Name: Mitotik hücre eşitleme ve yüksek çözünürlüklü Confocal mikroskobu mitoz sırasında çok fonksiyonlu hücre döngüsü proteinlerin rolü çalışmaya birleştirme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Öğrenin, HeLa hücrelerinde çift timidin senkronizasyonu ve yüksek çözünürlüklü konfokal mikroskopi kullanarak mitoz sırasında çok fonksiyonlu proteinlerin rollerini nasıl inceleyeceğinizi. Bu yöntem, hücre döngüsü dinamiklerini ve protein fonksiyonlarını detaylı şekilde analiz etmenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Stabil mCherry-Histon H2B ve GFP-α-tübülin ifade HeLa hücreleri paylaşımı için Tohoku Üniversitesi, Japonya'nın Dr Kozo Tanaka için minnettarız. Bu eser DV (R00CA178188) için bir ncı hibe ve Northwestern Üniversitesi'nden başlamak-yukarıya fon tarafından desteklenmiştir.

1. çift timidin blok ve yayın: reaktif hazırlıkları
<ol><li>500 mL Dulbecco'nın kartal orta (DMEM) orta %10 FBS, penisilin ve streptomisin ile desteklenmiş değişiklik yapmak.</li>
	<li>Steril su ve aliquots-80 ° C'de deposunda timidin stokunun 100 mM olun</li>
</ol>2. sabit hücre görüntüleme Mitotik ilerleme (şekil 1A) için iletişim kuralı
<ol><li>Günde 1, tohum ~ 2 x 105 HeLa hücreleri ile bir kapak (% 70 etanol ve UV radyasyon vermeliyiz ile sterilize) kayma ve DMEM orta 2 mL 6-şey plaka kuyu içine. 37 ° C ve % 5 CO224 h için oksijen bir kuluçka hücrelerin büyümesine.</li>
	<li>1st timidin blok: 2 günde timidin taze DMEM medya (100 mM hisse senedi, 2 mM son konsantrasyonu) gerekli hacmi iyice karıştırın.</li>
	<li>Timidin içeren 2 mL ekleyin her şey 6-iyi hücrelerde medya plaka ve 18 h için kuluçkaya.</li>
	<li>Gün 3, orta Aspire edin ve hücreleri 2 mL 1 x PBS ile iki kez ve bir kez taze prewarmed DMEM ile yıkayın; hücre Block serbest bırakmak 9 h için taze prewarmed DMEM ortamda hücrelerin büyümesine.</li>
	<li>2nd timidin bloğu: tekrar timidin içeren 2 mL ekleyin medya (2 mM son konsantrasyonu) her şey 6-şey plaka hücrelerde.</li>
	<li>Başka bir 18 h için kuluçkaya.</li>
	<li>Günde 4, orta Aspire edin ve hücreleri 2 mL 1 x PBS ile iki kez ve bir kez taze prewarmed DMEM ile yıkayın.</li>
	<li>Seyreltik çift (Denetim ve Cdt1) ve transfection reaktif serum ücretsiz büyüme orta 10 dk. için ayrı ayrı bunları karıştırın ve RT., 20 dk için kuluçkaya Her transfection içinde kullanılan siRNA son konsantrasyonu 100 oldu nM. Timidin dışarı yıkanmış hücrelere tepki karışımı ekleyin.</li>
	<li>9-10 h bloke edilen serbest bırakmak ve hücreleri üzerinde kapak makbuzları ile % 4 saptamak için 37 ° C'de hücreler kuluçkaya PFA RT., 20 dk Dikkat: PFA toksik, uygun koruma giymek.</li>
	<li>
Immunostain hücreleri, RT, 10 min için % 0,5 (v/v) deterjan ile permeabilizing ve 5 min için 1 x PBS iki kez hücrelerle yıkama sonra.
	<ol>
<li>1 x PBS için 1 h %1 (w/v) birincil antikor (1:1, 000, tavşan anti-Zwint1 antikor 1: 400 ve fare anti-fosfo-ɣ H2AX 1:300 seyreltilmiş seyreltilmiş seyreltilmiş fare anti-α-tübülin antikor) 50 µL hücrelerle tedavi tarafından takip RT olarak % 1 BSA (w/v) içeren hücreleri engellemek 1 x PBS 37 oC. 1 h için BSA</li>
		<li>1 x PBS hücrelerle dışarı üç kez yıkadıktan sonra RT, 1 h için her kapak cam (Alexa 488 ve rodamine kırmızı 1:250 dilutions %1 (w/v) BSA 1 x PBS,) için ikincil antikorların 50 µL hücrelerle tedavi</li>
