştirilmiş tıp için tasarım paradigmalarını ve nöronal kültürlerde ağ dinamikleri incelemek için kullanılabilir 1 . Yalnızca tek bir hücreden aktiviteyi kaydedebilen ya da elektrodu tek bir alanda çevreleyen nöronlardan hücre dışı tepkileri kaydedebilen cam pipetle alan kaydı gibi daha geleneksel yöntemlerin aksine, MEA&#39;lar aynı anda Her elektrotu tek tek yerleştirmenin zorlu görevini gerektirmeden hücre kültüründe birden fazla bölgeden kayıt yapabilirsiniz. Bu, o kültür içinde bir ağ oluşturan hücreler grubu arasındaki dinamik etkileşimlerin çalışılmasına olanak tanır. Ayrıca, 2 , 3 , 4 , 5 şebeke ateşleme modelleri ve şebeke kontrolü için elektriksel uyarıların etkisi 6 &lt;/ Sup&gt; nöronal kültürlerde iyi belgelenmiştir ve sayısız konfigürasyon elektrik stimülasyonu ve kontrolleri, aynı deney düzeneğinde kolayca uygulanabilir ve geniş bir aralıktaki uzaysal-zamansal dinamiklerin araştırılmasına izin verilir. Bu in vitro araştırmalarda ilgi çekici anahtar dinamiklerden biri, kültürlü şebekelerin öğrenmeyi gösteren özellikleri gösteren 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 olmuştur. Peixoto Laboratuarı daha önce, yüksek frekanslı eğitim sinyallerinin etkilerini Ruaro ve ark. 14 , mikroelektrod dizilerine kaplanmış fare nöronlarının ağlarında 15 . Bu deneylerde, şebekeler yanıt izlemede artış gösterdiElektriksel uyarım ile indüklenen g eğitimi. Artan tepki, uyarıcı tanıma yoluyla öğrenme biçimi olarak kabul edildi; ağlar belirli bir uyarı ( örn., Eğitim) protokolünün uygulanmasından sonra uyarandaki bir değişime tutarlı bir şekilde yanıt verdi. Bu protokol, ÇÇ&#39;larda nöronal hücrelerin nasıl kültürlendiğini, kaplanan yemeklerin% 95&#39;inden başarıyla kaydedildiğini, uyarı modellerine cevap vermek için ağları eğitmenin, tek üniteli aktiviteleri sıralamanın, histogramların çizilmesini ve sonuçların nasıl yorumlanacağını gösteren bir protokol oluşturmayı göstermektedir. Böyle deneyler. Nöronal kültürlerin uyarılması ve kaydedilmesi için tescilli bir sistemin kullanılması ( Malzeme Tablosuna bakınız ) yanı sıra, nöronal üniteleri sıralamak için yazılım paketlerinin uygulanması (Malzemelerin Tablosuna bakınız ) gösterilmiştir . Özel tasarlanmış bir grafik kullanıcı arabirimi (Malzeme Tablosuna bakınız) post-s&#39;leri görselleştirmek için kullanılırTimulus zamanı histogramları, inter-burst aralıkları ve patlamanın süresini belirlemek ve ayrıca bir antrenman protokolü öncesi ve sonrasında uyarıya hücresel cevabı karşılaştırmak için kullanılmıştır.

