Hücre Çevrimiyle Düzenlenen Gen İfadesini İki Tamamlayıcı Hücre Senkronizasyon Protokolü İle Çalışmak

Bu protokolün genel amacı, gen ekspresyonunun hücre döngüsüne özgü bir şekilde analizi için bir bağlam sağlamaktır. Bu yöntem, malign dönüşümün yanı sıra anti-kanser tedavisinin altında yatan hücre döngüsüne bağlı transkripsiyonel olaylarla ilgili kanser alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu protokolün temel avantajı, hem iki numaralı koşullarda hem de kemoterapiye maruz kaldıktan sonra hücre döngüsü fazına özgü gen ekspresyon modellerini doğru bir şekilde oluşturmasıdır.

U2OS hücreleri bu deney için kullanılır ve sonraki adımların çalışma saatleri içinde gerçekleştirilebilmesi için akşam saat yedi civarında 100 milimetrelik tabaklara tohumlanmalıdır. Bulaşıkları 37 santigrat derecede nemlendirilmiş bir atmosferde %5 CO2 ile 24 saat inkübe ederek hücrelerin yapışmasına izin verin.

Ertesi gün, hücrelerin %50 birleşim noktasında olduklarını doğrulamak için hücreleri inceleyin. Timidin bloğu için, her 100 milimetrelik kültür kabına 100 mikrolitre taze hazırlanmış 200 milimolar timidin stoğu ekleyin. Hücreleri 37 santigrat derecede Timidin ile 20 saat boyunca% 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir atmosferde inkübe edin.

Ertesi gün, öğleden sonra saat üç civarında, Timidin içeren büyüme ortamını çıkararak Timidin bloğundan hücreleri serbest bırakın. Önceden ısıtılmış 1X PBS ile hücreleri iki kez yıkayın.

Ve sonra her 100 milimetrelik tabağa 10 mililitre tam orta ekleyin. Hücreleri beş saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Mitotik hücre durması için, mililitre başına 50 nanogramlık bir nihai konsantrasyona nokodazol ekleyin.

Hücreleri nokodazol ile 10 ila 11 saatten daha uzun süre inkübe edin. Ertesi sabah, saat altı ile yedi arasında, yuvarlak görünümleriyle gösterilen G2-M'de gerçekten bloke olduklarını doğrulamak için hücreleri mikroskop altında kontrol edin.

Her bir plakayı sallayarak ve her 100 milimetrelik plakadan ayrılmış hücrelerle büyüme ortamı içeren nokodazol içeren nokodazol ile nazikçe pipetleyerek mitotik hücreleri ayırın. Tüm bulaşıklardaki mitotik hücreleri 50 milileter steril bir tüpte birleştirin. Dört santigrat derecede beş dakika boyunca 300 kez g santrifüjleyin.

Soğuk 1X PBS ekleyerek hücreleri iki kez yıkayın, ardından santrifüjleyin. PBS'yi ikinci yıkamadan çıkardıktan sonra, mitotik hücreleri tam kültür ortamında yeniden askıya alın. RNA ekstraksiyonu için iki mililitre ve sıfır saatlik zaman noktası için FACS analizi için iki mililitre tasarruf edin.

Altı oyuklu plakada sonraki zaman noktaları için kalan mitotik hücreleri yeniden plakalayın. Bu prosedüre başlamak için, altı oyuklu plakada oyuk başına 10 ila altıncı U2OS hücresine 0.25 kez tohum atın. Her altı kuyucuk plakasının kapağına, her kuyu için deney koşulunu yazın.

Örneğin, tedavi edilmemiş veya farklı konsantrasyonlarda ilaç ve zaman noktaları ile tedavi edilmiştir. Altı kuyucuklu plakayı gece boyunca inkübe ederek hücrelerin bağlanmasına izin verin. Ertesi sabah, hücrelerin %50 oranında birleştiğini doğrulamak için hücreleri inceleyin.

Kuyucuklardan tam ortamı çıkarın ve kuyucuk başına iki mililitre önceden ısıtılmış, FBS içermeyen DMEM-Glutamin ortamı ekleyin. Hücreleri 24 saat daha inkübe edin. Hücreleri hidroksiüre ile tutuklamak için, ortamı kuyulardan çıkarın ve tam ortam içeren taze hazırlanmış dört mikromolar hidroksiüre ile değiştirin.

Hücreleri hidroksiüre içeren ortamda 24 saat inkübe edin. Hücreleri hidroksiüre aracılı tutuklamadan serbest bırakmadan önce, tutuklandıklarını doğrulamak için hücreleri kontrol edin. Hidroksiüre içeren ortamı kuyulardan çıkarın ve önceden ısıtılmış 1X PBS ile kuyuları iki kez durulayın.

PBS'yi ikinci yıkamadan çıkardıktan sonra, oyuk başına iki mililitre tam ortam ekleyin. Numune toplanana kadar plakaları inkübatörde tutun. Her iki senkronizasyon protokolünden alınan numuneler, FACS analizi ve RNA ekstraksiyonu için aynı şekilde toplanır.

FACS analizi için, her bir kuyuyu iki mililitre önceden ısıtılmış 1X PBS ile durulayın ve ardından hücreleri ayırmak için 0.3 mililitre önceden ısıtılmış Tripsin-EDTA çözeltisi ekleyin. Beş dakika sonra, bir mililitre tam ortam ekleyerek Tripsin-EDTA'yı etkisiz hale getirin. Her numuneyi 15 mililitrelik ayrı bir tüpte toplayın.