		<li>1 x PBS iki kez 5 min için hücrelerle yıkadıktan sonra DAPI hücrelerle tedavi (0.1µg / mL 1 x PBS) RT., 5 min için</li>
		<li>1 x PBS iki kez 5 min için hücrelerle yıkadıktan sonra kapak notu hücrelere uygun montaj medya net mikroskobik bir slayt üzerinde karşı karşıya koyun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hücreler immunostained proteinler ile 60 X veya 100 X 1.4 NA planı Apochromatic DIC yağı daldırma amaç için gerekli görüntülerin kalitesi için gerektiği şekilde uygun bir kamera ile donatılmış bir ters yüksek çözünürlüklü confocal mikroskobu monte görüntü.</li>
	<li>Z-0.2 µm kalınlık yazılımını kullanarak yığını için mikroskop gerektiği oda sıcaklığında görüntüleri elde etmek.</li>
</ol>3. canlı hücre görüntüleme Mitotik ilerleme (şekil 3A) için iletişim kuralı
<ol><li>Gün 1, yaklaşık 0,5-1 x 105 HeLa hücreleri stabil mCherry-H2B GFP-α-tübülin (biraz hücre tipi ve onlar hızlı proteinler göre değişken) içine 35 mm cam alt yemekler 1.5 mL DMEM orta ile ifade etmek tohum ve onları bir oksijen büyümek kuluçka makinesi 24 h 37 oC ve %5 CO2.</li>
	<li>1st timidin blok: 2 günde 1,5 mL timidin içeren ekleyin (100 mM timidin, 2 mM son konsantrasyonu,) çanak hücrelerde medya.</li>
	<li>18 h için kuluçkaya.</li>
	<li>Gün 3, timidin içeren orta Aspire edin ve hücreleri üç kez, 2 mL 1 x PBS ile iki kez ve bir kez taze prewarmed DMEM ile yıkayın.</li>
	<li>Seyreltik çift (Denetim ve Hec1) ve transfection reaktif serum ücretsiz büyüme orta 10 dk. için ayrı ayrı ile onları karıştırın ve RT., 20 dk için kuluçkaya Her transfection içinde kullanılan siRNA son konsantrasyonu 100 oldu nM. Timidin dışarı yıkanmış hücrelere tepki karışımı ekleyin.</li>
	<li>Taze prewarmed DMEM Orta hücre Block serbest bırakmak 8 h için 1,5 mL hücrelerinde büyür.</li>
	<li>2nd timidin bloğu: 1,5 mL timidin içeren ekleyin medya (2 mM son konsantrasyonu) çanak hücrelerde.</li>
	<li>Başka bir 18 h için kuluçkaya.</li>
	<li>Günde 4, orta Aspire edin ve hücreleri üç kez, 2 mL 1 x PBS ile iki kez ve bir kez taze prewarmed DMEM ile yıkayın. Hücrelerin büyümesine taze prewarmed iyi (L-15) orta %10 FBS ve 20 mM ile HEPES pH 7,0 hücre Block serbest bırakmak 8 h için takıma'nın.</li>
	<li>Zaten en az 30 dakika sahnede ve deneysel sıcaklıklar dengelemek için görüntüleme başlamadan önce açık yüksek çözünürlüklü confocal mikroskop set sıcaklık kontrol odasında çanak yerleştirin.</li>
	<li>Sonra hücreleri görünür hale gelene kadar parlak alanı ile 60 x objektif odak el ile sahne alanı üzerinde seçim bölgesine elemek.</li>
	<li>Işık ve lazer güç/pozlama, görüntü edinme parametreleri ve mikroskop görüntü alma yazılım kullanarak deneme süresi ayarlayın. Filtreleri GFP (488 uyarma; 385 nm emisyon) ve mCherry (561 nm uyarma ve 385 nm emisyon) görüntüleri elde etmek için kullanın.</li>
	<li>Ayrı ayrı pulsed iletilen ışık ve floresan görüntüleri her 10 min 16 s kadar bir süre için elde etme tarafından hızlandırılmış deneme gerçekleştirin.</li>
	<li>On iki 1.0 µm ayrılmış z-uçak yazılım kullanarak Çift Kişilik timidin blok sürümden sonra 9 h için mikroskop gerektiği görüntüleri elde etmek.</li>
	<li>Tek tek hücreler için Mitotik ilerleme izleme görüntüleri analiz ve nihayet bir araya kaynak yazılım Fiji/ImageJ ile ilgili film.</li>
</ol>