<table><tbody><tr><td>Askorbik Asit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4403</td><td>4 mg / mL alikotlar</td></tr><tr><td>B-27</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td>Nöral hücre kültürü için serum içermeyen takviye yapın. 1 mL alikot yapın ve dondurun</td></tr><tr><td>Beherler - cam - 100 mL</td><td>VWR</td><td>13912-160</td><td></td></tr><tr><td>Beherler - cam - 500 mL</td><td>VWR</td><td>10754-956</td><td></td></tr><tr><td>Künt uçlu başparmak forseps</td><td>World Precision Instruments</td><td>500365-G</td><td></td></tr><tr><td>Kriyojenik flakon - steril, 2 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-500-26</td><td></td></tr><tr><td>Kriyojenik flakon - steril, 5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-500-27</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco Life Teknolojili</td> DMEM <td>10569-010</td><td>Stabilize edilmiş bir L-glutamin DNaz formu içeren hücre kültürü ortamı</td></tr><tr><td></td><td>Worthington Biyokimyasal</td><td>LK003172</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-451</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu (FBS)</td><td>ATCC</td><td>30-2030</td><td></td></tr><tr><td>İnce uçlu başparmak forseps</td><td>Dünya Hassas Aletler</td><td>501324-G</td><td></td></tr><tr><td>Cam Pipetler</td><td>VWR</td><td>14673-010</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX -- I (100X)</td><td>Gibco Life Technology</td><td>35050-061</td><td>Takviye olarak kullanılan stabilize edilmiş bir L-glutamin formu</td></tr><tr><td>Hemositometre çipi</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-600-101</td><td></td></tr><tr><td>Hazırda Bekletme EB tam</td><td>BrainBits</td><td>D00118</td><td>Ortam CO2 hücresi depolama ortamı</td></tr><tr><td>At Serumu</td><td>Atlanta Biyolojikler</td><td>S12195H</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L2020-1MG</td><td></td></tr><tr><td>MCS filtre amplifikatörü</td><td>Çok Kanallı Sistem</td><td>FA60SBC</td><td></td></tr><tr><td>MCS headstage/pre-amplifikatör</td><td>Çok Kanallı Sistem</td><td>MEA1060-INV</td><td></td></tr><tr><td>MCS mikroelektrot dizisi</td><td>Çok Kanallı Sistem</td><td>60MEA200/ 10iR-ITO</td><td></td></tr><tr><td>MCS güç kaynağı</td><td>Çok Kanallı Sistem</td><td>PS20W</td><td></td></tr><tr><td>MCS sinyal bölücü</td><td>Çok Kanallı Sistem</td><td>SDMEA</td><td></td></tr><tr><td>MCS uyaran üreteci</td><td>Çok Kanallı Sistem</td><td>STG4002</td><td></td></tr><tr><td>MCS sıcaklık kontrol cihazı</td><td>Çok Kanallı Sistem</td><td>TC02</td><td></td></tr><tr><td>Medya saklama şişesi - cam 500 mL</td><td>VWR</td><td>10754-818</td><td>Otoklav</td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj tüpleri - 0.4 mL</td><td>Thermo Fisher</td><td>3485</td><td>Otoklav</td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj tüpleri - 2 mL</td><td>Thermo Fisher</td><td>3434ECONO</td><td>Otoklav</td></tr><tr><td>Mikropipet uçları - 10 &mu; L</td><td>VWR</td><td>37001-166</td><td>Otoklav</td></tr><tr><td>Mikropipet uçları - 1.000 &mu; L&nbsp;</td><td>VWR</td><td>13503-464</td><td>Otoklav</td></tr><tr><td>Mikropipet uçları - 200 &mu; L&nbsp;</td><td>VWR</td><td>37001-596</td><td>Otoklav</td></tr><tr><td>Mikropipetleyici - 10 &mu; L&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>4641170N</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipetleyici - 1.000 &mu; L&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>4641210N</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipetleyici - 200 &mu; L&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>4641230N</td><td></td></tr><tr><td>Papain - 0.22 Filtrelenmiş</td><td>Worthington Biyokimyasal</td><td>LK003178</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin (Kalem Strep)</td><td>Thermo Fisher</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Petri kapları -100 mm tek kullanımlık</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-100D</td><td></td></tr><tr><td>Petri kapları -100 mm cam</td><td>VWR</td><td>10754-788</td><td></td></tr><tr><td>Petri kapları -35 mm&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-100A</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tampon salin (PBS) (1x)</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Plazma Temizleme Sistemi</td><td>Plazma Etch, Inc.