Tomurcuklanan mayada hücre döngüsüne bağlı süreçlerin manipülasyonu ve analizi

Bölünen hücrelerin mitoz sırasında kromozomlarını nasıl sadakatle aktardığını inceleyerek, doğru kromozom ayrımını sağlayan moleküler makineler ve mekanizmalara odaklanıyoruz. Hücreleri, hücre döngüsüyle değişen moleküler süreçleri incelemek için senkronize ediyoruz. Bu yöntemler olmadan, anahtar değişiklikler senkronize edilmemiş bir hücre popülasyonunda gizlenirdi.

Diğer senkronizasyon yöntemlerine kıyasla, BAR1 mutantlarında alfa-faktör durdurma daha temiz, geri dönüşebilir bir G1 durdurma sağlar ve böylece bir maya kültürünün döngü boyunca eş zamanlı ilerlemesini izlememize olanak tanır. Çalışmalarımız, hücre döngüsü boyunca dinamik protein lokalizasyonu ve aktivite değişikliklerini ortaya koyarak kromozom ayrımı ve iğne bakımı gibi temel mitotik süreçlere ışık tuttu. Başlamak için, maya 25 mililitre YPAD ortamına aşı edin ve gece boyunca inkübe yapın; böylece 0,5 ile 2,0 arasında 600 nanometre optik yoğunluğa ulaşın.

Maya hücrelerini 600 nanometre 0.5 optik yoğunluğa kadar seyreltirin. Kültüre alfa-faktör ekleyerek mililitrede bir mikrogram nihai konsantrasyona ulaşılır. Alfa-faktör eklemesinden 2,5 ila 3,5 saat sonra, hücre durmasını değerlendirmek için mikroskop altında tomurcuklanmamış shmooed hücrelerin yüzdesini sayın.

Sonra, kültürü 3.000g sıcaklıkta 23 derece Celsius'ta üç ila beş dakika boyunca bir santrifüjde döndürün. Alfa-faktörü çıkarmak için süpernatantı dikkatlice dökün. Hücre pelletini, %1 dimetil sülfüsit içeren 25 mililitre YPAD ile yeniden askıya alın ve hücreleri yıkamak.

Hücre pelletini yeni bir tüpe aktarın ve yıkamaları iki kez daha tekrarlayın, böylece kalan alfa-faktörü ortadan kaldırmak için toplamda üç yıkama yapılır. Sonra, yıkanmış hücrelere YPAD ekleyin ve son hacmi 25 mililitre çıkarın ve süspansiyonu daha fazla kuluçka veya kullanım için yeni bir şişeye aktarın. Sıfır dakikalık zaman noktası örneğini hemen serbest bıraktıktan hemen sonra topla ve örneği sabitle.

Salınımdan 60 dakika sonra, hücre popülasyonunun senkronizasyonunu ışık mikroskobu altında değerlendirin. İstenerseniz, salınımdan 60 dakika sonra tekrar alfa-faktör ekleyin ve bir mikrogram/mililitre nihai konsantrasyona eklenerek bir sonraki hücre döngüsüne ilerlemeyi engelleyin. Zaman noktası örneklerini her 15 dakikada bir 180 dakikaya kadar veya gerektiği kadar toplamaya devam edin.

Maya hücrelerini sabitlemek için, maksimum hızda bir mililitre kültürü bir dakika boyunca santrifüj edin. Süpernatantı tamamen aspire edin. Daha sonra pelleti 500 mikrolitre fiksatif çözelti içinde tekrar askıya alın ve 23 derece Celsius'ta iki ila 15 dakika kuluçka yapın.

Sabit hücreler santrifüjlendikten sonra, süpernatantı aspire edin ve pelleti pH 6,4'te 500 mikrolitre 0.1-molar potasyum fosfat tamponu içinde yeniden süzülür. Görüntülemeden önce, sabit hücreleri maksimum hızda bir dakika boyunca 23 derece Celsius'ta santrifüjlendirin. Süpernatant aspirasyon yapıldıktan sonra, pelleti 10 ila 100 mikrolitre Triton, DAPI ve sorbitol çözeltisi içinde yeniden süzülür.

