Name: Klinik Uygulamalar İçin İnsan İdrarında 3-Nitrotirosinin Minyatür Katı Faz Çıkarma ve LC-MS / MS Algılamasının Entegrasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Öğrenin, minyatür katı faz çıkarma ve LC-MS/MS kullanarak insan idrarında 3-nitrotirosini klinik uygulamalar için hassas bir şekilde nasıl ölçebilirsiniz. Bu yöntem oksidatif stres araştırmalarında yüksek duyarlılık sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar Scott Howard ve Abigail Marinack&#39;ın bu çalışmanın genel destek ve koordinasyonu için onaylarlar.

İnsan idrar örneklerini içeren tüm çalışmalar, Pharmasan / Neuroscience Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) tarafından onaylanan prosedüre uyularak gerçekleştirildi. 1. İdrar Numunesi Toplama ve Kreatinin (Cr) Tayini <ol><li> Yaklaşık 5 mL sonra ertesi sabah idrar örnekleri toplayın. Koruyucu olarak 250 μL 3 N HC1 içeren 5 mL&#39;lik bir taşıma tüpünde gece boyunca 10 saat boyunca aç bırakın ve kullanıma kadar -20 ° C&#39;de saklayın. </li><li> Çözünür ve vorteks 5 mL nakliye idrarını Bir santrifüjde bir tüp ve santrifüj ( örn. Sorvall) (2297 xg, 10 dakika). </li><li> 5 mL nakliye borusundan iki kez 1 mL idrar ekleyin. </li><li> Bir idrar kreatin yöntemi ile Cr&#39;yi belirleyin 26 . </li></ol> 2. Standart, IS ve Kalite Kontrol (QC) Örneklerinin Hazırlanması <ol><li> % 0.01 HCOOH mobil faz A (MA) ile 100 μg / mL&#39;de 3-NT stok solüsyonu hazırlayın ve -20 ° C&#39;de saklayın. </li><li> YapmakMA ile 100 ug / mL 3-NT stok solüsyonu seyreltilerek 100 ng / mL konsantrasyonda bir 3-NT çalışma standart solüsyonu. </li><li> 100 ng / mL çalışma standardının, boşluklu ve çift boş örnekler ile birlikte 3-NT içermeyen 0,15 M HC1 ile asitlendirilmiş boş idrarla seyreltilmesi ile 5 ila 2500 pg / mL arasında değişen standartları oluşturun. </li><li> MA ile suda 100 μg / mL&#39;de IS 13 C 9 -3-NT stok solüsyonu hazırlayın ve -20 ° C&#39;de saklayın. </li><li> 100 ug / ml 13 ° C 9-3-NT seyreltilmesi ile 500 pg / ml bir çalışma IS çözeltisi yapmak MA stok çözeltisi IS. </li><li> Asitli boş idrarda 3-NT çalışma standardının seyreltilmesi ile LLOQ, düşük, orta ve yüksek seviyeleri ( yani , 10, 25, 100, 500 ve 1,250 pg / mL) kapsayan beş kalite QC örneği oluşturun. </li></ol> 3. Katı Faz Çıkarma Prosedürü <ol><li> Çözünme ve girdaplı idrar örnekleri, standartlar ve QC örnekleri. </li><li> İdrar numuneleri, standartlar ve QC sampayı ekleyinLes (her biri 250 uL) ile temiz 2 mL&#39;lik 96 gözlü toplama plakasının 32 oyuğuna eklendi. </li><li> Çifte boş numune hariç her göze 500 pg / mL IS çalışma solüsyonu (50 μL) ekleyin. Çifte boş örnek kuyusuna% 0.01 HCOOH (50 uL) ilave edin. </li><li> % 0.1 HCOOH (250 uL) ile LC-MS / MS suyu ekleyin. </li><li> Yukarıdaki karışımı üç kez 8 kanallı bir pipetle karıştırın. </li><li> SPE yükleninceye kadar plakayı örtün. </li><li> Bir pozitif basınç işlemcisine bir MCX 96 gözlü çıkarma plakası ve toplama haznesi yerleştirin. </li><li> Emme plakasını sorbent boyunca MeOH (200 uL) akan ile şartlandırın. </li><li> Sorbent boyunca% 2 HCOOH (200 uL) su akıtılarak dengeye getirilir. </li><li> Önceden karıştırılmış örneklerin her birinin hacmini, 8 kanallı bir pipetle dikkatlice önceden şartlandırılmış ekstraksiyon plakasına yükleyin. </li><li> Pozitif basınçlı işlemci üzerinde düşük pozitif basıncı ( örneğin 3 psi) ayarlayarak karışımın thrSorbent yavaşça, gerekirse basıncı ayarlayın. </li><li> Sorguyu kullanarak% 2 HCOOH (200 μL) su akıtılarak oyukları yıkayın. </li><li> Sorguyu kullanarak metanol (200 μL) akıtılarak kuyuları yıkayın. </li><li> Sorguyu akan su (200 μL) ile oyukları yıkayın. </li><li> Pozitif basınçlı işlemcide kuyuları tamamen yüksek pozitif basınç ayarı ( örn. , 40 psi) ile kurutun. </li><li> Hazneyi temiz bir 2 mL&#39;lik 96 gözlü toplama plakası ile değiştirin. </li><li> Muhafaza analiti çıkarmak için arta pH 9 (50 uL) 25 mM NH4 OAc uygulayın ve ekstraksiyon plakadan IS. </li><li> Eluatın nötralize edilmesi için LC-MS suyunu% 5 HCOOH (50 uL) ile pipetleyin. </li><li> 