</td><td>PE-50</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-lizin hidrobromür (PDL)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>P6407-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Polietilen konik (santrifüj) tüp -15 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-527-90</td><td></td></tr><tr><td>Polipropilen konik (santrifüj) tüp -50 mL</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Prosedür maskeleri</td><td>Imco</td><td>1530-imc</td><td></td></tr><tr><td>Piruvat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4562-5G</td><td></td></tr><tr><td>Neşter bıçakları</td><td>Dünya Hassas Aletler</td><td>&nbsp; 500237-G</td><td></td></tr><tr><td>Makas - iris</td><td>World Hassas Aletler</td><td>14111-G</td><td></td></tr><tr><td>Makas - büyük</td><td>Dünya Hassas Aletler</td><td>14214</td><td></td></tr><tr><td>Makas - küçük cerrahi</td><td>World Precision Instruments</td><td>&nbsp; 501733-G</td><td></td></tr><tr><td>Serolojik pipet - steril, 1 mL&nbsp;</td><td>VWR</td><td>89130-892</td><td></td></tr><tr><td>Serolojik pipet - steril, 2 mL&nbsp;</td><td>VWR</td><td>89130-894</td><td></td></tr><tr><td>Serolojik pipet - steril, 25 mL&nbsp;</td><td>VWR</td><td>89130-900</td><td></td></tr><tr><td>Serolojik pipet - steril, 50 mL&nbsp;</td><td>VWR</td><td>89130-902</td><td></td></tr><tr><td>Yazılımı: Matlab GUI</td><td>Peixoto Lab</td><td>npeixoto@gmu.edu</td><td>.mat dosyalarını analiz etmek için kullanılır. İstek üzerine ücretsiz olarak temin edilebilir. Bir kopya istemek için npeixoto@gmu.edu ile iletişime geçin.</td></tr><tr><td>Yazılım: MCS MC_Rack</td><td>Çok Kanallı Sistem</td><td>N/A</td><td>Veri toplama için kullanılır</td></tr><tr><td>Yazılım: NeuroExplorer</td><td>Plexon&nbsp;</td><td>http://www.plexon.com/products/neuroexplorer</td><td>.nex dosyalarını .mat Yazılımına dönüştürmek için kullanılır</td></tr><tr><td>: Çevrimdışı Sıralayıcı</td><td>Plexon&nbsp;</td><td>http://www.plexon.com/products/offline-sorter</td><td>Nöral ani yükselmeleri sıralamak ve veri dosyalarını .plx'e ve ardından .nex'e dönüştürmek için kullanılır</td></tr><tr><td>Yazılım Kılavuzu: MCS MC_Rack</td><td>Çok Kanallı Sistem</td><td></td><td>https://www.multichannelsystems.com/sites/multichannelsystems.com/files/documents/manuals/MC_Rack_Manual.pdf</td></tr><tr><td>Yazılım Kılavuzu: NeuroExplorer</td><td>Plexon&nbsp;</td><td></td><td>https://www.neuroexplorer.com/downloads/Nex3Manual.pdf</td></tr><tr><td>Yazılım Kılavuzu: Çevrimdışı Sıralayıcı</td><td>Plexon&nbsp;</td><td></td><td>www.plexon.com/system/files/downloads/Offline%20Sorter%20v2.8%20Manual.pdf</td></tr><tr><td>Spatula - küçük çift uçlu</td><td>World Precision Instruments</td><td>&nbsp; 503440</td><td></td></tr><tr><td>Stericup 0.22 ve mikro; m gözenekli filtre - 250 mL</td><td>Milipore SCGVU02RE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipeti - geniş çaplı&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>335-1S</td><td></td></tr><tr><td>Transfer pipeti - küçük delikli&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>242-1S</td><td></td></tr><tr><td>Tripan mavisi</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8154-20ML</td><td></td></tr><tr><td>Whatman filtre kağıdı</td><td>Whatman</td><td>1442 150</td><td>8 turta dilimi halinde kesin ve bir cam Petri kabında otoklav</td></tr></tbody></table>

