Kronik Lenfositik Lösemi Hastalarında Metil-CpG-Bağlayıcı Alan Yakalamaya Dayalı Bir Yöntem Kullanarak Kapsamlı DNA Metilasyon Analizi

Bu prosedürün genel amacı, yeni nesil dizileme kullanarak kronik lenfositik lösemi hastalarında küresel metilasyon profilini incelemek ve diferansiyel olarak metillenmiş CpG açısından zengin bölgeleri belirlemektir. Bu yöntem, potansiyel KLL'ye özgü imza genlerinin tanımlanması, hastalık patogenezi ve prognoz gibi epigenetik alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, tarafsız ve PCR'den bağımsız bir şekilde CpG metilasyonunun genom çapında tam kapsamını sağlamasıdır.

Başlamak için, üreticinin protokolüne göre hastadan ve normal periferik kan mononükleer hücre örneklerinden genomik DNA'yı izole etmek için ticari olarak temin edilebilen bir DNA ekstraksiyon kiti kullanın. Genomik DNA'yı metin protokolünde tarif edildiği gibi ölçtükten sonra, her numuneden 5 mikrogram genomik DNA'yı, TE tamponu kullanarak toplam 200 mikrolitreye seyreltin ve mikrolitre başına 25 nanogramlık bir nihai konsantrasyon verin. Daha sonra, bir sonikatör kullanarak, 30 saniye açık ve 30 saniye kapalı olmak üzere toplam 30 döngü için özel olarak tasarlanmış tüplerde sonikasyon gerçekleştirin.

Her beş döngüden sonra, numuneleri dibe toplamak için tüpleri kısaca döndürün. Metin protokolünde açıklandığı gibi DNA elektroforezi kullanarak tüm örnekler için sonikasyon aralığını kontrol edin. Manyetik streptavidin boncuklarını hazırlamak için, önce bunları kit tarafından sağlanan stok tüpünden yeniden askıya alın.

Homojen bir süspansiyon elde etmek için boncukları nazikçe yukarı ve aşağı pipetleyin. Her beş mikrogram parçalanmış DNA örneği için, 50 mikrolitre boncukları ayrı, temiz ve etiketlenmiş 1.5 mililitrelik tüplere yerleştirin. 100 mikrolitrelik nihai hacme ulaşmak için 50 mikrolitre 1X boncuk yıkama tamponu ekleyin.

Tüm manyetik boncukların mıknatısa bakan tüpün iç duvarına konsantre olmasını sağlamak için tüpleri bir dakika boyunca manyetik bir stand üzerine yerleştirin. 200 mikrolitrelik bir pipet kullanarak boncuklara dokunmadan sıvıyı çıkarın. Ardından, tüpleri manyetik standdan çıkarın, 250 mikrolitre 1X boncuk yıkama tamponu ekleyin ve boncukları bir pipetle hafifçe karıştırın.

Bu adımları tüm numuneler için en az dört kez tekrarladıktan sonra, son olarak numuneleri 250 mikrolitre 1X boncuk yıkama tamponunda yeniden süspanse edin. Numuneleri buz üzerinde tutun. MBD-biotin proteinini yıkanmış boncuklara bağlamak için, önce ayrı tüplere 35 mikrolitre protein ekleyin ve 1X boncuk yıkama tamponu kullanarak toplam hacmi 250 mikrolitreye getirin.

250 mikrolitre yıkanmış boncuklara 250 mikrolitre seyreltilmiş MBD proteini ekleyin ve oda sıcaklığında uçtan uca rotasyonda bırakın. Boncukları bir saat boyunca proteinde karıştırdıktan sonra, tüpleri bir dakika boyunca manyetik stand üzerine yerleştirerek proteine bağlı manyetik streptavidin boncuklarını yıkayın. Bir pipet kullanarak boncuklara dokunmadan sıvıyı çıkarın.

Ardından, 250 mikrolitre 1X boncuk yıkama tamponu ekleyin ve tüpleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca bir rotasyon karıştırıcısına yerleştirin. Yıkanmış MBD-biyotin boncuklarını 200 mikrolitre 1X boncuk yıkama tamponunda yeniden süspanse etmeden önce yıkama adımını iki kez daha tekrarlayın ve boncukları metillenmiş DNA yakalamaya hazır hale getirin. Temiz, 1.5 mililitrelik DNaz içermeyen bir tüpe, 100 mikrolitre mililitre boncuk yıkama tamponu ve 180 mikrolitre parçalanmış genomik DNA ekleyin.

DNaz içermeyen su kullanarak son hacmi 500 mikrolitreye getirin. Parçalanmış genomik DNA'nın kalan 20 litresine 380 mikrolitre DNaz içermeyen su ekleyin. Örnekleri daha sonra daha fazla işlemek ve giriş DNA kontrolleri olarak kullanmak için dondurun.

Yıkanmış MBD-biotin boncukları içeren tüpleri bir dakika boyunca manyetik bir stand üzerine yerleştirin ve boncukları rahatsız etmeden sıvıyı çıkarın. Ardından, boncuk yıkama tamponunda seyreltilmiş 500 mikrolitre parçalanmış genomik DNA ekleyin. Tüm tüpleri parafin film ile sıkıca kapatın ve gece boyunca 4 santigrat derecede, uçtan uca bir rotasyon standında dakikada 8 ila 10 rotasyonda bırakın.

