DNA Metilasyon Analizi nesil Dizilimine tarafından hedef

Bu prosedürün genel amacı, ilgilenilen doku veya hücrelerden izole edilen genomik DNA'dan hedeflenen ilgi bölgelerinde CPG metilasyonunu ölçmektir. Bu, ilk olarak, bi sülfite dönüştürülmüş genomik DNA'dan ilgilenilen bölgeleri çoğaltmak için sülfite özgü PCR primerleri ile tasarlanarak gerçekleştirilir. İkinci adımda, bisülfite dönüştürülen ilgilenilen bölge büyütülür ve amplikon eksilerinden yeni nesil dizileme veya NGS kütüphaneleri oluşturulur.

Ardından, kitaplıklar sıralanır ve analiz için FASTQ dosyaları oluşturulur. Son adımda, sıralama okumaları, bi sülfit dönüştürülmüş referans hedef dizisine hizalanır ve yüzde beş mc, nihai olarak sülfit amplikon dizilimi ile hesaplanır veya herhangi bir model organizmadan ilgilenilen herhangi bir bölgede CPG metilasyonunu kesin ve doğru bir şekilde ölçmek için BS a s gerçekleştirilebilir. Bu tekniğin Sanger dizileme gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, BS AS'nin hızlı ve yüksek verimli bir şekilde doğru ve hassas CPG metilasyon kantitasyonu sağlaması ve çok sayıda numunede birden fazla bölgeyi test etme fırsatı sağlamasıdır.

Hedefi belirledikten ve astarı tasarladıktan sonra, tek bir amplikonun hedef amplifikasyon optimizasyonu için reaksiyonu birleştirin ve ardından amplikonları sayfa elektroforezi ile görselleştirmek için ısıyla kapatılmış bir PCR plakasını kapatın. Daha sonra, uygun kuyucukları 30 mikrolitre PCR reaksiyonu veya merdiven ile yükleyin ve ardından jeli yaklaşık 45 dakika boyunca 200 voltta çalıştırın. İlk boya jelin sonuna ulaştığında, reaksiyonu durdurun ve ardından tüm jeli mililitre taze hazırlanmış AUM bromür başına beş mikrogram ile kaplayın.

Beş dakika sonra, jeli 482 nanometrelik bir uyarma dalga boyunda bir UV translüminatörü aracılığıyla görüntüleyin. Reaksiyonun özgüllüğünü belirlemek için PCR AMPLİKONLARINI boyutlandırmak için merdiveni kullanın. Algılanan kitaplık tepe noktalarının ortalama boyutunu ve molarite tahminini belirlemek için beklenen amplikon boyutu dışında birden fazla bant arayın.

Ardından, kitaplıkları, üreticinin talimatlarına göre yüksek hassasiyetli bir DNA tahlili ile bir kılcal elektroforez DNA boyutlandırma çipi üzerinde çalıştırın. Kütüphaneleri QPCR ile ölçmek için. Üreticinin talimatlarına göre mutlak niceleme ayarlarını kullanarak, gerçek zamanlı bir cihaz üzerinde bilinen bir konsantrasyona sahip, oluşturulan kitaplıklardaki adaptör dizilerine ve standartlara göre tasarlanmış primerleri kullanın.

Ardından, kitaplıkların molar konsantrasyonlarını hesaplamak için kitaplıkların boyutunu ve QPCR'den gelen molar nicelemeyi kullanın. Sıralamadan sonra, sıkıştırılmış hızlı Q dosyalarını uygun sıralama analizi ardışık düzenine aktarın, içeri aktar'ı seçin ve ardından okuma kırpma uygulamaları için Q puanlarını korumak üzere okumaları oluşturmak için kullanılan sıralama yöntemini seçin. Uygun sıkıştırılmış hızlı Q okuma dosyalarını içe aktarın ve ardından genel seçenekler altında kalite puanlarını atma seçimini kaldırın.

İçe aktarılan okumalar için bir konum seçin ve bitir'e tıklayın. Ardından NGS çekirdek araçları altında kırpma dizilerini seçin. Kırpılacak okumaları vurgulayın, yalnızca Q 30 puanına eşit veya daha büyük içeren okumaları koruyun.