mikro elektrod dizilerinde nöronal hücre kültürlerinin uyarılmasına ağ yanıtına zamana bağlı artış

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Mikro elektrod dizileri (MEA&#39;lar) ilaç toksisitesini araştırmak, yeni nesil kişiselleştirilmiş tıp için tasarım paradigmalarını ve nöronal kültürlerde ağ dinamikleri incelemek için kullanılabilir. Tek bir hücreden yalnızca aktivite kaydedebilen yama sıkıştırma gibi geleneksel yöntemlerin aksine, ÇÇ&#39;lar, her bir elektrodun ayrı ayrı yerleştirilmesi zorlu bir görev gerektirmeden, bir ağdaki birden çok alandan aynı anda kayıt yapabilir. Dahası, çok sayıda kontrol ve uyarılma konfigürasyonu, aynı deneysel kurulumda kolayca uygulanabilir ve geniş bir dinamik aralığı keşfedilebilir. Bu in vitro araştırmalarda ilgi çekici anahtar dinamiklerden biri, kültürlü şebekelerin öğrenme göstergesinin özelliklerini ne ölçüde sergilediğidir. MEA&#39;lar üzerinde kültüre edilen fare nöronal hücreleri, elektrik uyarımı ile indüklenen eğitimi takiben yanıtta bir artış sergilemektedir. Bu protokol, ÇKA&#39;lardaki nöronal hücrelerin nasıl kültive edileceğini gösterir; Başarıyla tekrarKaplamalı tabakların% 95&#39;inden fazla kablo; Teşvik modellerine cevap vermek için ağları eğitmek için bir protokol oluşturun; Ve bu tür deneylerden elde edilen sonuçları sıralayabilir, arsa ve yorumlayabilir. Nöronal kültürlerin uyarılması ve kaydedilmesi için tescilli bir sistem kullanılması gösterilmiştir. Yazılım paketleri ayrıca nöronal üniteleri sıralamak için kullanılır. Özel uyarlanmış bir grafik kullanıcı arabirimi, uyarı sonrası zaman histogramlarını, kesintisiz aralıklarla ve patlamanın süresini görselleştirmenin yanı sıra, bir eğitim protokolü öncesi ve sonrasında uyarıya hücresel yanıtı karşılaştırmak için kullanılır. Son olarak, bu araştırma çabasının temsili sonuçları ve gelecekteki yönleri tartışılmaktadır.

Çok elektrotlu diziler üzerinde kültürlenen fare nöronal hücreleri, elektrik stimülasyonunu takiben yanıtta bir artış sergilemektedir. Bu protokol, nöronların nasıl kültürlendiğini, aktivitenin nasıl kaydedildiğini ve uyarılma modellerine cevap vermek için ağları eğitmek için nasıl protokol oluşturacağını gösterir.

Mikro Elektrod Dizilerinde Nöronal Hücre Kültürlerinin Uyarılmasına Ağ Yanıtına Zamana Bağlı Artış

