DNA Metilasyon Analizi nesil Dizilimine tarafından hedef

Bu prosedürün genel amacı, ilgili doku veya hücrelerden izole edilen genomik DNA'daki hedef bölgelerdeki CPG metilasyonunu nicelleştirmektir. Bu işlem, öncelikle bisülfit dönüştürülmüş genomik DNA'daki hedef bölgeleri çoğaltmak için bisülfite özgü PCR primeri tasarlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adımda, bisülfit dönüştürülmüş hedef bölge çoğaltılır ve amplikon konsantrasyonlarından yeni nesil sekanslama veya NGS kütüphaneleri oluşturulur.

Ardından, kütüphaneler dizilenir ve analiz için FASTQ dosyaları oluşturulur. Son adımda, dizileme okumaları bisülfit ile dönüştürülmüş referans hedef diziye hizalanır ve nihayetinde sülfit amplikon dizilemesi ile yüzde beş mC hesaplanır veya herhangi bir model organizmanın ilgilenilen herhangi bir bölgesindeki CpG metilasyonunu kesin ve doğru bir şekilde nicelleştirmek için BS-seq gerçekleştirilebilir. Bu tekniğin Sanger dizileme gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, BS-seq'in CpG metilasyon nicelleştirmesini hızlı ve yüksek kapasiteli bir şekilde, doğru ve kesin olarak sunması ve çok sayıda örnekte birden fazla bölgeyi analiz etme imkanı sağlamasıdır.

Hedefi belirleyip primeri tasarladıktan sonra, tek bir amplikonun hedef amplifikasyon optimizasyonu için reaksiyonu hazırlayın ve ardından amplikonları sayfa elektroforezi ile görüntülemek için PCR plakasını ısı sızdırmaz film ile kapatın. Daha sonra, uygun kuyucuklara 30 µL PCR reaksiyonu veya marker yükleyin ve jeli yaklaşık 45 dakika boyunca 200 V'ta çalıştırın. İlk boya jelin sonuna ulaştığında reaksiyonu durdurun ve ardından tüm jeli, taze hazırlanmış 5 µg/mL EtBr ile kaplayın.

Beş dakika sonra, jelin görüntüsünü 482 nanometre uyarım dalga boyunda bir UV transilüminatör yardımıyla alın. Reaksiyonun özgünlüğünü belirlemek için PCR AMPLIKONlarının boyutunu ölçmek üzere marker kullanın. Tespit edilen kütüphane piklerinin ortalama boyutunu belirlemek ve molarite tahmini yapmak için beklenen amplikon boyutu dışındaki çoklu bantların varlığını kontrol edin.

Ardından, üretici talimatlarına uygun olarak, yüksek hassasiyetli bir DNA analizi ile kütüphaneleri bir kapiler elektroforez DNA boyutlandırma çipinde çalıştırın. Kütüphaneleri QPCR ile nicelleştirmek için, oluşturulan kütüphanelerdeki adaptör dizilerine karşı tasarlanmış primerleri ve bilinen konsantrasyondaki standartları, üretici talimatlarına göre mutlak nicelleştirme ayarlarını kullanarak bir gerçek zamanlı (real-time) cihazda kullanın.

Ardından, kütüphanelerin boyutunu ve QPCR'dan elde edilen molar miktarı kullanarak kütüphanelerin molar konsantrasyonlarını hesaplayın. Sekanslama işleminden sonra, sıkıştırılmış fast Q dosyalarını uygun sekanslama analiz hattına aktarın, içe aktar seçeneğini seçin ve ardından okuma kırpma uygulamaları için Q skorlarını korumak amacıyla okumaları oluşturmak için kullanılan sekanslama yöntemini seçin. Uygun sıkıştırılmış fast Q okuma dosyalarını içe aktarın ve ardından genel seçenekler altından kalite skorlarını at seçeneğinin işaretini kaldırın.

İçe aktarılan okumalar için bir konum seçin ve bit düğmesine tıklayın. Ardından NGS temel araçları altından dizileri kırp seçeneğini belirleyin. Kırpılacak okumaları vurgulayın ve yalnızca Q 30 skoruna eşit veya daha yüksek skor içeren okumaları tutun.

Ardından, kalite skorlarını kullanarak kırpma (trim) seçeneğini belirleyin ve limiti 0,001 olarak ayarlayın. Sadece bir veya daha az belirsiz nükleotid içeren okumaları seçmek için, belirsiz nükleotidleri kırp seçeneğini seçin ve maksimum belirsizlik sayısını bir olarak ayarlayın.