Ardından kalite puanlarını kullanarak kırpmayı seçin ve sınırı 0,001 olarak ayarlayın. Yalnızca bir belirsiz nükleotidden daha az veya ona eşit olan sazları seçmek için. Belirsiz nükleotidleri seçin, kırpın ve maksimum belirsizlik sayısını bir olarak ayarlayın.

Ardından, kırpılmış okumaları kaydetmek için bir konum seçin ve kırpılmış çözünürlüğü in silico by sülfit dönüştürülmüş gen referansıyla eşlemek için bitir'e tıklayın. NGS temel araçları altında harita okumaları'nı seçin. Başvurmak için, eşlenecek kırpılmış okumaları seçin ve ileri'ye tıklayın.

Ardından referans maskeleme altında, dönüştürülen referans sırasını seçin ve maskeleme yok'u seçin. İleri'yi tıklatın ve ardından uyuşmazlıklar, eklemeler ve silmeler için üç puan atayın. Referansa minimum okuma uzunluğu haritası kesri için bir puan atayın ve harita, okuma ve referans arasındaki minimum özdeşlik kesri için 0,9 puan atayın Spesifik olmayan eşleşme işleme altında, seçin, yok sayın ve çıktı seçenekleri altında İleri'ye tıklayın.

Ardından Tek başına okuma eşlemeleri oluştur'u seçin. Ardından, sonuç işleme altında Kaydet'i tıklayın. Okuma eşlemesini kaydetmek için bir konum seçin ve eşlenen okumalarda varyant çağrısını çalıştırmak için bitir'e tıklayın.

Yeniden sıralama analizi altında, düşük frekanslı varyant algılamasını seçin ve analiz edilecek okuma eşlemesini seçin. İleri'ye tıklayın ve ardından düşük frekans varyantı parametresi altına %0,01 girin ve ileri'ye tıklayın. Genel filtreler altında, dizinin 1000 x'e eşit veya daha büyük bir derinlikte olduğundan emin olmak için minimum kapsamı 1000 olarak ayarlayın.

Son olarak, ileri'ye tıklayın ve ardından çıktı seçenekleri altında açıklamalı tablo oluştur'u seçin ve varyant tablo dosyasını kaydetmek için bir konum seçin, bitir'e tıklayın ve CG bağlamında bir referans sitozindeki sitozin metilasyonunun frekansını hesaplamak için varyant tablo dosyasından ilgili bölgedeki açıklamalı CPG sitelerindeki varyant frekanslarını kullanın, dönüştürülen referans dizisine uygun şekilde hizalanmış okumalar, gösterilenlere benzer olacaktır şekilde. CPG dinükleotidleri net bir şekilde tanımlanabilir ve metilasyon durumları, CPG bölgelerindeki baz çağrıları gözlemlenerek tahmin edilebilir. Eşlenmiş okumalarda, %0 metilasyon, CPG bölgelerine eşlenmiş timin içeren eşlenmiş okumalarla sonuçlanacaktır.

%100 metilasyon kontrolleri, CPG bölgelerine eşlenmiş sitozinleri içeren eşlenmiş okumalarla sonuçlanacaktır. Bu deneyde, RNA ve DNA bir fare, beyincik ve retinadan birlikte izole edildi. Retina dokusunda seçici olarak eksprese edilen opsin ekspresyonu daha sonra beklendiği gibi QPCR kullanılarak ölçüldü.

Opsin RNA, Opsin promotör bölgesindeki CPG metilasyon seviyelerinin bi sülfit amplifikasyon dizilemesi ile ölçülmesinden sonra sadece retinada tespit edildi. Bununla birlikte, promotör bölgedeki kümülatif metilasyon seviyeleri, retinada %15'ten az iken beyincikte %80'den fazlaydı. B SAS metilasyon kantitasyonu, herhangi bir genomik bölgede metilasyon seviyelerinin CPG'ye özgü bir temelde karşılaştırılmasına izin vererek, bölgeye özgü metilasyon kantitasyonundan yararlanır.

Gerçekten de, bu deneyde, opsin promotörü boyunca CPG metilasyon seviyelerinin, retina örnekleriyle karşılaştırıldığında, serebellar örneklerde önemli ölçüde daha yüksek olduğu bulunmuştur. Bu videoyu izledikten sonra, dokulardan veya hücrelerden izole edilen genomik DNA'dan hedeflenen ilgi bölgelerinde CPG metilasyonunun nasıl ölçüleceğini iyi anlamış olmalısınız.