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

Bu prosedürün genel amacı, mikroelektrot dizileri üzerinde nöronal ağları kültüre etmek, kaydetmek ve uyarmak için E17 fare nöronal dokusunu izole etmek ve ilişkilendirmektir. Bu yöntem, öğrenme ve belleğin temel mekanizmalarıyla ilgili ağ dinamikleri çalışmalarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, mikroelektrot dizilerinin aynı anda birden fazla bölgeden kayıt yapabilmesi ve bu nedenle, tek bir bölgeden kayıt yapan geleneksel cam pipet yöntemine kıyasla daha iyi uzamsal ve zamansal çözünürlük sunabilmesidir.Bu yöntem, öğrenme ve hafızanın ağ dinamikleri hakkında bilgi sağlayabilmesinin yanı sıra, ilaç toksisitesini araştırmak veya yeni nesil, kişiselleştirilmiş tıp paradigmaları tasarlamak için de kullanılabilir. Diseksiyon ve disosiyasyon süreci sırasında doku manipülasyonunun sadece protokolleri okuyarak öğrenilmesi zor olduğundan, bu sürecin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir. Diziyi hazırlamak için, steril pipet uçları kullanarak her bir MEA'nın merkezine 40 ila 50 µL çözünmüş laminin ve kontrol plakalarına 0,2 mL laminin ekleyin.Biyogüvenlik kabini içindeki tüm MEA'ların ve kontrol kaplarının üzerini kapatın ve bir saat boyunca 37 derece Celsius'taki bir inkübatöre aktarın. Bir saat sonra, steril Pasteur pipetleri ile vakumlayarak MEA'ların merkezindeki fazla laminini dikkatlice uzaklaştırın ve ekim yapmadan önce yüzeyin havada kurumasını bekleyin. Ardından, dört adet 100 milimetrelik Petri kabına L-15 medyumu dökün, üzerlerini kapatın ve ortam donup katılaşana kadar değil, kar kıvamına gelene kadar yaklaşık 40 ila 60 dakika boyunca eksi 20 derece Celsius'luk bir dondurucuya yerleştirin.Diseksiyona hazırlanmak için, cam bir Petri kabını buz dolu bir tepsiye ters şekilde yerleştirin. Ardından hayvanın alt karın bölgesini %70 etanol ile püskürtün. Küçük cerrahi makaslar kullanarak, alt karnın derisinde ve deri altı yağ dokusunda, kesi toraks boşluğunun distal uçlarına kadar uzanacak şekilde V şeklinde bir kesi yapın ve uterusu açığa çıkarın.Embriyolar arasındaki uterusu forseps kullanarak dikkatlice kaldırın. Tüm uterus serbest kalana kadar bağ dokusunu disseksiyon makasıyla kesin. Ardından, kan kalıntılarını temizlemek için uterusu kısa bir süre %70 ethanol ile durulayın ve soğuk L-15 ile doldurulmuş dört Petri kabından birine yerleştirin.Ardından, iki çift ince uçlu pens kullanarak her bir embriyoyu uterustan ve iç embriyonik keseden çıkarın. Serbest kalan embriyoları soğuk L-15 ile dolu ikinci kaba yerleştirin; ardından başları üçüncü Petri kabına, gövdeleri ise dördüncü kaba aktarın. Biyogüvenlik kabininde, soğutulmuş cam Petri kabı platformunun üzerine otoklavlanmış bir filtre kağıdı parçası yerleştirin ve filtre kağıdının üzerine bir embriyo başı koyun.Ardından, iris makasının alt ucunun keskin kenarını kafatasının tabanına yerleştirin; alt ucu kafatasının iç yüzeyine yaslayarak beyinden uzak tutun, oksipital plakayı kesin ve ardından paryetal plakalar arasındaki orta hat boyunca ilerleyin. Kıkırdaksı frontal kafatası plakaları arasında rostral yönde kesmeye devam edin. Daha sonra, oksipital plakanın merkezinden başlayarak, merkezdeki kesinin soluna ve sağına dik bir kesi yapın.Ardından, tamamen beynin altına girene kadar küçük bir spatülü beynin ventral yüzeyi ile alt kafatası plakalarının arasına dikkatlice kaydırın. Daha sonra beyni çıkarmak için spatülü yukarı kaldırın. Temiz bir spatül kullanarak önce olfaktör bulbu çıkarın, ardından frontal lobu trapezoidal bir düzende diseke edin.Ardından, dokuyu saklama ortamı içeren 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Bu işlemde, dokuyu ince parçalara ayırmak için iki adet steril bistüri bıçağı kullanın. Daha sonra, Petri kabındaki kıyılmış dokuya 2,5 mililitre Dnase papain karışımı ekleyin.Tüm dokuların çözelti içinde serbest olduğundan ve kabın tabanına yapışmadığından emin olmak için Petri kabını hafifçe çalkalayın. Ardından kabı 15 dakika boyunca 37 °C'deki bir inkübatöre yerleştirin. Steril bir biyogüvenlik kabininde, tüm medyumu ve