<ol><li>Lajtha, L. G., Oliver, R., Berry, R., Noyes, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+radiation+effect+on+the+process+of+synthesis+of+deoxyribonucleic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanism of radiation effect on the process of synthesis of deoxyribonucleic acid.</a> Nature. 182 (4652), 1788-1790 (1958).</li>
<li>Puck, T. T., Steffen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+Cycle+Analysis+of+Mammalian+Cells.+I.+A+Method+for+Localizing+Metabolic+Events+within+the+Life+Cycle%2C+and+Its+Application+to+the+Action+of+Colcemide+and+Sublethal+Doses+of+X-Irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Life Cycle Analysis of Mammalian Cells. I. A Method for Localizing Metabolic Events within the Life Cycle, and Its Application to the Action of Colcemide and Sublethal Doses of X-Irradiation.</a> Biophys. J. 3, 379-392 (1963).</li>
<li>Santaguida, S., Musacchio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+life+and+miracles+of+kinetochores%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">The life and miracles of kinetochores.</a> EMBO J. 28 (17), 2511-2531 (2009).</li>
<li>Musacchio, A., Desai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Molecular+View+of+Kinetochore+Assembly+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">A Molecular View of Kinetochore Assembly and Function.</a> Biology (Basel). 6 (1), E5(2017).</li>
<li>Chaudhry, M. A., Chodosh, L. A., McKenna, W. G., Muschel, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+of+HeLa+cells+in+G1+or+G2+phases%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling of HeLa cells in G1 or G2 phases.</a> Oncogene. 21 (12), 1934-1942 (2002).</li>
<li>Zhou, J. Y., Ma, W. L., Liang, S., Zeng, Y., Shi, R., Yu, H. L., Xiao, W. W., Zheng, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+microRNA+expression+profiles+during+the+cell+cycle+in+synchronized+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMB+Rep%22%5BJournal%5D)">Analysis of microRNA expression profiles during the cell cycle in synchronized HeLa cells.</a> BMB Rep. 42 (9), 593-598 (2009).</li>
<li>Stumpf, C. R., Moreno, M. V., Olshen, A. B., Taylor, B. S., Ruggero, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+translational+landscape+of+the+mammalian+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">The translational landscape of the mammalian cell cycle.</a> Mol. Cell. 52 (4), 574-582 (2013).</li>
<li>Chen, X., Simon, E. S., Xiang, Y., Kachman, M., Andrews, P. C., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+proteomics+analysis+of+cell+cycle-regulated+Golgi+disassembly+and+reassembly%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Quantitative proteomics analysis of cell cycle-regulated Golgi disassembly and reassembly.</a> J. Biol. Chem. 285 (10), 7197-7207 (2010).</li>
<li>Rosner, M., Schipany, K., Hengstschläger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Merging+high-quality+biochemical+fractionation+with+a+refined+flow+cytometry+approach+to+monitor+nucleocytoplasmic+protein+expression+throughout+the+unperturbed+mammalian+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Merging high-quality biochemical fractionation with a refined flow cytometry approach to monitor nucleocytoplasmic protein expression throughout the unperturbed mammalian cell cycle.</a> Nature Protocols. 8 (3), 602-626 (2013).</li>
<li>Coquelle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+non-synchronized+cells+in+the+G1%2C+S+and+G2+phases+of+the+cell+cycle+for+the+study+of+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Enrichment of non-synchronized cells in the G1, S and G2 phases of the cell cycle for the study of apoptosis.</a> Biochem. Pharmacol. 72 (11), 1396-1404 (2006).</li>
<li>Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronization+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Synchronization procedures.</a> Methods Enzymol. 351, 457-467 (2002).</li>
