Mikro Elektrod Dizilerinde Nöronal Hücre Kültürlerinin Uyarılmasına Ağ Yanıtına Zamana Bağlı Artış

Bu prosedürün genel amacı, mikroelektrot dizileri üzerindeki nöronal ağları kültürlemek, kaydetmek ve uyarmak için E17 fare nöronal dokusunu izole etmek ve ilişkilendirmektir. Bu yöntem, öğrenme ve hafızanın temel mekanizmalarıyla ilgili oldukları için ağ dinamikleri çalışmasındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, mikro elektrot dizilerinin aynı anda birden fazla bölgeden kayıt yapabilmesi ve bu nedenle tek site kaydındaki daha geleneksel cam pipete kıyasla daha iyi uzamsal, zamansal çözünürlük verebilmesidir.

Bu yöntem, öğrenme ve hafızanın ağ dinamikleri hakkında fikir verebilse de, ilaç toksisitesini araştırmak veya yeni nesil, kişiselleştirilmiş tıp için paradigmalar tasarlamak için de kullanılabilir. Bu sürecin görsel olarak gösterilmesi kritiktir, çünkü diseksiyon ve ayrışma işlemi sırasında dokunun manipülasyonu, sadece protokolleri okuyarak öğrenmek zordur. Diziyi hazırlamak için, steril pipet uçları kullanarak her MEA'nın merkezine 40 ila 50 mikrolitre çözülmüş laminin ve kontrol plakalarına 0,2 mililitre laminin ekleyin.

Biyodavuttaki tüm MEA'ları ve kontrol kaplarını örtün ve bir saat boyunca 37 santigrat derecede bir inkübatöre aktarın. Bir saat sonra, steril Pasteur pipetleri ile emme kullanarak MEA'ların merkezindeki fazla laminini dikkatlice çıkarın ve kaplamadan önce yüzeyin kurumasını bekleyin. Daha sonra, L-15 ortamını dört adet 100 milimetrelik Petri kabına dökün, üzerini örtün ve ortam sulu bir kıvam elde edene kadar yaklaşık 40 ila 60 dakika boyunca eksi 20 derecelik bir dondurucuya koyun, ancak donmuş katı hale gelmedi.

Diseksiyona hazırlanmak için, buz dolu bir tepsiye yüzü aşağı bakacak şekilde bir cam Petri kabı yerleştirin. Şimdi hayvanların alt karınlarına% 70 etanol püskürtün. Küçük cerrahi makas kullanarak, alt karın bölgesinin derisinden ve deri altı yağından V şeklinde bir kesi yapın, kesiği göğüs boşluğunun uzak uçlarına kadar uzatın ve uterusu açığa çıkarın.

Forseps kullanarak, embriyolar arasındaki uterusu dikkatlice kaldırın. Tüm rahim serbest kalana kadar bağ dokusunu diseksiyon makasıyla kesin. Daha sonra kanı çıkarmak için uterusu% 70 etanol ile kısa bir süre durulayın ve soğuk L-15 ile doldurulmuş dört Petri kabından birine yerleştirin.

Daha sonra, iki çift ince uçlu forseps kullanarak her embriyoyu uterustan ve iç embriyonik keseden serbest bırakın. Serbest kalan embriyoları soğuk L-15 ile dolu ikinci tabağa yerleştirin, ardından kafaları üçüncü Petri kabına ve gövdeleri dördüncüye aktarın. Biyokaputta, soğutulmuş cam Petri kabı aşamasına bir kama otoklavlanmış filtre kağıdı yerleştirin ve bir embriyo kafasını filtre kağıdına yerleştirin.

Daha sonra, iris makasının alt makasının kesici kenarını kafatasının tabanına yerleştirin, alt makası kafatasının iç yüzeyine ve beyinden uzak tutun, oksipital plakayı kesin ve ardından parietal plakalar arasındaki orta hat boyunca kesin. Kıkırdaklı frontal kafatası plakaları arasında rostral olarak kesmeye devam edin. Ardından, oksipital plakanın merkezinden başlayarak, merkez kesimin soluna ve sağına dik bir kesim yapın.

Bundan sonra, beynin ventral yüzeyi ile alt kafatası plakaları arasında küçük bir spatulayı tamamen beynin altına gelene kadar dikkatlice kaydırın. Ardından beyni çıkarmak için spatulayı yukarı kaldırın. Temiz bir spatula kullanarak, önce koku ampulünü çıkarın, ardından ön lobu yamuk şeklinde inceleyin.

Daha sonra, dokuyu depolama ortamı içeren 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Bu prosedürde, dokuyu kıymak için iki steril neşter bıçağı kullanın. Daha sonra Petri kabındaki kıyma dokusuna 2,5 mililitre Dnase papain karışımı ekleyin.

Tüm dokunun solüsyonda serbest olduğundan ve tabağın dibine yapışmadığından emin olmak için Petri kabını hafifçe döndürün. Daha sonra, çanağı 15 dakika boyunca 37 santigrat derecede bir inkübatöre koyun. Biyodavlumbazda, tüm ortamı ve dokuyu beş mililitrelik steril kriyojenik tüpe aktarmak için steril geniş delikli bir transfer pipeti kullanın.

