DNA Metilasyonunun Biyoinformatik Analizine Örnek Hazırlama: Obezite ve İlgili Özellik Çalışmaları için Dernek Stratejisi

Büyük ölçekli omik teknolojiler, obeziteye odaklanan çalışmalarda giderek daha fazla kullanılmaktadır. Epigenetik, maruz kalma ve sağlık sonuçları arasında bir bağlantı olabilir. Bu tür bir çalışma çok miktarda veri üretir.

Bu göz önüne alındığında, verileri teknik olarak karşılaştırılabilir hale getirmek için protokolleri standartlaştırmak önemlidir. Bu çalışmada, DNA metilasyon verilerini elde etmek ve analiz etmek için bir boru hattı önereceğiz. Aynı protokol hem 400K hem de epik versiyonlar için uygulanabilir.

Birinci gün: Bisülfit tedavisi. Genomik DNA'yı denatüre ederek başlayın, ardından dönüşüm reaktiflerini ekleyin. Kitin tavsiyelerine uymak gerekir.

Ve denatüre edici DNA'yı bisfosfat ile tedavi edin. Daha sonra numuneleri bir termal döngüleyicide inkübe edin. Yıkama tamponunu kullanarak yıkama adımlarını gerçekleştirin.

İkinci gün: Metilasyon tahlilini takiben amplifikasyon, manuel protokol. Hibridizasyon fırınını 37 santigrat derecede önceden ısıtın ve sıcaklığın dengelenmesini sağlayın. 20 mikrolitre MA1'i plakanın kuyucuklarına dağıtın.

DNA'nın dört mikrolitresini plakadaki karşılık gelen kuyucuklara aktarın. Dört mikrolitre sodyum hidroksit çözeltisini plaka kuyucuklarına dağıtın. Plakayı plastik bir conta ile kapatın.

Reaktifleri numunelerle karıştırmak için plakayı vorteksleyin. Oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Her bir kuyucuğa 68 mikrolitre RPM ve daha sonra önceki çözeltiyi çıkarmadan 75 mikrolitre MSM dağıtın.

Plakayı örtmek için yeni bir conta kullanın. Plakayı bir dakika boyunca vorteksleyin. Hibridizasyon fırınında 37 santigrat derecede 20 ila 24 saat boyunca inkübe edin.

Üçüncü gün: Metilasyon tahlilini takiben hibridizasyon, manuel protokol. Plakayı 37 santigrat dereceye yerleştirerek bloğu önceden ısıtın. Plakayı hibridizasyon fırınından dikkatlice çıkarın.

Darbe plakayı santrifüj eder. Contayı plakadan çıkarın. Her numune kabına 50 mikrolitre FMS ekleyin.

Plakayı bir dakika boyunca vorteksleyin. Plakanın ihtiyaç duyduğu santrifüj. Daha sonra kapalı plakayı bir saat boyunca 37 santigrat derecede ısıtma bloğuna yerleştirin.

Numune içeren her kuyucuğa 100 mikrolitre PM1 ekleyin. Plakayı tekrar kapatın. Plakayı bir dakika boyunca vorteksleyin.

Beş dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra santrifüjde bir dakika boyunca nabız atın, ardından numune ile her bir oyuğa 300 mikrolitre% 1002-propanol ekleyin. Plakayı tekrar kapatın.

Plakayı en az 10 kez ters çevirerek tüm içeriği karıştırın. 30 dakika boyunca dört santigrat derecede inkübe edin ve daha sonra 20 dakika boyunca dört santigrat derecede santrifüj yapın. Contayı plakadan çıkarın.

Plakayı uygun bir yerde hızlı bir şekilde ters çevirerek süpernatanı atın. Tüm kuyucukların sıvı içermediğini fark edene kadar birkaç kez sıkıca dokunun. Oda sıcaklığında, plakayı baş aşağı bırakın ve bir saat boyunca açıkta bırakın.

Tüm sıvıyı kuruttuktan sonra, kuyuların dibinde mavi paletler görmek gerekir. Daha sonra her bir kuyucuğa 46 mikrolitre RA1 ekleyin. Isıl yapışmayı plakaya uygulayın.

Sızdırmazlığı eşit şekilde gerçekleştirmek için sıkıca tutun. Tabağı hibridizasyon fırınına bir saat boyunca 48 santigrat derecede, ardından bir dakika boyunca vortekse koyun. Santrifüjde nabız atın ve plakayı bir saat boyunca 95 santigrat derecede ısıtın.

BeadChip Hyb Odalarını birlikte hazırlayın. Bu sonraki adımda, Hyb Odalarındaki rezervuarlara 400 mikrolitre PB2 dağıtın. Hyb Odası haznelerini PB2 ile doldurduktan sonra, kapağı hemen takın.

Her numuneyi plakadan mikrodizinin numune girişine dikkatlice yükleyin. Mikrodizileri içeren Hyb Odası eklerini Hyb Odasına yükleyin. Hyb Odasının olası yer değiştirmesini önlemek için Hyb Odası'nı çapraz olarak kapatın.

Dördüncü gün: Metilasyon tahlilini takiben boyama, manuel protokol. Gece inkübasyonundan sonra, tüm mikro dizileri eklerden çıkarın. Ve mikro dizileri yavaşça ve hafifçe, toplam 10 kez, yukarı ve aşağı yıkayın.