<li>Cooper, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rethinking+synchronization+of+mammalian+cells+for+cell+cycle+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Rethinking synchronization of mammalian cells for cell cycle analysis.</a> Cell Mol. Life Sci. 60 (6), 1099-1106 (2003).</li>
<li>Whitfield, M. L., Sherlock, G., Saldanha, A. J., Murray, J. I., Ball, C. A., Alexander, K. E., Matese, J. C., Perou, C. M., Hurt, M. M., Brown, P. O., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+genes+periodically+expressed+in+the+human+cell+cycle+and+their+expression+in+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of genes periodically expressed in the human cell cycle and their expression in tumors.</a> Mol. Biol. Cell. 13 (6), 1977-2000 (2002).</li>
<li>Vassilev, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+small-molecule+inhibitor+reveals+critical+mitotic+functions+of+human+CDK1%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Selective small-molecule inhibitor reveals critical mitotic functions of human CDK1.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (28), 10660-10665 (2006).</li>
<li>Varma, D., Chandrasekaran, S., Sundin, L. J., Reidy, K. T., Wan, X., Chasse, D. A., Nevis, K. R., DeLuca, J. G., Salmon, E. D., Cook, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+of+the+human+Cdt1+replication+licensing+protein+by+the+loop+domain+of+Hec1+is+required+for+stable+kinetochore-microtubule+attachment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Recruitment of the human Cdt1 replication licensing protein by the loop domain of Hec1 is required for stable kinetochore-microtubule attachment.</a> Nat. Cell Biol. 14 (6), 593-603 (2012).</li>
<li>Garcia, M., Westley, B., Rochefort, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Bromodeoxyuridine+specifically+inhibits+the+synthesis+of+estrogen-induced+proteins+in+MCF7+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Biochem%22%5BJournal%5D)">5-Bromodeoxyuridine specifically inhibits the synthesis of estrogen-induced proteins in MCF7 cells.</a> Eur. J. Biochem. 116 (2), 297-301 (1981).</li>
<li>Bostock, C. J., Prescott, D. M., Kirkpatrick, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evaluation+of+the+double+thymidine+block+for+synchronizing+mammalian+cells+at+the+G1-S+border%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">An evaluation of the double thymidine block for synchronizing mammalian cells at the G1-S border.</a> Exp. Cell Res. 68 (1), 163-168 (1971).</li>
<li>Martin-Lluesma, S., Stucke, V. M., Nigg, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Hec1+in+spindle+checkpoint+signaling+and+kinetochore+recruitment+of+Mad1%2FMad2%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Role of Hec1 in spindle checkpoint signaling and kinetochore recruitment of Mad1/Mad2.</a> Science. 297, 2267-2270 (2002).</li>
<li>Brouwers, N., Mallol Martinez, N., Vernos, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Kif15+and+its+novel+mitotic+partner+KBP+in+K-fiber+dynamics+and+chromosome+alignment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Role of Kif15 and its novel mitotic partner KBP in K-fiber dynamics and chromosome alignment.</a> PLoS One. 12 (4), e0174819(2017).</li>
<li>Dou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+localization+of+Mps1+kinase+to+kinetochores+is+essential+for+accurate+spindle+microtubule+attachment%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Dynamic localization of Mps1 kinase to kinetochores is essential for accurate spindle microtubule attachment.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 112 (33), E4546-E4555 (2015).</li>
<li>Chan, Y. W., Jeyaprakash, A. A., Nigg, E. A., Santamaria, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aurora+B+controls+kinetochore-microtubule+attachments+by+inhibiting+Ska+complex-KMN+network+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Aurora B controls kinetochore-microtubule attachments by inhibiting Ska complex-KMN network interaction.</a> J Cell Biol. 196 (5), 563-571 (2012).</li>
</ol>