8 kanallı pipetle üç kez karıştırın ve analiz için LC-MS / MS istasyonuna gönderin. </li></ol> 4. LC-MS / MS Analizi <ol><li> Dereceli silindirle 2.000 mL LC-MS suyunu doğru olarak ölçün ve 2 L&#39;lik bir şişeye aktarın. </li><li> PIpette 200 uL saf HCOOH, LC-MS su içeren yukarıdaki şişeye yerleştirilir. </li><li> Harman hallaç iyice karıştırın ve mobil faz A (MA) olarak etiketleyin. Baş harflerini, hazırlanma tarihini ve son kullanma tarihini ekleyin. </li><li> LC-MS metanolden 2 L şişe alın ve başlangıç ​​ve son kullanma tarihleri ​​olan mobil faz B (MB) olarak etiketleyin. </li><li> Otomatik örnekleyicinin sıcaklığını 4 ° C&#39;ye ayarlayın. </li><li> Hazırlanan örneklerle birlikte toplama plakasını otomatik örnekleyiciye yerleştirin. </li><li> Fırında bir PFP sütunu (150 mm x 2.1 mm id, 3 μm) ve koruma sütunu yerleştirin. </li><li> Fırın sıcaklığını 30 ° C&#39;ye ayarlayın. </li><li> Tablo 1&#39;de gösterildiği gibi LC gradyanı elüsyonu ile edinme metodu kullanılarak 10 dakika dengelenir. </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Zaman (dak) </td><td> modül </td><td> Olaylar </td><td> Parametre </td></tr><tr><td> 0 </td><td> Pompalar </td><td> Pompa B Kons. </td><td> 5 </td></tr><tr><td> 0.5 </td><td> Pompalar </td><td> Pompa B Kons. </td><td> 20 </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Pompalar </td><td> Pompa B Kons. </td><td> 50 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> Pompalar </td><td> Pompa B Kons. </td><td> 80 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> Pompalar </td><td> Pompa B Kons. </td><td> 90 </td></tr><tr><td> 4.01 </td><td> Pompalar </td><td> Pompa B Kons. </td><td> 95 </td></tr><tr><td> 5.5 </td><td> Pompalar </td><td> Pompa B Kons. </td><td> 95 </td></tr><tr><td> 5.6 </td><td> Pompalar </td><td> Pompa B Kons. </td><td> 5 </td></tr><tr><td> 7 </td><td> kontrolör </td><td> Dur </td><td></td></tr></tbody></table> Tablo 1: Sıvı Kromatografi Gradyan Elüsyon Koşulları <ol start="10"><li> Dahil olmak üzere bir toplu iş listesi oluşturunStandartlar, QC ve idrar örnekleri. </li><li> Hazırlanan örneklerin (12 μL) enjekte edilmesi ile partiye başlayın. </li></ol> 5. Tepe Tanımlama, Entegrasyon ve Veri İşlemi <ol><li> Yazılımı kullanarak veri toplama ve işleme kontrol edin. </li><li> Tüm numuneler için 3-NT ve IS zirveleri tanımlayın ve entegre edin. </li><li> 3-NT niceliklemesi için 10-2,500 pg / mL aralığında standart bir eğri oluşturun ve 1 / x ağırlık faktörü ile nominal 3-NT konsantrasyonuna karşı 3-NT ve IS&#39;nin zirve alanı oranının doğrusal gerilemesi ile tayin edin. </li><li> Standart eğriyi kullanarak tüm numuneleri ölçün. </li><li> QC örneklerinin belirlenen aralıkta olup olmadığını belirleyin. </li><li> Tespit edilen idrardaki konsantrasyonları nM veya nmol / mmol Cr biriminde nihai sonuçlara dönüştürün. </li></ol>

<ol><li>Dalle-Donne, I., Rossi, R., Colombo, R., Giustarini, D., Milzani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomarkers+of+oxidative+damage+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">Biomarkers of oxidative damage in human disease.</a> Clin. Chem. 52 (4), 601-623 (2006).</li>
<li>Pacher, P., Beckman, J. S., Liaudet, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+and+peroxynitrite+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide and peroxynitrite in health and disease.</a> Physiol. Rev. 87 (1), 315-424 (2007).</li>
<li>Baraldi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-Nitrotyrosine%2C+a+marker+of+nitrosative+stress%2C+is+increased+in+breath+condensate+of+allergic+asthmatic+children%5BTitle%5D)+AND+%22Allergy%22%5BJournal%5D)">3-Nitrotyrosine, a marker of nitrosative stress, is increased in breath condensate of allergic asthmatic children.</a> Allergy. 61 (1), 90-96 (2006).</li>
<li>Ischiropoulos, H., Beckman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+and+nitration+in+neurodegeneration%3A+Cause%2C+effect%2C+or+association%3F%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress and nitration in neurodegeneration: Cause, effect, or association?</a> J. Clin. Invest. 111 (2), 163-169 (2003).</li>