DNA ve MBD boncuk bağlama reaksiyonundan sonra, tüm boncukları tüpün iç duvarına konsantre etmek için tüpleri bir dakika boyunca manyetik rafa yerleştirin. Boncuklara dokunmadan süpernatan sıvıyı bir pipetle çıkarın ve bu bağlanmamış DNA örnek fraksiyonunu buz üzerinde saklayın. Daha sonra boncuklara 200 mikrolitre 1X boncuk yıkama tamponu ekleyin ve tüpleri oda sıcaklığında üç dakika boyunca dönen standın üzerine yerleştirin.

Manyetik standı kullanarak sıvıyı çıkardıktan sonra, kalan bağlanmamış DNA'yı çıkarmak için yıkamayı iki kez daha tekrarlayın. Son yıkamadan sonra, DNA'yı elüte etmek için kitte sağlanan 200 mikrolitre yüksek tuzlu elüsyon tamponu ekleyin. Ardından, tüpleri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca döner standın üzerine yerleştirin.

İnkübasyonun ardından, bunları bir dakika boyunca manyetik standa yerleştirin ve süpernatanı yeni, temiz 1,5 mililitrelik bir tüpe dikkatlice aktarmak için bir pipet kullanın. Daha sonra, boncuklara 200 mikrolitre yüksek tuzlu elüsyon tamponu ekleyin ve tüpleri oda sıcaklığında 15 dakika daha döndürerek elüsyonu tekrarlayın. İkinci elute'yi, ilk elutenin 200 mikrolitresini içeren aynı tüpe ekleyin.

DNA'yı çökeltmek için, 400 mikrolitre ayrıştırılmış DNA'ya bir mikrolitre glikojen, 40 mikrolitre üç molar sodyum asetat, pH 5.2 ve 800 mikrolitre buz gibi soğuk mutlak etanol ekleyin. Ayrıca reaktifleri daha önce dondurulmuş 400 mikrolitre giriş DNA kontrol numunelerine ekleyin. Tüpleri gece boyunca eksi 80 santigrat derecede inkübe etmeden önce girdap yaparak iyice karıştırın.

Ertesi gün, tüpleri 30 dakika boyunca 12.000 kez g ve 4 santigrat derecede santrifüjleyin. Peleti bozmadan süpernatanı dikkatlice atın. Daha sonra 500 mikrolitre% 70 etanol ekleyin ve tüpleri girdaplayın.

Tüpleri aynı koşulları kullanarak ancak 15 dakika boyunca tekrar santrifüjledikten sonra, bir pipet kullanarak süpernatanı dikkatlice çıkarın. Ardından, tüpleri oda sıcaklığında bir dakika boyunca maksimum hızda santrifüjleyin ve kalan etanolü bir pipet ucu kullanarak tamamen çıkarın. Peleti oda sıcaklığında beş dakika havayla kurutun.

Son olarak, metin protokolünde açıklandığı gibi metillenmiş DNA miktar tayini, MBD dizilimi ve analizine geçmeden önce DNA peletine 10 mikrolitre DNaz içermeyen su ekleyin. Analiz, normal kontrollere kıyasla KLL örneklerinde zenginleştirilmiş birkaç farklı hiper ve hipometillenmiş bölge tanımladı. Bu diferansiyel olarak metillenmiş bölgeler, farklı protein kodlayan ve kodlamayan gen sınıflarına eşlendi.

Son olarak, veri analizi, iki farklı normal kontrol karşılaştırmasından elde edilen KLL ile ilişkili diferansiyel olarak metillenmiş bölgeler arasında önemli bir örtüşme olduğunu göstermiştir. Burada, diferansiyel olarak metillenmiş iki genin hedef bölgelerinde bulunan tüm CpG bölgeleri, pyrosequencing kullanılarak çok sayıda CLL örneğinde doğrulandı. Bu yöntem için gerekli olan optimum sonikasyon aralığı burada gösterilmiştir.

Bu parçalanmış DNA serisi, yeni nesil dizileme amaçları için ideal ve daha uygundur. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde yapılırsa iki gün içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, nihai DNA geri kazanımını etkileyen önemli faktörler, kullanılan giriş DNA'sının kalitesi ve miktarı ve sonikasyondan sonra parçalanmış DNA'nın aralığıdır.

Bu yöntemi kullanmaya karar verdik çünkü bu, genom boyunca tüm metillenmiş bölgeleri kaplayan metillenmiş DNA'yı zenginleştirmek için immünopresipitasyona dayanan ilk CLL global metilasyon çalışmasıdır. Bu tekniğin etkileri prognoz veya tedaviye doğru uzanır, çünkü tanımlanan diferansiyel olarak metillenmiş imza genleri, tedavi için küresel normal biyobelirteçler ve epigenetik hedefler olarak hizmet edebilir. Bu prosedürü takiben, zenginleştirilmiş metillenmiş DNA, dizilerde bulunan sabit bir CpG bölgeleri seti kullanarak iki numune veya hastalık varlığı arasındaki metalomları kolayca karşılaştırmak için hibritleştirme veya mikrodiziler yapma gibi diğer aşağı akış uygulamaları için kullanılabilir.

Son olarak, bu, protein kodlayan genleri kapsayan açıklamalı dizilerin yanı sıra tekrarlayan elementleri ve uzun kodlamayan RNA'ları kapsayan açıklamasız diziler de dahil olmak üzere, genom boyunca metillenmiş diziler için çok sayıda hasta örneğini analiz etmek için uygun maliyetli bir tekniktir.