Yazarlar onlar rakip mali niyetimiz yok bildirin.

Bu hücreler mitoz böylece aynı zamanda kromozom hizalama, bipolar analizlerini etkinleştirme uyum içinde girerek birçoğunu içeren bir kısa sürede pencerede Mitotik hücre bir artan örnek boyutu sağlar Çift Kişilik timidin eşitleme en önemli avantajı olduğunu oluşumu ve kromozom ayrımı çok daha yüksek verimlilik ile iğ.
Birçok düzenleyici protein kompleksleri ve sinyal yollar mitoz yoluyla normal ilerleme sağlamaya adadık ve deregülasyon bu sürecin tumorigenesis için neden. Stabil mCherry-H2B ve...

Hücre döngüsünde hücreleri son derece düzenli ve geçici kontrollü olayları kendi genom ve nükleer silahların yayılmasına karşı doğru çoğaltılması için bir dizi tabi. Memelilerde, hücre döngüsü interfaz ve M-faz oluşur. Interphase içinde ki üç aşamaları - G1, S, oluşur ve G2, hücre genomunu çoğaltır ve normal hücre döngüsü ilerleme1,2için gerekli olan büyüme uğrar. M-mitoz (profaz, prometafaz, metafaz, anafaz ve telofaz) ve sitokinez oluşan aşamasında, bir ebeveyn hücre iki genetik olarak aynı kızı hücreleri üretir. Mitoz, chromatids yinelenen genom kopyası sıkıştırılmış (profaz) vardır ve onların kinetochores monte Mitotik spindle (prometafaz), mikrotübüller tarafından yakalanır kız kardeşi bu sürücüler onların hizalama metafaz ardından plaka (metafaz) onların Ne zaman chromatids doğru bölmek ve ters dönüş için yer değiştiren kız kardeşi (anafaz) Polonyalılar segregasyon eşit. İki kızı hücreleri fiziksel olarak bir aktin esaslı contractile yüzüğü (telofaz ve sitokinez) faaliyet tarafından ayrılır. Kinetochore ve chromatids centromeric bölge çeviren özel bir proteinaceous yapı iğ mikrotübüller için ek siteler olarak hizmet. Temel işlevi kromozom yakalama, hizalama, sürücü ve uygunsuz iğ Mikrotubul eki, Milli Meclis denetim noktası kromozom segregasyon3,4kalitesini korumak için arabuluculuk yaparken düzeltme yardım etmektir.
Hücre eşitleme tekniği moleküler ve yapısal olaylar hücre döngüsü ilerlemesinde dahil anlamak için ideal bir araç olarak hizmet vermektedir. Bu yaklaşım belirli aşamaları için çeşitli analizler, gen ifadesi, profil oluşturma dahil olmak üzere hücresel biyokimyasal süreçlerin analizleri ve proteinlerin hücre altı yerelleştirme tespiti, hücre popülasyonlarının zenginleştirmek için kullanılmıştır. Eşitlenmiş memeli hücreleri-ebilmek var olmak kullanılmış sadece bireysel gen ürünlerinin incelenmesi için aynı zamanda Analizi Mikroarray analiz gen ifade5, miRNA ifade desenleri6dahil olmak üzere bütün genleri içeren yaklaşımlar için translasyonel yönetmelik7ve protein değişiklikler8proteomik analizi. Eşitleme gen ekspresyonu veya protein knock-down veya knock-out veya kimyasal maddelerin etkileri, hücre döngüsü gelişimi çalışma için kullanılabilir.
Hücreleri hücre döngüsünün farklı aşamalarında eşitlenebilir. Hem fiziksel hem de kimyasal yöntemler hücre senkronizasyonu için yaygın olarak kullanılır. Hücre eşitlemesi için en önemli kriterleri eşitleme noncytotoxic ve geri dönüşümlü olması gerekir vardır. Hücreleri farmakolojik ajanlar tarafından eşitleme potansiyel olumsuz hücresel sonuçları nedeniyle, kimyasal bağımlı yöntemleri anahtar hücre döngüsü olaylar eğitim için avantajlı olabilir. Örneğin, hidroksiüreye, amphidicolin, mimosine ve lovastatin, G1/S faz hücre eşitleme için kullanılabilir ancak, onlar inhibe biyokimyasal yolları üzerindeki etkileri nedeniyle onlar hücre döngüsü kontrol noktası mekanizmaları etkinleştirmek ve önemli bir öldürmek kesir hücreleri9,10. Öte yandan, DNA ikileşmesi "timidin taşı" olarak bilinen büyüme basına timidin ekleyerek geribildirim inhibisyonu hücre döngüsünün belirli Puan11,12,13tutuklayabilirsin. Hücreleri de G2/M aşamasında nocodazole ve RO-33069,14ile tedavisi ile senkronize edilebilir. Nocodazole Mikrotubul derleme önleyen bir nispeten yüksek sitotoksisite vardır. Ayrıca, hücreleri nocodazole tutuklandı tanımışlar tarafından Mitotik kayma Interphase geri dönebilirim. Çift timidin blok tutuklama hücreleri G1/S faz ve blok sürümden sonra zaman uyumlu olarak G2 ve mitoz içine devam etmek için hücreleri bulunur. Timidin bloğundan çıkış hücrelerin hücre döngüsünün normal ilerleme yüksek çözünürlüklü confocal mikroskobu altında hücre fiksasyon veya canlı görüntüleme tarafından görülebilir. Özellikle hücre girin ve mitoz Kişilik timidin blok sürümden sonra devam pertürbasyon Mitotik proteinlerin etkisi okudu. Cdt1, çok fonksiyonlu bir protein DNA çoğaltma kaynağı G1 aşamasında lisansı içinde yer alan ve aynı zamanda mitoz15sırasında kinetochore Mikrotubul ekleri için gereklidir. Cdt1 fonksiyonu mitoz sırasında çalışmaya bir lisans çoğaltmayı G1 aşamasında, aynı zamanda onun tükenmesi özellikle aşamasında G2/M sadece etkileyen üzerinde onun tükenmesi etkisini önler bir yöntem evlat edinmek gerekiyor. Burada, sabit ve canlı hücre görüntüleme tarafından birden fazla işlevi hücre döngüsünün farklı aşamalarında gerçekleştirme proteinlerin Mitotik rol çalışmaya Çift Kişilik timidin blok dayalı ayrıntılı iletişim kuralları mevcut.