<li>Butterfield, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+levels+of+3-nitrotyrosine+in+brain+from+subjects+with+amnestic+mild+cognitive+impairment%3A+implications+for+the+role+of+nitration+in+the+progression+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Elevated levels of 3-nitrotyrosine in brain from subjects with amnestic mild cognitive impairment: implications for the role of nitration in the progression of Alzheimer's disease.</a> Brain Res. 1148, 243-248 (2007).</li>
<li>Hui, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+robust+LC-MS%2FMS+method+for+quantification+of+free+3-nitrotyrosine+in+human+plasma+from+patients+receiving+on-pump+CABG+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">A simple and robust LC-MS/MS method for quantification of free 3-nitrotyrosine in human plasma from patients receiving on-pump CABG surgery.</a> Electrophoresis. 33 (4), 697-704 (2012).</li>
<li>Kato, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+modified+tyrosines+in+healthy+and+diabetic+human+urine+using+liquid+chromatography%2Ftandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Biochem.+Nutr%22%5BJournal%5D)">Quantification of modified tyrosines in healthy and diabetic human urine using liquid chromatography/tandem mass spectrometry.</a> J. Clin. Biochem. Nutr. 44 (1), 67-78 (2009).</li>
<li>Duncan, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+approaches+to+the+analysis+of+3-nitrotyrosine%5BTitle%5D)+AND+%22Amino+acids%22%5BJournal%5D)">A review of approaches to the analysis of 3-nitrotyrosine.</a> Amino acids. 25 (3-4), 351-361 (2003).</li>
<li>Ryberg, H., Caidahl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatographic+and+mass+spectrometric+methods+for+quantitative+determination+of+3-nitrotyrosine+in+biological+samples+and+their+application+to+human+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+B%22%5BJournal%5D)">Chromatographic and mass spectrometric methods for quantitative determination of 3-nitrotyrosine in biological samples and their application to human samples.</a> J. Chromatogr. B. 851 (1-2), 160-171 (2007).</li>
<li>Tsikas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+methods+for+3-nitrotyrosine+quantification+in+biological+samples%3A+the+unique+role+of+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Amino+acids%22%5BJournal%5D)">Analytical methods for 3-nitrotyrosine quantification in biological samples: the unique role of tandem mass spectrometry.</a> Amino acids. 42 (1), 45-63 (2012).</li>
<li>Tsikas, D., Duncan, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+and+3-nitrotyrosine%3A+strategies%2C+controversies%2C+and+our+current+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom.+Rev%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry and 3-nitrotyrosine: strategies, controversies, and our current perspective.</a> Mass Spectrom. Rev. 33 (4), 237-276 (2014).</li>
<li>Iwasaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+fluorescence+reagents+for+simultaneous+determination+of+hydroxylated+phenylalanine+and+nitrated+tyrosine+by+high-performance+liquid+chromatography+with+fluorescence+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Chromatogr%22%5BJournal%5D)">Comparison of fluorescence reagents for simultaneous determination of hydroxylated phenylalanine and nitrated tyrosine by high-performance liquid chromatography with fluorescence detection.</a> Biomed. Chromatogr. 26 (1), 41-50 (2012).</li>
<li>Saravanabhavan, G., Blais, E., Vincent, R., Kumarathasan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+performance+liquid+chromatography-electrochemical+array+method+for+the+measurement+of+oxidative%2Fnitrative+changes+in+human+urine%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">A high performance liquid chromatography-electrochemical array method for the measurement of oxidative/nitrative changes in human urine.</a> J. Chromatogr. A. 1217 (19), 3269-3274 (2010).</li>
