Mitotik hücre eşitleme ve yüksek çözünürlüklü Confocal mikroskobu mitoz sırasında çok fonksiyonlu hücre döngüsü proteinlerin rolü çalışmaya birleştirme

Bu prosedürün genel amacı, kritik interfaz fonksiyonlarına sahip olabilen çok işlevli proteinlerin mitotik rollerini incelemek için çift timidin senkronizasyonu ve yüksek çözünürlüklü konfokal mikroskopi kullanmaktır. Bu yöntem, hücre biyolojisi alanında, hücre döngüsü ve mitozda yer alan proteinlerin normal işlevlerinin nasıl tanımlanacağı ile ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin başlıca avantajları, hücrelerin normal fizyolojik davranışlarını sürdürebilmeleri ve bu yöntemin uygulanmasının da çok kolay olmasıdır.

Bu prosedürü göstermek, bu yöntemin kullanımında uzman olan laboratuvarımdan bir doktora sonrası olan Dr.Mohammed Amin olacaktır. Mitotik hücre ilerlemesinin sabit hücre görüntülemesi için,% 70 etanol ve UV ile sterilize edilmiş bir örtü kayması ve iki mililitre DMEM ortamı içeren altı oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna yaklaşık iki kez 10 ila beşinci HeLa hücresi tohumlayarak başlayın. Bir hücre kültürü inkübatöründe 24 saat sonra, hücreleri oyuk başına iki mililitre taze seyreltilmiş timidin ve taze ortam ile bloke edin ve plakayı 18 saat daha inkübatöre geri koyun.

Ertesi gün, hücreleri iki kez iki mililitre PBS ile ve bir kez taze 37 santigrat derece ortamla yıkayın. Hücreleri bloktan serbest bırakmak için hücreleri dokuz saat boyunca inkübatöre geri koyun, ardından oyuk başına iki mililitre timidin takviyeli ortam ilave edin. İkinci bloke edici inkübasyondan sonra, hücreleri iki kez iki mililitre PBS ile ve bir kez iki mililitre taze 37 santigrat derece ortam ile yıkayın ve uygun kuyucuklara 100 nanomolar taze hazırlanmış siRNA ekleyin.

Dokuz ila 10 saat sonra, süpernatanı aspire edin ve hücreleri, oda sıcaklığında 20 dakika boyunca yüzde dört paraformaldehit içeren kapak fişlerine sabitleyin. PBS ile yıkadıktan sonra, sabit hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca% 0,5 deterjanla geçirgenleştirin, ardından PBS'de beş dakikalık iki yıkama yapın. Hücreleri oda sıcaklığında bir saat boyunca PBS'de yüzde bir BSA ile bloke edin.

Daha sonra hücreleri, 37 santigrat derecede bir saat boyunca ilgilenilen birincil antikorların 50 mikrolitresi ile etiketleyin. İnkübasyonun sonunda, hücreleri PBS'de üç kez yıkayın ve bunları 50 mikrolitre uygun ikincil antikorlarla etiketleyin. Oda sıcaklığında bir saat sonra, hücreleri her yıkamada beş dakika boyunca PBS'de iki kez yıkayın ve hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca DAPI ile etiketleyin.

PBS'de beş dakikalık iki yıkama ile DAPI boyamayı takip edin ve lamleri ayrı ayrı şeffaf mikroskop slaytlarına monte etmek için uygun montaj ortamını kullanın. Daha sonra, uygun bir kamera ile donatılmış, ters çevrilmiş yüksek çözünürlüklü konfokal mikroskop üzerine monte edilmiş 60 veya 100 X 1.4 sayısal açıklık planı apokromatik DIC yağa daldırma hedefleri kullanarak, 0.2 mikrometre kalınlığındaki Z yığınlarında immün yolla boyanmış proteinlerin görüntülerini elde edin. Mitotik hücre ilerlemesinin canlı hücre görüntülemesi için, mCherry H2B ve GFP alfa-tubulini 1.5 mililitre DMEM ortamı içeren 35 mililitrelik cam tabanlı kaplara stabil bir şekilde eksprese eden yaklaşık 0.5 ila bir kez 10 ila beşinci HeLa hücrelerini tohumlayın.