<table><tbody><tr><td>DMEM (1x)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11965-092</td><td>4 & derecede mağaza; C</td></tr><tr><td>DPBS (1x)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>14190-144</td><td>4 > C</td></tr><tr><td>Leibovitz' s (1x) L-15 orta</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>21083-027</td><td>4 > C</td></tr><tr><td>Serum azaltılmış orta (Opti-MEM)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>319-85-070</td><td>4 > C</td></tr><tr><td>Penisilin ve streptomisin</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15070-063 (Kalem Strep)</td><td>1:1.000 seyreltme</td></tr><tr><td>Dharmafect2</td><td>GE Dharmacon</td><td>T-2002-02</td><td>4 & deg'de saklayın; C</td></tr><tr><td>Thymidine</td><td>MP Biomedicals LLC</td><td>103056</td><td>Steril damıtılmış suda çözülmüş</td></tr><tr><td>Cdt1 siRNA</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td></td><td>Ref 10</td></tr><tr><td>Hec1 siRNA</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td></td><td>Ref 13</td></tr><tr><td>GFP-H2B</td><td></td><td></td><td></td>eksprese eden</tr><tr><td>HeLa hücreleri GFP-&alfa;-tubulin ve mCherry H2B eksprese eden HeLa hücreleri</td><td>Tohoku'dan Dr. Kozo Tanaka'dan cömert hediye üniversite, Japonya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Formaldehit çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich Corporation</td><td>F8775</td><td>Toksik, dikkatli olması gerekiyor</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich Corporation</td><td>D9542</td><td>Toksik, dikkatli olması gerekiyor</td></tr><tr><td>Fare anti-&alfa;-tubulin</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>Sc32293</td><td>1:1.000 seyreltme</td></tr><tr><td>Tavşan karınca-Zwint1</td><td>Bethyl</td><td>A300-781A</td><td>1:400 seyreltme</td></tr><tr><td>Fare anti-fosfo-&gama; H2AX (Ser139)</td><td>Upstate Biotechnology</td><td>05-626, klon JBW301</td><td>1:300 seyreltme</td></tr><tr><td>Alexa 488</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td></td><td>1:250 seyreltme</td></tr><tr><td>Rodamine Red-X</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td></td><td>1:250 seyreltme</td></tr><tr><td>BioLite 6 kuyulu çok amaçlı</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>130184</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Cam alt çanak</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35GCOL-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TiE ters mikroskop</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Konfokal</td><td>Yokagawa</td><td>CSU-X1</td><td></td></tr><tr><td>Ultra 888 EM-CCD Kamera</td><td>Andor</td><td>iXon Ultra EMCCD</td><td></td></tr><tr><td>4 dalga boyu lazer</td> için eğirme diski Mikroskoplar için <td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>İnkübasyon Sistemi</td><td>Tokai Hit</td><td>TIZB</td><td></td></tr><tr><td>NIS elemanları yazılımı</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mitotik hücre eşitleme ve yüksek çözünürlüklü confocal mikroskobu mitoz sırasında çok fonksiyonlu hücre döngüsü proteinlerin rolü çalışmaya birleştirme

Combining Mitotic Cell Synchronization and High Resolution Confocal Microscopy to Study the Role of Multifunctional Cell Cycle Proteins During Mitosis

Çalışma bir aşama bağlı şekilde hücre döngüsünün çeşitli düzenleyici olayların hücre büyümesi ve bölünme hakkında net bir anlayış sağlar. Hücre popülasyonlarının eşitleme hücre döngüsünün belirli aşamalarında bu tür deneysel gayretlerinde çok yararlı olduğu tespit edilmiştir. Hücreleri tarafından nispeten daha az toksik kimyasallar ile tedavi eşitlenmesi farmakolojik inhibitör uyuşturucu kullanımı sonucu hücre döngüsü olaylar ve seçili Mitotik aşamaları belirli zenginlik elde etmek için çalışma için yararlı olabilir. Burada, eşitleme insan hücreleri hücrenin farklı aşamalarında döngüsü, ikimiz de dahil olmak üzere S faz ve bir çift timidin blok-M faz ve yordam kromozom uyum içinde Mitotik proteinler işlevselliğini çalışmak için serbest bırakmak için protokol tarif ve segregasyon. Bu iletişim kuralı kurulan Interphase işlevleri sahip çok fonksiyonlu proteinlerin Mitotik rolleri çalışmak için son derece yararlı olmuştur. Sadece G2/M özel Cdt1 boşaldığında bizim durumumuzda, Cdt1, bir protein için lisans çoğaltma kaynağı G1 evresinde, kritik Mitotik rolü etkin bir şekilde ele. Biz Çift Kişilik timidin eşitlemeyi kullanarak tükenmesi G2/M özel Cdt1 için detaylı iletişim kuralı tanımlamak. Biz de hücre fiksasyon Protokolü açıklamak ve yüksek çözünürlüklü confocal mikroskobu timidin yayımlanmasından sonra kullanarak hücre görüntüleme yaşamak. Yöntem de bir büyük örneklerin boyutu sabit ve canlı hücre için Mitotik hücre elde etmek kullanmasına olanak tanır Hec1, karmaşık, Ndc80 bir bileşeni için gibi fizyolojik ve perişan koşullarda Mitotik proteinlerin işlevi çözümlemek için yararlıdır analiz biz burada gösterdiği gibi.