<li>Mergola, L., Scorrano, S., Del Sole,, Lazzoi, R., R, M., Vasapollo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developments+in+the+synthesis+of+a+water+compatible+molecularly+imprinted+polymer+as+artificial+receptor+for+detection+of+3-nitro-L-tyrosine+in+neurological+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Developments in the synthesis of a water compatible molecularly imprinted polymer as artificial receptor for detection of 3-nitro-L-tyrosine in neurological diseases.</a> Biosens. Bioelectron. 40 (1), 336-341 (2013).</li>
<li>Schwedhelm, E., Tsikas, D., Gutzki, F. M., Frolich, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gas+chromatographic-tandem+mass+spectrometric+quantification+of+free+3-nitrotyrosine+in+human+plasma+at+the+basal+state%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Gas chromatographic-tandem mass spectrometric quantification of free 3-nitrotyrosine in human plasma at the basal state.</a> Anal. Biochem. 276 (2), 195-203 (1999).</li>
<li>Tsikas, D., Mitschke, A., Suchy, M. T., Gutzki, F. M., Stichtenoth, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+3-nitrotyrosine+in+human+urine+at+the+basal+state+by+gas+chromatography-tandem+mass+spectrometry+and+evaluation+of+the+excretion+after+oral+intake%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+B%22%5BJournal%5D)">Determination of 3-nitrotyrosine in human urine at the basal state by gas chromatography-tandem mass spectrometry and evaluation of the excretion after oral intake.</a> J. Chromatogr. B. 827 (1), 146-156 (2005).</li>
<li>Marvin, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+o%2Co%27-dityrosine%2C+o-nitrotyrosine%2C+and+o-tyrosine+in+cat+urine+samples+by+LC%2Felectrospray+ionization-MS%2FMS+using+isotope+dilution%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Quantification of o,o'-dityrosine, o-nitrotyrosine, and o-tyrosine in cat urine samples by LC/electrospray ionization-MS/MS using isotope dilution.</a> Anal. Chem. 75 (2), 261-267 (2003).</li>
<li>Orhan, H., Vermeulen, N. P., Tump, C., Zappey, H., Meerman, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+determination+of+tyrosine%2C+phenylalanine+and+deoxyguanosine+oxidation+products+by+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+as+non-invasive+biomarkers+for+oxidative+damage%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+B%22%5BJournal%5D)">Simultaneous determination of tyrosine, phenylalanine and deoxyguanosine oxidation products by liquid chromatography-tandem mass spectrometry as non-invasive biomarkers for oxidative damage.</a> J. Chromatogr. B. 799 (2), 245-254 (2004).</li>
<li>Chen, H. J. C., Chiu, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+detection+and+quantification+of+3-nitrotyrosine+and+3-bromotyrosine+in+human+urine+by+stable+isotope+dilution+liquid+chromatography+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Simultaneous detection and quantification of 3-nitrotyrosine and 3-bromotyrosine in human urine by stable isotope dilution liquid chromatography tandem mass spectrometry.</a> Toxicol. Lett. 181 (1), 31-39 (2008).</li>
<li>Marc, D. T., Ailts, J. W., Campeau, D. C. A., Bull, M. J., Olson, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotransmitters+excreted+in+the+urine+as+biomarkers+of+nervous+system+activity%3A+validity+and+clinical+applicability%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Biobehav.+Rev%22%5BJournal%5D)">Neurotransmitters excreted in the urine as biomarkers of nervous system activity: validity and clinical applicability.</a> Neurosci. Biobehav. Rev. 35 (3), 635-644 (2011).</li>
<li>Li, X. G., Li, S., Wynveen, P., Mork, K., Kellermann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+a+specific+and+sensitive+LC-MS%2FMS+method+for+quantification+of+urinary+catecholamines+and+application+in+biological+variation+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Development and validation of a specific and sensitive LC-MS/MS method for quantification of urinary catecholamines and application in biological variation studies.</a> Anal. Bioanal. Chem. 406 (28), 7287-7297 (2014).</li>
