Klinik Uygulamalar İçin İnsan İdrarında 3-Nitrotirosinin Minyatür Katı Faz Çıkarma ve LC-MS / MS Algılamasının Entegrasyonu

LC-MS/MS ile kombine edilmiş bu minyatürize katı faz ekstraksiyonu analizinin genel amacı, klinik uygulamalar için insan idrarındaki serbest 3-nitrotirosini doğru bir şekilde nicelleştirmektir. Serbest 3-nitrotirosin, oksidatif stres için bir biyobelirteç görevi görür. Bununla birlikte; yetersiz hassasiyet, seçicilik ve zahmetli numune hazırlama işlemleri nedeniyle, klinik uygulamalar için biyolojik örneklerde 3-nitrotirosini doğru şekilde nicelleştirmek özel bir zorluk teşkil etmeye devam etmektedir.

Oldukça hassas bir LC-MS/MS etkileşiminde etkili bir katı faz ekstraksiyonunu içeren bu teknik, konfigürasyon ve iki boyutlu LC ihtiyacı duymadan, insan idrarındaki düşük seviyeli endojen 3-nitrotyrosin miktarının hızlı, spesifik ve doğru bir şekilde belirlenmesine olanak tanır. Bu yöntem oksidatif stres araştırmaları hakkında bilgi sağlayabilse de, kompleks enflamatuar ve nörodejeneratif bozukluklar gibi diğer patolojik durumlar için de uygulanabilir. Antioksidanlar 3-nitrotyrosin seviyesini düşürebildiği için, bu tekniğin etkileri antioksidan tedavinin etkinliğinin izlenmesine doğru genişletilebilir. Bu prosedüre başlamak için, önceden hazırlanmış ve çözülmüş idrar örneklerini, standartları ve QC örneklerini vorteksleyin.

Vortekslemeden sonra, her bir numuneden ve standarttan 250 µL'yi temiz, iki mililitrelik bir 96 kuyucuklu toplama plakasının 32 kuyucuğuna ekleyin. Çift kör numune kuyucuğu hariç her bir kuyucuğa, önceden hazırlanmış internal standart çalışma çözeltisinden 50 µL ekleyin. Ardından, çift kör numune kuyucuğuna %0,01 formik asit içeren LC-MS kalitesinde 50 µL su ekleyin.

Bunu takiben, kuyucuklara %0,1 formik asit içeren 250 µL LC-MS sınıfı su ekleyin. Ardından, çözeltileri sekiz kanallı bir pipetle üç kez karıştırın ve SPE yüklemesine kadar plakayı kapatın. Sonrasında, karışık modlu katyon değişimli 96 kuyucuklu ekstraksiyon mikroplakasını ve bir toplama haznesini pozitif basınçlı bir işlemciye yerleştirin.

Karma modlu katyon değişim mikroplakası kullanılarak yapılan katı faz ekstraksiyonu, tek bir ekstraksiyonda 3-nitrotyrosinin eş zamanlı numune temizlenmesine ve zenginleştirilmesine olanak tanır. Sorbent üzerinden 200 µL LC-MS grade metanol akıtarak ekstraksiyon plağını koşullayın. Karışımın sorbent üzerinden yavaşça akmasını sağlamak için pozitif basınç işlemcisindeki basınç ayar düğmesini çevirerek düşük bir pozitif basınç ayarlayın ve gerekirse basıncı düzenleyin.

Sorbent üzerinden %2 formik asit içeren 200 µL LC-MS sınıfı su akıtarak dengeleme yapın. Sekiz kanallı bir pipet kullanarak, önceden karıştırılmış her bir örneğin tüm hacmini ön koşullandırılmış ekstraksiyon plakasına dikkatlice yükleyin. Karışımın sorbent üzerinden yavaşça akmasını sağlamak için pozitif basınç işlemcisinde düşük pozitif basınç ayarlayın ve basıncı gerektiği şekilde düzenleyin.

Bunun ardından, sorbent üzerinden 200 µL %2 formik asit içeren LC-MS grade su akıtarak kuyucukları yıkayın. 200 µL metanol ve su ile yıkama işleminden sonra, kuyucukları kurutmak için pozitif basınç işlemcisini yüksek basınca ayarlayın. Kuyucuklar kuruduğunda, rezervuarı temiz iki mL'lik bir 96 kuyucuklu toplama plakasıyla değiştirin.