Mitotik ilerleme ve Mikrotubul istikrar hücrelerde çalışma çift timidin blok sürümden sonra sabit Cdt1 DNA çoğaltma kökenleri G1 aşamasında lisansı içinde yer almaktadır. S aşamasında bozulmuş ama G2/M aşamasında yeniden birikir. Mitoz rolü çalışmaya, endojen Cdt1 en uygun hücre eşitleme tekniği Çift Kişilik timidin blok15kullanarak özellikle G/M aşamasında tükenmiş gerekiyor. Hücreleri faz ve hangi zaman çoğaltma kökeni G1, ayrıca Cdt1 işlevi g...

Biz bir protokol yüksek çözünürlüklü confocal mikroskobu kullanılarak analiz tarafından takip HeLa hücreleri Çift Kişilik timidin eşitlenmesi için mevcut. Bu yöntem de interfaz işlevleri sahip çok fonksiyonlu proteinlerin Mitotik rolleri üzerinde çalışmalar etkinleştirme mitoz, zaman uyumlu olarak S faz geçin hücreleri çok sayıda elde anahtarıdır.

Mitotik hücre eşitleme ve yüksek çözünürlüklü Confocal mikroskobu mitoz sırasında çok fonksiyonlu hücre döngüsü proteinlerin rolü çalışmaya birleştirme

Study of the various regulatory events of the cell cycle in a phase-dependent manner provides a clear understanding about cell growth and division. The ...

Bu prosedürün genel amacı, kritik interfaz fonksiyonlarına sahip olabilen çok işlevli proteinlerin mitotik rollerini incelemek için çift timidin senkronizasyonu ve yüksek çözünürlüklü konfokal mikroskopi kullanmaktır. Bu yöntem, hücre biyolojisi alanında, hücre döngüsü ve mitozda yer alan proteinlerin normal işlevlerinin nasıl tanımlanacağı ile ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin başlıca avantajları, hücrelerin normal fizyolojik davranışlarını sürdürebilmeleri ve bu yöntemin uygulanmasının da çok kolay olmasıdır.Bu prosedürü göstermek, bu yöntemin kullanımında uzman olan laboratuvarımdan bir doktora sonrası olan Dr.Mohammed Amin olacaktır. Mitotik hücre ilerlemesinin sabit hücre görüntülemesi için,% 70 etanol ve UV ile sterilize edilmiş bir örtü kayması ve iki mililitre DMEM ortamı içeren altı oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna yaklaşık iki kez 10 ila beşinci HeLa hücresi tohumlayarak başlayın. Bir hücre kültürü inkübatöründe 24 saat sonra, hücreleri oyuk başına iki mililitre taze seyreltilmiş timidin ve taze ortam ile bloke edin ve plakayı 18 saat daha inkübatöre geri koyun.Ertesi gün, hücreleri iki kez iki mililitre PBS ile ve bir kez taze 37 san

combining-mitotic-cell-synchronization-high-resolution-confocal

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

İşte biz görüntüye bir temel protokolü açıklamak ve siRNA transfeksiyon sonra canlı memeli doku kültürü hücrelerinde mitoz zamanlama ölçmek.

Zaman atlamalı Görüntüleme siRNA Transfeksiyon sonra Mitoz

SAC kardeş kromatidler arasında mitotik segregasyon izlenmesi, sinyali başlatır nerede kinetochore olduğunu. A metodunda kromozom hareketi ile kinetochore proteinler ve koordinasyon birinin seçilmesi ve devir görselleştirme tarif...

Living Görselleştirilmesi Dinamik Kinetochore Protein Davranış ve Kromozom Hareket tarafından Mitotik Checkpoint incelenmesi<em&gt; Drosophila</em&gt; Sinsityal Embriyolar

Geçiş anafaz-teşvik kompleksi (APC / C)-bağımlı ubikuitinasyon ve burada siklin B. sonraki yıkım, biz, darbe-kovalamaca etiketleme sonrasında, bir sistem kurulmuş tüm hücre popülasyonlarında siklin B proteoliz izleme sağlar ve tetiklenir anafaz için metafaz mitotik geçiş noktasından müdahale tespitini kolaylaştırır.