<li>Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-analytical+and+analytical+validations+and+clinical+applications+of+a+miniaturized%2C+simple+and+cost-effective+solid+phase+extraction+combined+with+LC-MS%2FMS+for+the+simultaneous+determination+of+catecholamines+and+metanephrines+in+spot+urine+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Talanta%22%5BJournal%5D)">Pre-analytical and analytical validations and clinical applications of a miniaturized, simple and cost-effective solid phase extraction combined with LC-MS/MS for the simultaneous determination of catecholamines and metanephrines in spot urine samples.</a> Talanta. 159, 238-247 (2016).</li>
<li>Chao, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+detection+of+3-nitrotyrosine+and+3-nitro-4-hydroxyphenylacetic+acid+in+human+urine+by+online+SPE+LC-MS%2FMS+and+their+association+with+oxidative+and+methylated+DNA+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Res.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous detection of 3-nitrotyrosine and 3-nitro-4-hydroxyphenylacetic acid in human urine by online SPE LC-MS/MS and their association with oxidative and methylated DNA lesions.</a> Chem. Res. Toxicol. 28 (5), 997-1006 (2015).</li>
<li>Radabaugh, M. R., Nemirovskiy, O. V., Misko, T. P., Aggarwal, P., Mathews, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoaffinity+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+detection+of+nitrotyrosine+in+biological+fluids+development+of+a+clinically+translatable+biomarker%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Immunoaffinity liquid chromatography-tandem mass spectrometry detection of nitrotyrosine in biological fluids development of a clinically translatable biomarker.</a> Anal. Biochem. 380 (1), 68-76 (2008).</li>
<li>Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s00216-015-8934-5">Tailored 96-well µElution solid-phase extraction combined with UFLC-MS/MS: a significantly improved approach for determination of free 3-nitrotyrosine in human urine.</a> Anal. Bioanal. Chem. 407 (25), 7703-7712 (2015).</li>
<li>Roche Diagnostics. Roche Creatinine Jaffé Gen.2, package insert 2011-11, V7. , Mannheim. Available from:
 <a target="_blank" href="https://usdiagnostics.roche.com/products/06407137190/PARAM2083/overlay.html">https://usdiagnostics.roche.com/products/06407137190/PARAM2083/overlay.html</a> 2011-2011 (2011).</li>
<li>Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+mixed-mode+solid+phase+extraction+coupled+with+LC-MS%2FMS+for+the+re-evaluation+of+free+3-nitrotyrosine+in+human+plasma+as+an+oxidative+stress+biomarker%5BTitle%5D)+AND+%22Talanta%22%5BJournal%5D)">A novel mixed-mode solid phase extraction coupled with LC-MS/MS for the re-evaluation of free 3-nitrotyrosine in human plasma as an oxidative stress biomarker.</a> Talanta. 140, 45-51 (2015).</li>
<li>Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+approach+for+the+ultra-sensitive+determination+of+catecholamines+in+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+to+assess+neural-immune+communication%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">An integrated liquid chromatography-tandem mass spectrometry approach for the ultra-sensitive determination of catecholamines in human peripheral blood mononuclear cells to assess neural-immune communication.</a> J. Chromatogr. A. 1449, 54-61 (2016).</li>
</ol>

Yazarlar, çıkar çatışması olmadığını beyan eder.

İnsan idrar örneklerinde endojen serbest 3-NT için literatürde daha önce bildirilen konsantrasyonlarda önemli değişiklikler, mevcut testler 8 , 9 , 10 , 11 ile ilgili metodolojik problemleri ortaya çıkarmaktadır. İnsan idrarı altındaki düşük 3-NT seviyesinin doğru tespiti, örnek hazırlama ve LC-MS / MS analizi için özel tedbirler gerektiren zorlu bir görev olmaya devam etmektedir. Bu protokol,...