dokuyu 5 mL'lik steril bir kriyojenik tüpe aktarmak için steril geniş ağızlı bir transfer pipeti kullanın.Aynı transfer pipetinin ucunu tüpün tabanına yakın bir yere yerleştirin ve karışımı 10 ila 15 kez nazikçe pipetle karıştırın. Ardından, disosiye edilmiş hücre karışımına iki mililitre ısıtılmış DMEM 5/5 ekleyin ve santrifüj tüpünün kapağını kapatın. Ters çevirerek nazikçe karıştırın ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca 573 ×g'de santrifüjleyin.Biyogüvenlik kabininde, peleti bozmadan tüm süpernatantı uzaklaştırın. Ardından, hücreleri yeniden süspansiyon haline getirmek için tüpteki pelete bir mililitre ısıtılmış DMEM 5/5 ekleyin. Karışım homojen hale gelene kadar nazikçe aşağı yukarı pipetleme yaparak peleti dağıtmak için steril, dar uçlu bir transfer pipeti kullanın.Ardından, hücre süspansiyonundan 10 µL'yi bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Biyogüvenlik kabininin dışında, mikro santrifüj tüpündeki 10 µL hücre süspansiyonuna 10 µL trypan blue ekleyin. Sonrasında, hücreleri saymak için tek kullanımlık bir hemositometre çipine 10 µL trypan blue hücre süspansiyonu yükleyin.Biyogüvenlik kabininde, steril bir mikropipet kullanarak her bir dizinin merkezine ve her bir kontrol Petri kabına 50 µL hücre süspansiyonu aktarın. Ardından, kapakları kapalı olan Petri kaplarını 37 °C'ye ayarlanmış bir inkübatörde üç ila dört saat bekletin. Sonrasında, her bir MEA'ya nazikçe 1 mL ısıtılmış DMEM 5/5 ekleyin.Besiyerini, MEA'nın iç kenarları boyunca her seferinde bir damla şeklinde dikkatlice ekleyin ve hücrelerin dizinin merkezinden yıkanıp gitmesini önleyin. Ardından, her MEA'nın üzerine gaz geçirgen bir FEP membran içeren bir kapak yerleştirin ve bunları inkübatöre geri koyun. İki gün sonra, kaptaki besiyerini çekerek ısınmış DMEM+ ile tam bir besiyeri değişimi gerçekleştirin.Pipet ucunu dikkatle iç duvarın üzerine yerleştirin ve bir mililitre ısıtılmış DMEM+ boşaltın. Sonraki beslemeler için, kaptan 500 mikrolitre ortam çekin ve tekrar 500 mikrolitre ısıtılmış DMEM+ ekleyin. Bu prosedürde, dizinin üzerindeki hücre örtüsünü ve bakteri veya mantar kaynaklı kontaminasyonu kontrol etmek için kap örneklerini gün aşırı mikroskop altında inceleyin. Kültürleri inkübatörden çıkarmadan önce sıcaklık kontrol cihazını fişe takın ve sistemini çalıştırarak ön yükselticinin ısıtmalı taban plakasının 35 degrees Celsius sıcaklığa ulaşmasını sağlayın.Ardından, MEA kuyusundaki siyah çizgi referans toprağıyla hizalanacak şekilde kapaklı kültürü ön yükselticiye yerleştirin. Ön yükseltici pinlerinin, ön yükselticinin üst kısmının sabitlendiğinden ve kültür kapağının hala takılı olduğundan emin olacak şekilde hizalandığını kontrol edin. Son olarak, sinyalleri görselleştirmeye başlamak için yazılım ortamında başlat'a basın.Ana pencerede Spikes, Detection, Automatic seçeneklerini belirleyin, standart sapma değerini eksi beş olarak değiştirin ve eşiği sıfırlamak için Refresh düğmesine tıklayın. Sinyalleri görselleştirdikten sonra, aktivite kaydına başlamak için Stop, Record ve Play düğmelerine tıklayın. Embriyonik fare nöronları, her bir elektrottan ağ genelindeki nöronal aktivitenin eş zamanlı olarak kaydedilmesine olanak tanıyan 60 kanallı MEA'lara ekilmiştir.Burada, eğitim öncesi ve sonrası stimülasyona yanıt olarak sekiz elektrottan alınan aktivitenin temsili bir raster grafiği yer almaktadır. Dikey kırmızı çizgi stimulus zamanını, siyah işaretler ise aksiyon potansiyellerini belirtmektedir. Eğitim öncesinde, kanallar genelinde stimulus pulsuna karşı anlık bir yanıt görülmektedir.Eğitim sonrası dönemde ağ, stimülasyona verilen anlık yanıtın yanı sıra daha uzun süreli bir aktivite yanıtı sergilemektedir. Burada, 12 eğitimli ve 10 kontrol ağının ortalaması gösterilmiştir; eğitimli ağlar belirgin şekilde değişmiş spike frekansları göstermektedir. Bu videoyu izledikten sonra, embriyonik farelerden nöronal dokunun nasıl izole edileceğini ve ilişkilendirileceğini iyi bir şekilde anlamış olmalı ve mikroelektrot dizilerinden nöronal ağları kültürleme, kaydetme ve stimüle edebilme becerisi kazanmalısınız.