Ardından, kırpılmış okumaların kaydedileceği konumu seçin ve kırpılmış okumaları in silico sülfit dönüşümlü gen referansına eşlemek için bit düğmesine tıklayın. NGS temel araçları altından, okumaları eşle seçeneğini seçin. Referans için, eşlenecek kırpılmış okumaları seçin ve ileri düğmesine tıklayın.

Ardından referans maskeleme (reference masking) altında, dönüştürülmüş referans dizisini seçin ve maskeleme yok (no masking) seçeneğini işaretleyin. İleri (next) butonuna tıklayın ve ardından eşleşmeyenler (mismatches), eklemeler (insertions) ve silinmeler (deletions) için üç puan atayın. Referansa eşleşen ok uzunluğunun minimum oranı için bir puan atayın ve spesifik olmayan eşleşme işleme (nonspecific match handling) altında, haritalama, ok ve referans arasındaki minimum kimlik oranı için 0,9 puan atayıp yoksay (ignore) seçeneğini seçin ve çıktı seçenekleri (output options) altında İleri (Next) butonuna tıklayın.

Ardından, Bağımsız okuma eşleşmeleri oluştur (Create standalone read mappings) seçeneğini belirleyin. Daha sonra sonuç yönetimi altında kaydet'e tıklayın. Okuma eşleşmesini kaydetmek için bir konum seçin ve eşleşmiş okumalar üzerinde varyant belirleme işlemini çalıştırmak için bitir'e tıklayın.

Yeniden dizileme analizi altında, düşük frekanslı varyant tespitini seçin ve analiz edilecek ok eşlemesini belirleyin. İleri'ye tıklayın ve ardından düşük frekanslı varyant parametresi altına 0,01% değerini girip ileri'ye tıklayın. Genel filtreler altında, dizinin 1000 x'e eşit veya daha büyük bir derinlikte olduğundan emin olmak için minimum kapsamı 1000 olarak ayarlayın.

Son olarak, "next" seçeneğine tıklayın ve ardından çıktı seçenekleri (output options) altından "create annotated table" seçeneğini belirleyip varyant tablo dosyasını kaydetmek için bir konum seçin; "finish" seçeneğine tıklayın ve varyant tablo dosyasındaki ilgi alanındaki anotasyonlu CPG bölgelerindeki varyant frekanslarını kullanarak, CG bağlamındaki bir referans sitozindeki metilasyon frekansını hesaplayın; konvert edilmiş referans diziye uygun şekilde hizalanmış sülfit amplikon dizileme okumaları, şekilde gösterilenlere benzeyecektir. CPG dinükleotidleri net bir şekilde tanımlanabilir ve CPG bölgelerindeki baz çağrıları gözlemlenerek metilasyon durumları tahmin edilebilir. Haritalanmış okumalarda, %0 metilasyon, CPG bölgelerine hizalanmış timin içeren okumalarla sonuçlanacaktır.

%100 metilasyon kontrolleri, CpG bölgelerine eşlenmiş sitozinler içeren eşlenmiş okumalarla sonuçlanacaktır. Bu deneyde, bir farenin beyincik ve retina dokularından RNA ve DNA birlikte izole edilmiştir. Ardından, opsin ekspresyonunun beklendiği üzere seçici olarak retina dokusunda ifade edildiği QPCR kullanılarak ölçülmüştür.

Bisülfit amplifikasyon dizileme ile Opsin promotör bölgesindeki CPG metilasyon seviyelerinin kantifikasyonu sonucunda, opsin RNA'sı yalnızca retinada tespit edilmiştir. Bununla birlikte, promotör bölgesi genelindeki toplam metilasyon seviyeleri, retinadaki %15'ten az olan seviyeye kıyasla serebellumda %80'den fazladır. B SAS metilasyon kantifikasyonu, bölgeye özgü metilasyon kantifikasyonu imkanı sağlayarak, herhangi bir genomik bölge genelindeki metilasyon seviyelerinin CPG bazında karşılaştırılmasına olanak tanır.

Nitekim bu deneyde, opsin promotörü genelindeki CPG metilasyon seviyelerinin, retina örnekleri ile karşılaştırıldığında serebellar örneklerde anlamlı derecede daha yüksek olduğu saptanmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, dokulardan veya hücrelerden izole edilen genomik DNA'da, hedeflenen ilgi bölgelerindeki CPG metilasyonunun nasıl nicelendirileceği konusunda iyi bir anlayış kazanmış olacaksınız.