Boyalı hücre süspansiyonundan yaklaşık 0,8 mikrolitre pipetle doğrudan temiz bir kapak kaplayıcısının merkezine yerleştirilin. Pipet ucu kullanarak damlayı yaklaşık bir santimetrekarelik dairesel bir alana nazikçe yayın. Kapak kağıdını mikroskopik slayta yerleştirin.

Kimwipe kullanarak, örtü kenarlarını nazikçe bastırarak numuneyi eşit şekilde dağıtın. Sonra, numuneyi sabitlemek için örtü kenarlarını oje ile kapatın. Hazırlanan slaytı, 60 kat büyütme, 1.42 sayısal diyafram yağ daldırma objektif ve kırmızı, yeşil, mavi ve uzak kırmızı lazer ile filtre setiyle donatılmış mikroskopa götürün.

Mikroskobu kapak parçasına yapışan maya hücrelerine odaklayın. Odaklandıktan sonra, her floresan kanalı için pozlama ayarlarını ayarlayarak en az üçe bir sinyal-gürültü oranı elde edin. Alınım ayarlarını, her dilim 0,2 mikrometre aralıklı olarak 14 ila 20 z-yığını görüntüsü toplayacak şekilde ayarlayın; toplam z-derinliği iki ila dört mikrometre kadardır.

Sonraki işlem modülleriyle donatılmış mikroskoplarda, her z-yığını görüntüsü için Dekonvolütion ve Hızlı Projeksiyon seçeneklerini seçin. Örnekten z-yığınlarını alın, her deneysel durum veya zaman noktası için yaklaşık 100 ila 200 maya hücresi kaydedecek kadar görüntü alın. Analiz için, projeksiyon edilen görüntüleri ImageJ yazılımında açın.

Her floresan kanalının parlaklığını ve kontrastını ayarlayarak görünürlüğü artırın. Hücre döngüsü ilerlemesini analiz etmek için, her zaman noktası için 100 hücre sayın ve bunları bir veya iki çekirdek içerecek şekilde sınıflandırın. Stu2-GFP noktası gösteren hücrelerin yüzdesini hesaplamak için, tüm görüntülerde yeşil kanal parlaklık ayarlarını standartlaştırın.

Spc110-mCherry noktası ile birlikte lokalize olan Stu2-GFP noktalarını gösteren hücreleri sayın, kinetokor lokalizasyonu pozitif olarak görülür. Sonrasında, protein puncta'nın yoğunluğunu niceliklendirmek için, sinyalin etrafındaki ilgi alanını serbest el seçimi aracıyla çizebilirsiniz. T'ye basarak veya ROI Manager menüsünden seçeneğe seçim ederek bu seçimi İlgi Bölgesi Yöneticisi'ne ekleyin.

ROI Yöneticisi'nde, nokta yoğunluğunu hesaplamak için Ölçüt tuşuna tıklayın. Zaman içindeki değişiklikleri görselleştirmek için, her zaman noktası için ortalama yoğunluğu %95 güven aralıklarıyla çizin. Her koşul için yaklaşık 100 hücre sayın.

G1 tutuklanmış hücrelerde, Stu2-GFP tek bir iğne kutuplu proksimal noktama lokalize olur ve sitoplazmik mikrotübullar boyunca ek dağılmış sinyal içerir. Serbest bırakıldıktan 60 dakika sonra, Stu2-GFP, Spc110-mCherry ile işaretlenmiş çift spindle direklerine bitişik iki nokta olarak lokalize olmuştur. 90 dakika sonra, anafaz sırasında, Stu2-GFP hem mil kutuplarının yakınında hem de tek eksen boyunca mikrotubullar boyunca belirdi.

Mitotik çıkışın ardından, 120 dakikada, Stu2-GFP sitoplazmadaki astral mikrotübullarda yeniden ortaya çıktı. Nicel belirleme, erken mitoz sırasında spindle kutuplarına yakın Stu2-GFP yoğunluğunun arttığını, anafaz öncesinde zirve noktasına ulaştığını ve sonrasında azaldığını ortaya koydu. İkili hücrelerin yüzdesi yaklaşık 90 dakikada zirveye ulaştı, bu da anafaza senkronize girişi gösteriyordu.