Şimdi, ekstraksiyon plakasında tutulan analiti ve iç standardı yavaşça elüe etmek için 50 µL 25 mM amonyum asetat çözeltisi uygulayın. Ardından, elüenti nötralize etmek için %5 formik asit içeren 50 µL LC-MS grade su ekleyin. 3-nitrotirozin elüsyonu için hafif bir amonyum asetat çözeltisinin uygulanması, seçicilikte ve hassasiyette önemli bir artış sağlar.

Sıvı kromatografisi tandem kütle spektrometrisi analizine hazırlık amacıyla, örnekleri sekiz kanallı bir pipetle üç kez karıştırın. LC-MS/MS cihazı kurulduktan sonra, 3-nitrotirozin LC-MS/MS yöntemini LC gradyan elüasyonu ile 10 dakika boyunca dengeleyin. Yöntem dengelendiğinde, LC gradyanı başlangıç gradyan elüasyonuna stabilize olacaktır.

Otomatik örnekleyici sıcaklığı 4 °C'ye ve fırın sıcaklığı 30 °C'ye ayarlanacaktır. İdrar örneklerini, standartları ve QC örneklerini içeren bir seri listesi oluşturun. Ardından, hazırlanan örnekleri enjekte ederek seriyi başlatın.

Tüm enjeksiyonlar tamamlandıktan sonra, 3-nitrotirozin ve iç standart pik alan oranının nominal 3-nitrotirozin konsantrasyonuna karşı doğrusal regresyonu ile 3-nitrotirozin tayini için mL başına 10 ila 2.500 pikogram aralığında bir standart eğri oluşturun. Son olarak, oluşturulan standart eğriyi kullanarak diğer tüm örnekleri nicelleştirin ve QC örneklerinin belirlenen aralıkta olup olmadığını tespit edin. İnsan idrar örneklerinin LC verileri, optimize edilmiş koşullar altında 3-nitrotirozinin yapısal olarak benzer diğer tirozin analoglarından kromatografik olarak ayrıldığını göstermektedir; bu durum, söz konusu aşırı miktardaki bileşiklerden kaynaklanan eş-elüsyon girişimlerini ortadan kaldırır ve sonuç olarak analiz selektivite derecesini artırır.

Çift kör numunenin çoklu reaksiyon izleme kromatogramında 3-nitrotyrosine sinyali gözlenmemiştir; bu durum, tüm süreç boyunca 3-nitrotyrosine oluşmadığını göstermektedir. Sağlıklı bir birey için 3-nitrotyrosine ve iç standardın temsilci çoklu reaksiyon izleme kromatogramları burada gösterilmiştir. 3-nitrotyrosine ve iç standardın alıkonma sürelerinde herhangi bir girişimci sinyal gözlenmemiştir.

Temsili bir standart eğri burada gösterilmiştir. Sinyal-gürültü oranı üçten büyük olan en düşük konsantrasyon olarak tanımlanan tespit sınırı, mililitre başına iki pikogram olarak belirlenmiştir. Alt kantifikasyon sınırı mililitre başına 10 pikogram olarak belirlenmiş olup, 10'dan büyük bir sinyal-gürültü oranı ile %20'lik kesinlik ve doğruluk aralığındaki en düşük konsantrasyon olarak tanımlanmıştır.

Hassas ayarlı entegrasyon analizi; azaltılmış matris etkisi, daha az sorbent kullanımı ve atık bertarafı ile birlikte anlamlı düzeyde artırılmış özgünlük, hassasiyet ve işlem kapasitesi sunar. Bu basit ve hızlı analiz ile idrar örnekleri 24 saat içinde işlenebilir. İdrar örneklemesinin non-invaziv ve düşük maliyetli olduğunu göz önünde bulundurunuz.

Bu önemli ölçüde geliştirilmiş yöntem, preklinik ve klinik çalışmalarda 3-nitrotyrosinin oksidatif stres biyobelirteci olarak rolünü değerlendirmek için oldukça uygundur.