time-dependent-increase-network-response-to-stimulation-neuronal-cell

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu protokol kurmak, bakımını, kayıt ve elektriksel uyarıcı ÇÇA üzerindeki kültürleri için gerekli bilgileri sağlar.

Nasıl Kültür, Kayıt ve mikro-elektrot Diziler Sinir Ağları Teşvik (ÇÇA)

Korteks kritik devlet dinamikleri göstergesi nöronal çığ, yani uzay-zamansal ölçek değişmeyen aktivite patlamaları, çalışma için sağlam bir yol. Çığ faaliyet uzun vadeli ölçümler için tam kontrollü koşullar altında düzlemsel bütünleşik çoklu-elektrod (MEA) ile sağlar kültürlü korteks yüzeysel katmanları geliştirme kendiliğinden ortaya çıkar.

Organotipik Kültürleri nöronal Çığ Çok elektrot Dizi Kayıtlar

Video, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden (hiPSC'ler) türetilen nöronların elektrofizyolojik aktivitesini kaydetmek için bir mikroelektrot dizisinin (MEA) nasıl kullanılacağını gösterir. Bir nöron-astrosit ko-kültürü içeren çok kuyulu bir MEA'dan elde edilen elektrofizyolojik aktivite, ağdaki birden fazla nörondan gelen aksiyon potansiyellerini tespit etmek için kaydedilir ve hiPSC'lerin nöronlara başarılı bir şekilde farklılaştığını doğrular.

Mikro-elektrot dizileri kullanılarak nöronal ağların elektrofizyolojik aktivitesinin ölçülmesi

Bu video, 3B kokültür kürelerinde sinaptik fizyolojiyi ölçmek için çoklu elektrot dizisinin (MEA) kullanılması prosedürünü göstermektedir. Bu yöntem, 3B küreler içindeki sinir ağı dinamiklerini ve sinaptik ağ patlama aktivitesini anlamayı sağlar.

3D Kokültür Kürelerinde Sinaptik Fizyolojiyi Ölçmek için Çoklu Elektrot Dizilerinin Kullanılması

Bu çalışmada, 3 boyutlu nöronal kültürlerin düzlemsel Mikro-Elektrot Dizilerine (MEA'lar) bağlandığı yeni bir deneysel model presented. 3D ağlar, nöronların üzerinde büyüdüğü ve birbirine bağlı 3B yapılar oluşturduğu cam mikro boncuklardan oluşan bir iskelede nöronların tohumlanmasıyla inşa edilir.