Mikro dizileri iki numaralı PB1 kabına taşıyın ve yukarı ve aşağı olmak üzere 10 kez tekrarlayın. Akış Odasının çerçevelerini doğru konuma ve ardından her bir mikro diziyi yerleştirin. Her birinin üst kısmında şeffaf bir ara parça kullanın.

Hizalama çubuğunun hizalama aksesuarına yerleştirilmesi gerekir. Ara parçanın üstüne bir cam arka plaka yerleştirilmelidir. Ardından metal kelepçeleri Akış Odalarına takın.

Akış Odası ara parçalarının uçlarını kesmek için makas kullanın. Akış Odası'nı mikrodiziyle birlikte hazne rafına yerleştirin. Pipet 150 mikrolitre RA1.

30 dakika boyunca inkübe edin ve beş kez tekrarlayın. Pipet 450 mikrolitre XC1 ve 10 dakika kuluçkaya yatırın. Pipet 450 mikrolitre XC2 ve 10 dakika kuluçkaya yatırın.

Pipet 200 mikrolitre TEM. 15 dakika kuluçkaya yatırın. Pipet 450 mikrolitre% 95 formamid.

Bir dakika boyunca inkübe edin, iki kez tekrarlayın. Beş dakika boyunca kuluçkaya yatırın. Pipet 450 mikrolitre XC3.

Bir dakika boyunca kuluçkaya yatırın ve tekrarlayın. Bu adımda, aşağıdaki reaktifler, 250 mikrolitre STM, 450 mikrolitre XC3 ve 250 mikrolitre ATM dağıtılacaktır. Aşağıdaki tekrarlama şemasını yapın.

Tüm tekrarlardan ve inkübasyonlardan sonra, mikro dizileri ayakta duran bir rafa yerleştirin ve yıkama kabına batırın. 10 kez yukarı ve aşağı hareketlerle yavaş ve hafif hareket etmek. Vakumlu kurutucuyu kullanarak mikrodizileri 50 ila 55 dakika kurutun.

Mikrodiziler kurutulduktan sonra, tarama ile mikrodiziyi görüntülemeye devam edin. Bu görüntüde, katılımcıların seçiminden, metilasyon deneyinin son gününde elde edilen IDAT dosyalarının işlenmesine kadar kullanılan tüm protokolleri görebiliriz. Dosyalar biyoinformatik analizin yapıldığı bilgisayara aktarıldı.

Analiz, R Studio ve Bioconductor ChAMP paketi kullanılarak işlendi. Bilgisayarınızda en az sekiz gigabayt RAM bulunduğundan emin olun. Verileri okuyucuya daha iyi sunmak için gen zenginleştirme gibi diğer biyoinformatik analizler yapıldı.

Bu tabloda, bu çalışmada kullanılan obez ve obez olmayan iki grubu gözlemleyebiliriz. Değişkenler, vücut kitle indeksi, karın çevresi, kilogram cinsinden yağ kütlesi ve yüzde olarak yağ kütlesi açısından gruplar arasında fark vardı. Bu şekilde sunulan şemayı gözlemleyerek, önerilen protokolün verilerimiz için yeterli olduğunu anlayabildik.

Biyoinformatik analizden sonra, filtre yapıldıktan sonra toplam 409.887 prob sunuldu. Yoğunluk grafiği, tüm örneklerin benzer beta dağılımı yoğunluklarına sahip olduğunu ortaya koydu. Bu analizlere dayanarak hiçbir örnek hariç tutulmamıştır.

Normalleştirilmiş verilerin tekil değer ayrışma analizi, VKİ, çift C ve FM'nin DNA metilasyon veri değişkenliğini önemli ölçüde etkilediğini ortaya koymuştur. Hücre tipi tahmini, obez kadınlarda hem doğal öldürücü hücrelerin, hem NK hem de B hücrelerinin daha yüksek olduğunu ortaya koymuştur. Obez ve obez olmayan kadınlar arasındaki DNA metilasyon seviyeleri, hücre tipi düzeltmesinden önce ve sonra farklıydı.

Düzeltmeden önce, 43.463 farklı metilasyon pozisyonu gözlendi. Ve bundan sonra, 3.329 CPG önemli ölçüde kaldı. Toplam 162 CPG hipometillendi ve 576'sı obez olmayanlara kıyasla obezde hipermetillendi.

Veriler, GEO veritabanında GSE166611 kayıt kodu altında mevcuttur. SVD'de gözlenen katılımcıların spesifik özellikleri ile ilişkili KSG bölgelerini sunduk. Yağ kütlesi için 13.222 CPG bölgesi bulundu.

Promotör bölgede 6.159 yağ kütlesi ile ilişkili CPG vardı. 470 hipometillenmiş ve 94 hipermetillenmiştir. İlişkili bölgelerin ilgili genleri zenginleştirildi ve şimdi gösteriliyor.

Önerilen protokolün metilasyon kalıplarınızda özdeşleşebildiğini gözlemledik ve metilasyonlarınızla ilişki kurmanın doğru olduğunu gözlemledik. Sonuçlarımız, obezojenik bir yaşam tarzının insan DNA'sındaki epigenetik değişiklikleri teşvik edebileceğini doğrulamaktadır.