Tüm Cep Populasyonlarının Tek Hücre Düzeyinde Siklin B Proteoliz incelenmesi

Nöral progenitör mitoz nöron kritik bir parametredir. Nöral progenitör mitoz anlayışımızın çok sabit doku analizine dayanmaktadır. Embriyonik beyin dilimleri Canlı görüntüleme, kontrollü bir ortamda, yüksek zamansal ve mekansal çözünürlük ile mitoz değerlendirmek için çok yönlü bir tekniktir.

Gelişmekte Fare Embriyonik Cortex mitoz Canlı Görüntüleme

Hücre döngüsünün belirli evreleriyle ilgili olayları incelemek için bir bağlam sağlayan iki hücre senkronizasyon protokolünü bildiriyoruz. Bu yaklaşımın, pertürbüssüz bir hücre döngüsünde spesifik genlerin düzenlenişini analiz etmek için veya hücre döngüsünü etkileyen maddelere maruz kaldığında yararlı olduğunu göstermektedir.

Hücre Çevrimiyle Düzenlenen Gen İfadesini İki Tamamlayıcı Hücre Senkronizasyon Protokolü İle Çalışmak

Bu iletişim kuralı verimli çalışmalar 3D kollajen matrisler memeli hücre bölünmesi hücre bölünmesi, eşitlenmesi entegre ederek 3B matrisleri canlı hücre görüntüleme tekniği, confocal yansıması zaman çözüldü mikroskobu kullanarak bölümü olayların izlenmesi ve nicel analiz görüntüleme.

Memeli hücre bölünmesi yılında niceliksel Confocal yansıma mikroskobu ile 3D matrisler

Bu iletişim kuralı etiket ve canlı kromozomlar Mitotik hücre Histone2B-GFP BacMam 2.0 etiket ve bir iplik kaset confocal mikroskobu sistemi kullanarak görselleştirmek için basit ve uygun bir yöntem açıklanır.

Kromozom segregasyon mitoz sırasında canlı hücre görüntüleme

Burada, araştırmacıların mitoz ve Meiosis sırasında yaşayan fisyon Maya hücrelerinde protein davranışları ve nükleer dinamikleri incelemesini sağlayan toksik olmayan bir mikroskopi yöntemi olan canlı hücreli görüntüleme sunuyoruz.

Floresans canlı hücre mikroskobu ile mitotik ve meiotic Fission Maya nükleer dinamiklerinin incelenmesi

Burada mil oluşumu ve mitotik progresyon dinamiklerini değerlendirmek için bir protokol sıyoruz. Hızlandırılmış görüntüleme uygulamamız, kullanıcının mitozbölünmenin çeşitli aşamalarındaki hücreleri belirlemesini, mitotik defektleri izlemesini ve tanımlamasını ve anti-mitotik ilaçlara maruz kalındığında mil dinamiği ve mitotik hücre kaderini analiz etmesini sağlar.

Mitotik Mil Pertürbasyonları Sonrası Metafaz Zamanlaması ve Hücre KaderiniN Dinamiği Nin Dinamiği Nin Dinamitini Değerlendirmek Için Canlı Hücre Görüntülemesi

Bu protokol, maya hücresi döngüsü durdurma ve isteğe bağlı salım için iki yöntemi detaylandırır ve hücre döngüsüne bağlı süreçleri incelemek için floresan mikroskobunun kullanımını detaylandırır.

Tomurcuklanan mayada hücre döngüsüne bağlı süreçlerin manipülasyonu ve analizi

Öğrenin, HeLa hücrelerinde çift timidin senkronizasyonu ve yüksek çözünürlüklü konfokal mikroskopi kullanarak mitoz sırasında çok fonksiyonlu proteinlerin rollerini nasıl inceleyeceğinizi. Bu yöntem, hücre döngüsü dinamiklerini ve protein fonksiyonlarını detaylı şekilde analiz etmenizi sağlar.

Mitotik hücre eşitleme ve yüksek çözünürlüklü Confocal mikroskobu mitoz sırasında çok fonksiyonlu hücre döngüsü proteinlerin rolü çalışmaya birleştirme (Video) | JoVE Journal

Mitotik hücre eşitleme ve yüksek çözünürlüklü Confocal mikroskobu mitoz sırasında çok fonksiyonlu hücre döngüsü proteinlerin rolü çalışmaya birleştirme

Daha fazla video keşfet