Hücreleri oda sıcaklığında 300 kez G'de beş dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın, 1X PBS ile yıkayın ve tekrar döndürün. PBS'yi çıkarın ve hücresel peleti kaydedin.

Hücreleri sabitlemek için, her bir hücresel peleti bir mililitre soğutulmuş% 70 etanol içinde hafifçe girdaplayarak yeniden süspanse edin. Promidyum iyodür boyama ve FACS analizinden önce hücreleri yaklaşık 15 dakika buz üzerine yerleştirin. RNA ekstraksiyonu için ortamı çıkarın ve her birini iki mililitre önceden ısıtılmış 1X PBS ile durulayın.

Plakayı bir güvenlik kabinine alın ve oyuk başına bir mililitre uygun RNA izolasyon reaktifi ekleyin. Hücreleri pipetlemek ve parçalamak için yukarı ve aşağı pipetleyin ve ardından her hücre lizatını 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin.

RNA ekstraksiyon prosedürünü, RNA izolasyon reaktifinde numuneler içeren mikrosantrifüj tüplerini dondurucudan alarak ve bunları kimyasallar için bir güvenlik kabini içinde oda sıcaklığında çözerek başlatın. Her numuneye 400 mikrolitre kloroform ekleyin ve tamamen karışana kadar girdap oluşturmadan kuvvetlice çalkalayın. Numuneleri oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin.

Tüpleri tezgah üstü mikrosantrifüjde 15 dakika santrifüjleyin. Her numunenin sulu fazını yeni bir 1.5 militer mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Karıştırırken sulu faza yavaş yavaş, damla damla bir hacim %100 etanol ekleyin.

Santrifüj yapmayın. Ticari bir RNA mini hazırlama kiti tarafından sağlanan iki mililitrelik bir toplama tüpünde bir döndürme sütununa dönüşmüş olabilecek herhangi bir çökelti dahil olmak üzere her numuneden 700 mikrolitreye kadar aktarın ve kapağı kapatın. 15 saniye santrifüjleyin.

Akışı atın. Numune başına 700 mikrolitreden fazla başlıyorsanız, kalan numuneyi döndürme kolonuna aktarın ve tekrar santrifüjleyin. RNA'yı üreticinin talimatlarına göre yıkadıktan sonra, her bir numuneyi 30 ila 40 mikrolitre nükleaz içermeyen suyu spin kolonuna pipetleyerek ve oda sıcaklığında bir dakika santrifüjleyerek elüte edin.

Absorbans ölçümleri ile numunelerin RNA konsantrasyonunu ve saflığını belirleyin. RNA örneklerini gen ekspresyon analizi için kullanılana kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın. Timidin-Nokodazol protokolü ile tedavi, m fazı girişinde U2OS hücrelerini durdurur ve akış sitometrisi analizi ile gösterildiği gibi G1 boyunca senkronize olarak ilerleyen ve S fazına ilerleyen bir hücre popülasyonu sağlar.

Hidroksiüre protokolü ile tedavi, hücreleri G1 / S sınırında durdurur. Serbest bırakıldıktan sonra, hücreler S ve G2 fazları arasında eşzamanlı olarak geçiş yapar. Timidin-Nokodazol protokolü, G1 fazı sırasında pik ekspresyonu olan genlerin mRNA profillerini analiz etmek için en uygun olanıdır.

E2F1 ifadesi için gösterildiği gibi. Buna karşılık, Hidroksiüre protokolü, E2F7 ekspresyonu için gösterildiği gibi, S veya G2'de tercihli ekspresyonu olan genlerin analizi için daha iyi çalışır. Hücre döngüsü tipik olarak anti-tümör ilaçlar tarafından bozulur, gösterilen bir mitomisin C, hidroksiüre senkronize hücrelerde kalıcı G2 fazı durmasıdır.

Hücre senkronizasyonu, anti-tümör ajanına yanıt veren genleri, yalnızca ajan tarafından uygulanan hücre döngüsü bozulmalarından etkilenenlerden ayırt etmeye yardımcı olur, örneğin, mitomisin C tedavisinden sonra E2F1 mRNA seviyelerinde bir azalma, muhtemelen ilacın hücre döngüsü dinamikleri üzerindeki dolaylı bir etkisidir. Buna karşılık, mitomisin C tedavisinden sonra p21-Cip1 mRNA ekspresyonunun zirvesi, doğrudan bu ilaç tarafından tetiklenen bir transkripsiyonel programın sonucudur. Bu prosedürü takiben, belirli bir hücre döngüsü fazlarını etkileyen küresel gen ekspresyonu değişikliklerini çözmek için genom çapında transkriptomik ve proteomik analiz yapılabilir.

Ya iki numaralı koşullarda ya da anti-tümör tedavileri üzerine. Bu videoyu izledikten sonra, senkronize hücre kültürlerinde gen ekspresyon analizi yapmak için gerekli olan prosedürleri iyi bir şekilde anlamış olmalısınız. Promidyum iyodür veya RNA izolasyon reaktifleri ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken eldiven ve kimyasallar için güvenlik kabini gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.