Mikro Elektrot Diziler 3D Engineered Nöronal Kültürler Arayüz: Yenilikçi<em&gt; İn Vitro</em&gt; Deneysel Model

Nöronal yanıt profillerini incelemek ve stimülasyon parametrelerini optimize etmek için çoklu elektrot dizileri üzerinde primer murin spiral ganglion nöron eksplantlarını kültürlemek için bir protokol sunuyoruz. Bu tür çalışmalar, koklear implantların nöron-elektrot arayüzünü, hastalarda işitmeye ve cihazın enerji tüketimine fayda sağlayacak şekilde iyileştirmeyi amaçlamaktadır.

Çok elektrot dizilerde Spiral Ganglion Nöron Eksplantasyon Kültür ve Elektrofizyoloji

Çevresel toksinlere maruz akut gelişmekte olan embriyo etkileyebilir. Bisphenols sinir sistemi üzerinde olumsuz bir etkisi olduğu bilinmektedir gibi kimyasallar engellemeden endokrin. Burada bir vitro Omurgalılar (civciv embriyo) nöronal ağ modeli toksin pozlama erken embriyo üzerinde fonksiyonel etkisini incelemek için bir iletişim kuralı'nı açıklar.

Değerlendirme endokrin omurgalı Neural ağ işlevi çoklu elektrot dizileri kullanarak geliştirme bileşikler engellemeden etkilerinden

Bu iletişim kuralı mikrosıvısal aygıtlarla çalışmak için nöronal kültürler iletimde Aksiyon potansiyeli vitro elektrot dizilerin nasıl göstermek amaçlamaktadır. Veri analizi, yani algılama ve karakterizasyonu Aksiyon potansiyelleri, yayma, gerçekleştirilen yeni bir kullanarak gelişmiş, henüz Kullanıcı dostu ve serbestçe kullanılabilir, hesaplama aracı.

Nöronal iletişim ve aksonal sinyal yayma çalışmak için elektrot dizileri ile ara yüz kullanımını Havacilik

Bu makale, insan kaynaklı pluripotent kök hücre türevi kardiyomiyosit (hiPSC-CM) ağlarının gelişimi için bir dizi protokolün yanı sıra, hücre membranı hareket potansiyeli ölçümleri için ters şekilde electroporate etmek için multiwell MEA plakaları üzerinde kültürlü bir set içerir. Yüksek verimlilik kayıtları aynı hücre sitelerinden gün içinde tekrar tekrar elde edilir.

Tekrarlayan eylem potansiyel kayıtlar için Multiwell mikro elektrot diziler üzerinde insan iPSC-türetilen Kardiyomiyoksit ağları

Mikrometre ölçeğinde 3D baskı, nöronal hücre kültürleri için polimerik cihazların hızlı prototiplenmesini sağlar. Bir prensip kanıtı olarak, nöronlar arasındaki yapısal bağlantılar, nörit büyümesini etkileyen bariyerler ve kanallar oluşturularak kısıtlanırken, bu tür manipülasyonun işlevsel sonuçları hücre dışı elektrofizyoloji tarafından gözlemlendi.

Mikro Ölçekli Nöronal Hücre Kültürü Cihazlarının İki Foton Polimerizasyonu 3D Baskısı

Bu protokol, in vitro epilepsiyi modellemek için dorsal-ventral kaynaşmış asembloidleri çoklu elektrot dizileri üzerinde stabil bir şekilde plakalamayı amaçlamaktadır.

İnsan Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Beyin Topluluklarını Kullanarak Epilepsiyi Modellemek için Çok Elektrotlu Bir Dizi Platformu

Keşfedin E17 fare nöronal dokusunun izolasyonu ve çoklu elektrod dizilerinde kültürü. Bu yöntem öğrenme ve hafıza mekanizmalarını incelemek için ağ dinamiklerini kaydetmeyi ve uyarmayı sağlar.

Mikro Elektrod Dizilerinde Nöronal Hücre Kültürlerinin Uyarılmasına Ağ Yanıtına Zamana Bağlı Artış

Daha fazla video keşfet