Aynı transfer pipetinin ucunu tüpün dibine yakın bir yere yerleştirin ve karışımı 10 ila 15 kez hafifçe kesinleştirin. Daha sonra ayrışmış hücre karışımına iki mililitre ısıtılmış DMEM 5/5 ekleyin ve santrifüj tüpünü kapatın. Yavaşça ters çevirerek karıştırın ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca 573 kez g'de santrifüjleyin.

Biyokaputta, paleti kırmadan tüm süpernatanı atın. Daha sonra, hücreleri yeniden süspanse etmek için tüpteki palete bir mililitre ısıtılmış DMEM 5/5 ekleyin. Karışım homojen olana kadar hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek paleti parçalamak için steril küçük delikli bir transfer pipeti kullanın.

Daha sonra 10 mikrolitre hücre süspansiyonunu bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Biyodavutun dışında, mikrosantrifüj tüpündeki 10 mikrolitre hücre süspansiyonuna 10 mikrolitre tripan mavisi ekleyin. Daha sonra, hücreleri saymak için 10 mikrolitre tripan mavisi hücre süspansiyonunu bir atık hemositometre çipine yükleyin.

Biyodavlumbazda, 50 mikrolitre hücre süspansiyonunu her dizinin merkezine ve her kontrol Petri kabına aktarmak için steril bir mikropipet kullanın. Daha sonra kapalı Petri kaplarını üç ila dört saat boyunca 37 santigrat dereceye ayarlanmış bir inkübatöre yerleştirin. Ardından, her MEA'ya yavaşça bir mililitre ısıtılmış DMEM 5/5 ekleyin.

Ortamı, MEA'nın iç kenarlarına her seferinde bir damla dikkatlice ekleyin ve hücreleri dizi merkezinden uzaklaştırmaktan kaçının. Daha sonra, inkübatöre geri göndermeden önce her bir MEA'ya gaz geçirgen bir FEP membranı içeren bir kapak yerleştirin. İki gün sonra, ortamı tabaktan çekerek ısıtılmış DMEM+ ile tam bir orta değiştirme işlemi gerçekleştirin.

Pipetin ucunu dikkatlice iç duvara yerleştirin ve bir mililitre ısıtılmış DMEM+ dağıtın Sonraki beslemeler için, tabaktan 500 mikrolitre ortam çekin ve tekrar 500 mikrolitre ısıtılmış DMEM+ dağıtın. Bu prosedürde, dizi üzerinde hücre kaplaması ve bakteri veya mantarların neden olduğu kontaminasyonu aramak için bulaşık örneklerini her gün mikroskop altında inceleyin. Kültürleri inkübatörden çıkarmadan önce, sıcaklık kontrol cihazını prize takın ve sistemi açın, böylece ön amplifikatörün ısıtılmış taban plakasının 35 santigrat dereceye ulaşmasını sağlayın.

Ardından, kapaklı kültürü ön panele yerleştirinampeleman, böylece MEA'daki siyah çizgi referans toprakla iyi bir şekilde hizalanır. Önamplifier pimlerinin, ön kısmın üst kısmı sabitlenecek şekilde hizalandığından emin olun.ampyükseltici ve kültür kapağı hala açık. Ardından, sinyalleri görselleştirmeye başlamak için yazılım ortamında başlat düğmesine basın.

Ana pencerede Ani Artışlar, Algılama, Otomatik'i seçin, standart sapma değerini eksi beş olarak değiştirin ve eşiği sıfırlamak için Yenile'ye tıklayın. Sinyalleri görselleştirdikten sonra, kayıt etkinliğine başlamak için Durdur, Kaydet ve Oynat'a tıklayın. Embriyonik fare nöronları, her bir elektrottan ağ boyunca nöronal aktivitenin aynı anda kaydedilmesine izin veren 60 kanallı MEA'lar üzerine kaplanmıştır.

Burada, antrenman öncesi ve sonrası stimülasyona yanıt olarak sekiz elektrottan temsili bir raster aktivite grafiği verilmiştir. Dikey kırmızı çizgi, uyaranın zamanını gösterir ve siyah onay işaretleri, aksiyon potansiyellerini gösterir. Ön eğitimde, kanallar arasında uyaran nabzına anında bir yanıt verilir.

Eğitim sonrası, ağ daha uzun süreli bir aktivite tepkisi ve stimülasyona anında yanıt verir. Burada gösterilen 12 eğitilmiş ve 10 kontrol ağının ortalamasıdır, eğitilmiş ağlar önemli ölçüde değişmiş başak frekanslarını gösterir. Bu videoyu izledikten sonra, embriyonik farelerden nöronal dokunun nasıl izole edileceğini ve ilişkilendirileceğini iyi anlamalı ve mikroelektrot dizilerinden nöronal ağları kültürleyebilmeli, kaydedebilmeli ve uyarabilmelisiniz.