Hücreleri 24 saat boyunca bir hücre kültürü inkübatöründe büyütün. Daha sonra, timidin hücreleri az önce gösterildiği gibi iki kez bloke eder, bu sefer hücreleri iki mililitre PBS ile iki kez ve her timidin bloğunun sonunda bir mililitre önceden ısıtılmış DMEM ortamı ile bir kez yıkar ve hücreleri siRNA ile tedavi eder ilk timidin yıkaması sırasında ilk bloktan sonra. Hücreleri ikinci bloktan serbest bırakmak için sekiz saat boyunca% 10 FBS ve 20 milimolar HEPES ile desteklenmiş, önceden ısıtılmış taze Leibovitz ortamında büyütün.

Daha sonra ilk plakayı yüksek çözünürlüklü bir konfokal mikroskobun sıcaklık kontrollü odasına yerleştirin ve hücreleri odaklamak için 60 X objektif ve parlak alan görüntülemeyi kullanın. Hücreler görünür olduğunda, plaka konumunu tercih edilen bölgeye manuel olarak ayarlayın ve lazer gücünü ve pozlamayı, görüntü elde etme parametrelerini ve deney süresini ayarlamak için görüntü elde etme yazılımını kullanın. Uygun GFP ve mCherry filtrelerini seçin ve mitoz işleminin hızlandırılmış görüntülerini elde etmek için 16 saate kadar her 10 dakikada bir darbeli iletilen ışık ve floresan görüntüleri elde edin.

Çift timidin bloğundan serbest bırakıldıktan dokuz saat sonra, görüntüleri 12 adet bir mikrometre ayrılmış z-düzleminde elde edin. Ardından, tek tek mitotik hücreleri izleyerek görüntüleri analiz edin ve karşılık gelen bir filmi bir araya getirmek için uygun kaynak yazılımı kullanın. Kontrol ve Cdt1 siRNA hücrelerinin çoğu, çift timidin bloğundan salındıktan dokuz saat sonra metafaz aşamasında olmasına rağmen, 10 saatteki fiksasyon, Cdt1 siRNA ile tedavi edilen hücrelerin çoğunun hala geç prometafazda tutuklandığını, kontrol hücrelerinin ise anafaza girdiğini ve kromozomlarını beklendiği gibi ayırdığını ortaya koymaktadır.

Çift timidin bloğundan salındıktan dokuz saat sonra soğuk muamele, Cdt1 ile tükenmiş hücrelerde, kontrol tükenmiş hücrelerdekilere kıyasla nispeten daha az sağlam olan stabil kinetokor mikrotübüllerinin tutulmasını kolaylaştırır. DNA replikasyon kaynağı lisanslaması, G2-M fazı sırasında Cdt1 veya kontrol tükenmiş hücrelerde bozulmaz, çünkü bu hücrelerin sonraki G2 fazı sırasında DNA hasarı için bir belirteç olan fosforallı gama H2AX birikimini indüklediği bulunmamıştır. Bununla birlikte, asenkron kültürlerin Cdt1 siRNA transfeksiyonu, muhtemelen yanlış DNA replikasyon lisanslamasının neden olduğu DNA hasarı nedeniyle fosfo gama H2AX pozitif odaklarının birikmesine neden olur.

Nükleer zarf parçalandıktan sonra, normal hücreler mitoza girer ve yaklaşık 30 ila 60 dakika içinde mitozdan çıkmak için anafaz başlangıcına uğrar. Bununla birlikte, sağlam kinetokor mikrotübül eki oluşumu için gerekli olan önemli bir kinetokor proteini olan Hec1'in RNAi aracılı yıkımı, birkaç saatlik mitoz gecikmesinden sonra bile anafaz başlangıcına veya mitozdan çıkışa kadar normal mitotik ilerlemeyi geciktirir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde uygulanırsa üç ila dört gün içinde tamamlanabilir.

Prosedürü denerken, timidini dondurucudan çözdükten sonra tamamen çözmeyi unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, interfaza kıyasla mitoz sırasında ilgilenilen proteinlerin ekspresyon paternleri nelerdir gibi ek soruları yanıtlamak için western blotlama gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, hücre biyolojisi alanındaki araştırmacıların insan hücre kültürü modellerinde kanser biyogenezini keşfetmelerinin ve ilgilenilen proteinlerin hücre döngüsü ile ilgili işlevlerini tanımlamak için yüksek çözünürlüklü konfokal mikroskopi kullanmalarının yolunu açtı.

Paraformaldehit ve DAPI gibi reaktiflerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman eldiven ve laboratuvar önlüğü giymek gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.