Klinik Uygulamalar İçin İnsan İdrarında 3-Nitrotirosinin Minyatür Katı Faz Çıkarma ve LC-MS / MS Algılamasının Entegrasyonu

Karma mod katyon değiştirme (MCX) 96-kuyulu bir mikroplak üzerinde verimli bir katı faz ekstraksiyonu ile birleşmiş seçici ve duyarlı bir sıvı kromatografi tandem kütle spektrometresi (LC-MS / MS) yöntemi, serbest 3-nitrotirosin 3-NT) insan idrarında yüksek verimle, klinik uygulamalar için uygundur.

LC-MS/MS testi ile birleştirilen bu minyatür katı faz ekstraksiyonunun genel amacı, klinik uygulamalar için insan idrarındaki serbest 3-nitrotirozini doğru bir şekilde ölçmektir. Serbest 3-nitrotirozin, verime yardımcı olur ve oksidatif stres için bir biyobelirteçtir. Bununla birlikte, yetersiz duyarlılık, seçicilik ve hantal numune hazırlıkları nedeniyle klinik uygulamalar için biyolojik acil durumlarda 3-nitrotirozinin doğru bir şekilde ölçülmesi özel bir zorluk olmaya devam edecektir.

Son derece hassas bir LC-MS/MS etkileşiminde etkili bir katı faz ekstraksiyonu içeren bu teknik, insan idrarındaki düşük endojen 3-nitrotirozin seviyelerinin anayasa ve iki boyutlu LC'ye ihtiyaç duymadan hızlı, spesifik ve doğru bir şekilde belirlenmesini sağlar. Bu tekniğin etkileri, antioksidan tedavisinin etkinliğinin izlenmesine doğru genişletilebilir, çünkü 3-nitrotirozin seviyesi antioksidanlar tarafından azaltılabilir. Bu prosedüre başlamak için, önceden hazırlanmış ve çözülmüş idrar örneklerini, standartları ve QC örneklerini girdaplayın.

Girdaplamadan sonra, her numuneden 250 mikrolitre ekleyin ve iki mililitrelik 96 oyuklu temiz bir toplama plakasının 32 kuyusuna standart olarak ekleyin. Çift boş numune kuyucuğu hariç her bir oyuğa 50 mikrolitre önceden hazırlanmış dahili standart çalışma solüsyonu ekleyin. Daha sonra çift boş numune kuyucuğuna% 0.01 formik asit içeren 50 mikrolitre LC-MS sınıfı su ekleyin.

Bunu takiben, kuyucuklara %0.1 formik asit içeren 250 mikrolitre LC-MS sınıfı su ilave edilir. Daha sonra çözeltileri sekiz kanallı bir pipetle üç kez karıştırın ve SPE yüklenene kadar plakayı kapatın. Ardından, pozitif basınçlı bir işlemci üzerine karışık modlu bir katyon değişimi 96 oyuklu ekstraksiyon mikroplakası ve bir toplama rezervuarı yerleştirin.

Karışık modlu bir katyon değişim mikroplakası kullanan katı faz ekstraksiyonu, tek bir ekstraksiyonda aynı anda numune temizlemeyi ve 3-nitrotirozinin zenginleştirilmesini sağlar. Sorbentten 200 mikrolitre LC-MS dereceli metanol akıtarak ekstraksiyon plakasını koşullandırın. Karışımın sorbentten yavaşça akmasına izin vermek için düşük bir pozitif basınç ayarlamak için pozitif basınç işlemcisindeki basınç ayar düğmesini çevirin ve gerekirse basıncı ayarlayın.

Sorbentten %2 formik asit içeren 200 mikrolitre LC-MS dereceli su akıtarak dengeleyin. Sekiz kanallı bir pipet kullanarak, önceden karıştırılmış numunelerin her birinin tüm hacmini önceden koşullandırılmış ekstraksiyon plakasına dikkatlice yükleyin. Karışımın sorbentten yavaşça akmasını sağlamak için pozitif basınç işlemcisine düşük pozitif basınç ayarlayın ve basıncı gerektiği gibi ayarlayın.

