Mikro Elektrod Dizilerinde Nöronal Hücre Kültürlerinin Uyarılmasına Ağ Yanıtına Zamana Bağlı Artış

Bu prosedürün genel amacı, mikroelektrot dizileri üzerinde nöronal ağları kültüre etmek, kaydetmek ve uyarmak için E17 fare nöronal dokusunu izole etmek ve ilişkilendirmektir. Bu yöntem, öğrenme ve belleğin temel mekanizmalarıyla ilgili ağ dinamikleri çalışmalarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, mikroelektrot dizilerinin aynı anda birden fazla bölgeden kayıt yapabilmesi ve bu nedenle, tek bir bölgeden kayıt yapan geleneksel cam pipet yöntemine kıyasla daha iyi uzamsal ve zamansal çözünürlük sunabilmesidir.

Bu yöntem, öğrenme ve hafızanın ağ dinamikleri hakkında bilgi sağlayabilmesinin yanı sıra, ilaç toksisitesini araştırmak veya yeni nesil, kişiselleştirilmiş tıp paradigmaları tasarlamak için de kullanılabilir. Diseksiyon ve disosiyasyon süreci sırasında doku manipülasyonunun sadece protokolleri okuyarak öğrenilmesi zor olduğundan, bu sürecin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir. Diziyi hazırlamak için, steril pipet uçları kullanarak her bir MEA'nın merkezine 40 ila 50 µL çözünmüş laminin ve kontrol plakalarına 0,2 mL laminin ekleyin.

Biyogüvenlik kabini içindeki tüm MEA'ların ve kontrol kaplarının üzerini kapatın ve bir saat boyunca 37 derece Celsius'taki bir inkübatöre aktarın. Bir saat sonra, steril Pasteur pipetleri ile vakumlayarak MEA'ların merkezindeki fazla laminini dikkatlice uzaklaştırın ve ekim yapmadan önce yüzeyin havada kurumasını bekleyin. Ardından, dört adet 100 milimetrelik Petri kabına L-15 medyumu dökün, üzerlerini kapatın ve ortam donup katılaşana kadar değil, kar kıvamına gelene kadar yaklaşık 40 ila 60 dakika boyunca eksi 20 derece Celsius'luk bir dondurucuya yerleştirin.

Diseksiyona hazırlanmak için, cam bir Petri kabını buz dolu bir tepsiye ters şekilde yerleştirin. Ardından hayvanın alt karın bölgesini %70 etanol ile püskürtün. Küçük cerrahi makaslar kullanarak, alt karnın derisinde ve deri altı yağ dokusunda, kesi toraks boşluğunun distal uçlarına kadar uzanacak şekilde V şeklinde bir kesi yapın ve uterusu açığa çıkarın.

Embriyolar arasındaki uterusu forseps kullanarak dikkatlice kaldırın. Tüm uterus serbest kalana kadar bağ dokusunu disseksiyon makasıyla kesin. Ardından, kan kalıntılarını temizlemek için uterusu kısa bir süre %70 ethanol ile durulayın ve soğuk L-15 ile doldurulmuş dört Petri kabından birine yerleştirin.

Ardından, iki çift ince uçlu pens kullanarak her bir embriyoyu uterustan ve iç embriyonik keseden çıkarın. Serbest kalan embriyoları soğuk L-15 ile dolu ikinci kaba yerleştirin; ardından başları üçüncü Petri kabına, gövdeleri ise dördüncü kaba aktarın. Biyogüvenlik kabininde, soğutulmuş cam Petri kabı platformunun üzerine otoklavlanmış bir filtre kağıdı parçası yerleştirin ve filtre kağıdının üzerine bir embriyo başı koyun.

Ardından, iris makasının alt ucunun keskin kenarını kafatasının tabanına yerleştirin; alt ucu kafatasının iç yüzeyine yaslayarak beyinden uzak tutun, oksipital plakayı kesin ve ardından paryetal plakalar arasındaki orta hat boyunca ilerleyin. Kıkırdaksı frontal kafatası plakaları arasında rostral yönde kesmeye devam edin. Daha sonra, oksipital plakanın merkezinden başlayarak, merkezdeki kesinin soluna ve sağına dik bir kesi yapın.

Ardından, tamamen beynin altına girene kadar küçük bir spatülü beynin ventral yüzeyi ile alt kafatası plakalarının arasına dikkatlice kaydırın. Daha sonra beyni çıkarmak için spatülü yukarı kaldırın. Temiz bir spatül kullanarak önce olfaktör bulbu çıkarın, ardından frontal lobu trapezoidal bir düzende diseke edin.

Ardından, dokuyu saklama ortamı içeren 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Bu işlemde, dokuyu ince parçalara ayırmak için iki adet steril bistüri bıçağı kullanın. Daha sonra, Petri kabındaki kıyılmış dokuya 2,5 mililitre Dnase papain karışımı ekleyin.

Tüm dokuların çözelti içinde serbest olduğundan ve kabın tabanına yapışmadığından emin olmak için Petri kabını hafifçe çalkalayın. Ardından kabı 15 dakika boyunca 37 °C'deki bir inkübatöre yerleştirin. Steril bir biyogüvenlik kabininde, tüm medyumu ve dokuyu 5 mL'lik steril bir kriyojenik tüpe aktarmak için steril geniş ağızlı bir transfer pipeti kullanın.

Aynı transfer pipetinin ucunu tüpün tabanına yakın bir yere yerleştirin ve karışımı 10 ila 15 kez nazikçe pipetle karıştırın. Ardından, disosiye edilmiş hücre karışımına iki mililitre ısıtılmış DMEM 5/5 ekleyin ve santrifüj tüpünün kapağını kapatın. Ters çevirerek nazikçe karıştırın ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca 573 ×g'de santrifüjleyin.

Biyogüvenlik kabininde, peleti bozmadan tüm süpernatantı uzaklaştırın. Ardından, hücreleri yeniden süspansiyon haline getirmek için tüpteki pelete bir mililitre ısıtılmış DMEM 5/5 ekleyin. Karışım homojen hale gelene kadar nazikçe aşağı yukarı pipetleme yaparak peleti dağıtmak için steril, dar uçlu bir transfer pipeti kullanın.

Ardından, hücre süspansiyonundan 10 µL'yi bir mikro santrifüj tüpüne aktarın. Biyogüvenlik kabininin dışında, mikro santrifüj tüpündeki 10 µL hücre süspansiyonuna 10 µL trypan blue ekleyin. Sonrasında, hücreleri saymak için tek kullanımlık bir hemositometre çipine 10 µL trypan blue hücre süspansiyonu yükleyin.

Biyogüvenlik kabininde, steril bir mikropipet kullanarak her bir dizinin merkezine ve her bir kontrol Petri kabına 50 µL hücre süspansiyonu aktarın. Ardından, kapakları kapalı olan Petri kaplarını 37 °C'ye ayarlanmış bir inkübatörde üç ila dört saat bekletin. Sonrasında, her bir MEA'ya nazikçe 1 mL ısıtılmış DMEM 5/5 ekleyin.

Besiyerini, MEA'nın iç kenarları boyunca her seferinde bir damla şeklinde dikkatlice ekleyin ve hücrelerin dizinin merkezinden yıkanıp gitmesini önleyin. Ardından, her MEA'nın üzerine gaz geçirgen bir FEP membran içeren bir kapak yerleştirin ve bunları inkübatöre geri koyun. İki gün sonra, kaptaki besiyerini çekerek ısınmış DMEM+ ile tam bir besiyeri değişimi gerçekleştirin.

Pipet ucunu dikkatle iç duvarın üzerine yerleştirin ve bir mililitre ısıtılmış DMEM+ boşaltın. Sonraki beslemeler için, kaptan 500 mikrolitre ortam çekin ve tekrar 500 mikrolitre ısıtılmış DMEM+ ekleyin. Bu prosedürde, dizinin üzerindeki hücre örtüsünü ve bakteri veya mantar kaynaklı kontaminasyonu kontrol etmek için kap örneklerini gün aşırı mikroskop altında inceleyin. Kültürleri inkübatörden çıkarmadan önce sıcaklık kontrol cihazını fişe takın ve sistemini çalıştırarak ön yükselticinin ısıtmalı taban plakasının 35 degrees Celsius sıcaklığa ulaşmasını sağlayın.

Ardından, MEA kuyusundaki siyah çizgi referans toprağıyla hizalanacak şekilde kapaklı kültürü ön yükselticiye yerleştirin. Ön yükseltici pinlerinin, ön yükselticinin üst kısmının sabitlendiğinden ve kültür kapağının hala takılı olduğundan emin olacak şekilde hizalandığını kontrol edin. Son olarak, sinyalleri görselleştirmeye başlamak için yazılım ortamında başlat'a basın.

Ana pencerede Spikes, Detection, Automatic seçeneklerini belirleyin, standart sapma değerini eksi beş olarak değiştirin ve eşiği sıfırlamak için Refresh düğmesine tıklayın. Sinyalleri görselleştirdikten sonra, aktivite kaydına başlamak için Stop, Record ve Play düğmelerine tıklayın. Embriyonik fare nöronları, her bir elektrottan ağ genelindeki nöronal aktivitenin eş zamanlı olarak kaydedilmesine olanak tanıyan 60 kanallı MEA'lara ekilmiştir.

Burada, eğitim öncesi ve sonrası stimülasyona yanıt olarak sekiz elektrottan alınan aktivitenin temsili bir raster grafiği yer almaktadır. Dikey kırmızı çizgi stimulus zamanını, siyah işaretler ise aksiyon potansiyellerini belirtmektedir. Eğitim öncesinde, kanallar genelinde stimulus pulsuna karşı anlık bir yanıt görülmektedir.

Eğitim sonrası dönemde ağ, stimülasyona verilen anlık yanıtın yanı sıra daha uzun süreli bir aktivite yanıtı sergilemektedir. Burada, 12 eğitimli ve 10 kontrol ağının ortalaması gösterilmiştir; eğitimli ağlar belirgin şekilde değişmiş spike frekansları göstermektedir. Bu videoyu izledikten sonra, embriyonik farelerden nöronal dokunun nasıl izole edileceğini ve ilişkilendirileceğini iyi bir şekilde anlamış olmalı ve mikroelektrot dizilerinden nöronal ağları kültürleme, kaydetme ve stimüle edebilme becerisi kazanmalısınız.