Bunu takiben, sorbentten 200 mikrolitre LC-MS dereceli su ile% 2 formik asit akıtarak kuyuları yıkayın. 200 mikrolitre metanol ve su ile yıkadıktan sonra, kuyuları kurutmak için pozitif basınçlı işlemciyi yüksek basınca ayarlayın. Kuyular kuruduktan sonra, rezervuarı iki mililitrelik 96 oyuklu temiz bir toplama plakası ile değiştirin.

Şimdi, tutulan analiti ve iç standardı ekstraksiyon plakasından yavaşça çıkarmak için 50 milimolar amonyum asetat çözeltisinden 25 mikrolitre uygulayın. Daha sonra eluenti nötralize etmek için %5 formik asit ile 50 mikrolitre LC-MS dereceli su ekleyin. 3-nitrotirozinin elüsyonu için hafif bir amonyum asetat çözeltisinin uygulanması, önemli ölçüde gelişmiş seçicilik ve hassasiyet sağlar.

Sıvı kromatografisi tandem kütle spektrometresi analizine hazırlık olarak numuneleri sekiz kanallı bir pipetle üç kez karıştırın. LC-MS/MS cihazını kurduktan sonra, 3-nitrotirozin LC-MS/MS yöntemini LC gradyan elüsyonu ile 10 dakika dengeleyin. Yöntemin dengelenmesiyle, LC gradyanı ilk gradyan elüsyonuna dengelenecektir.

Otomatik örnekleyici sıcaklığı dört santigrat dereceye ve fırın sıcaklığı 30 santigrat dereceye ayarlanacaktır. İdrar örneklerini, standartları ve kalite kontrol örneklerini içeren bir toplu iş listesi oluşturun. Ardından hazırlanan numuneleri enjekte ederek partiyi başlatın.

Tüm enjeksiyonları tamamladıktan sonra, nominal 3-nitrotirozin konsantrasyonuna karşı 3-nitrotirozin ve dahili standardın tepe alan oranının doğrusal regresyonu ile 3-nitrotirozin kantitasyonu için mililitre başına 10 ila 2.500 pikogram aralığında standart bir eğri oluşturun. Son olarak, belirlenen standart eğriyi kullanarak diğer tüm numuneleri ölçün ve QC numunelerinin belirlenen aralık içinde olup olmadığını belirleyin. İnsan idrar örneklerinden elde edilen LC verileri, 3-nitrotirozinin, optimize edilmiş koşul altında diğer yapısal olarak benzer tirozin analoglarından kromatografik olarak ayrıldığını göstermektedir, bu da bu çok aşırı bileşiklere bağlı ko-elüsyon girişimlerini ortadan kaldırır ve sonuç olarak tahlil seçiciliğinin derecesini arttırır.

Çift boş numunenin çoklu reaksiyon izleme kromatogramında bir 3-nitrotirozin sinyali gözlenmez, bu da tüm işlem boyunca 3-nitrotirozinin oluşmadığını gösterir. 3-nitrotirozinin temsili çoklu reaksiyon izleme kromatogramları ve sağlıklı bir birey için dahili standart burada gösterilmektedir. 3-nitrotirozin ve iç standardın alıkonma sürelerinde herhangi bir parazit sinyali gözlenmedi.

Burada temsili bir standart eğri gösterilmektedir. Üçten büyük bir sinyal-gürültü oranına sahip en düşük konsantrasyon olarak tanımlanan algılama sınırı, mililitre başına iki pikogram olarak belirlendi. Kantitasyonun alt sınırı mililitre başına 10 pikogram olarak belirlendi ve 10'dan büyük bir sinyal-gürültü oranı ile %20'lik belirsizlik ve doğruluk içindeki en düşük konsantrasyon olarak tanımlandı.

İnce ayarlı entegrasyon testi, azaltılmış matris etkisi, sorbent kullanımı ve atık bertarafı ile önemli ölçüde geliştirilmiş özgüllük, hassasiyet ve verim sağlar. Bu basit ve hızlı tahlil ile idrar örneği 24 saat içinde işlenebilir. Non-invaziv ve ucuz idrar örneklemesini dikkate alın.

Bu dikkate değer ölçüde geliştirilmiş yöntem, klinik öncesi ve klinik çalışmalarda oksidatif stres biyobelirteç olarak 3-nitrotirozinin rolünü değerlendirmek için çok uygundur.