Son yıllarda oksidatif stresin klinik sunum üzerindeki etkileri ön plana çıkmaktadır 1 . Araştırılan biyolojik belirteçlerden biri, reaktif azot türleri (RNS), katekolamin nörotransmitter öncüsü olan tirozin ile etkileşime girdiğinde oluşan, uçta dengeli bir ürün olan 3-nitrotirosin (3-NT) &#39;dir. 3-NT, in vivo RNS için bir biyolojik belirteç olarak klinik değeri olabileceği gibi, tirozin özelliklerinin ve işlevlerinin önemli değişiklikleriyle karşılık gelen proteinleri ve hücresel işlevleri olumsuz şekilde etkileyebilir 1 , 2 . Yükselen araştırmalar, 3-NT&#39;nin inflamatuar koşullar 3 , nörodejeneratif bozukluklar 4 , 5 , kardiyovasküler hastalık 6 ve diyabet 7&#39;de ve oksidatif stresle ilgili koşullarda önemli bir rol oynayabileceğini önermektedir. Ancak, bu observations sensitivite ve / veya seçicilik 8, 9, 10, 11 eksik metodolojileri sonuçlarına dayanmaktadır. Daha önce literatürde bildirilen biyolojik numuneler için muazzam 3-NT konsantrasyon aralıkları, ciddi analitik problemlerin bu tahliller ile ilişkili olduğunu ve 3-NT seviyelerini doğru bir şekilde ölçmek ve bu koşulların patolojisindeki rolünü doğrulamak için teknik iyileştirmenin gerek duyulduğunu ortaya koymaktadır . Biyolojik matristeki serbest 3-NT&#39;nin nicelendirilmesi, insan ve enstrüman için 8 , 9 , 10 , 11 özel bir zorluk ortaya koymaktadır. Birincisi, endojen 3-NT&#39;nin iz seviyesi aşırı duyarlı bir tespit gerektirir; İkincisi, çok sayıda yapısal olarak benzer analogların varlığı, özellikle de tirozin,Aşırı derecede fazlalık, yüksek oranda seçicilik gerektirir; Üçüncüsü, her yerde bulunan nitrat ve nitrit ile tirozin nitrasyonuyla 3-NT&#39;nin artefaktik oluşumu, 3-NT&#39;nin sahte aşırı tahmin edilmesini önlemek için numune hazırlama esnasında özel olarak düşünülmesini gerektirir. 3-NT ölçmek için kullanılan metodolojilerin çeşitli arasında, MS / MS nedeniyle üstün hassasiyet ve seçicilik 11, 12, 13, 14, altın standart yöntem olarak kabul edilmiştir. Gaz kromatografisi (GC), MS / MS en yüksek duyarlılık, ancak, zorunlu örnek türetme adımları çok sıkıcı ve vardır sunmaktadır bağlanmış klinik kullanım 15, 16 için etkili olduğu zaman alır. LC-MS / MS karmaşık numune türetme işlemine ihtiyaç duymaz, bu da daha umut vericidir. Bununla birlikte, üstesinden gelinmesi gereken bazı engeller var.Literatürde bildirilen LC-MS / MS yöntemlerinin nsitivitesi, düşük miktarda 3-NT 7 , 17 , 18 ölçümü için iyileştirilmesi ve yüksek verimli uygulamalar için nispeten uzun dönüş süresi kısaltılmalıdır 12 , 13 , 17 , 19 . Ek olarak, klinik uygulamalar göz önüne alındığında, kullanılan biyolojik matris önemli bir rol oynamaktadır. Mümkünse bulaşıcı olmayan, kolay ve ucuz olmalıdır 20 , 21 , 22 . Literatürde geleneksel olarak kullanılan örnek olan plazma klinik olarak istenen bir matristir, bu nedenle invaziv olmayan ve maliyet-etkinliği olan idrarı kullanan bir metod aranmıştır. Rel geliştirmek için çeşitli girişimlerKullanılabilir ve spesifik LC-MS / MS metodolojileri idrar 9 , 10 , 11 kullanılarak yapılmıştır . Bununla birlikte, hepsi seçici, güvenilir ya da klinik kullanım için yeterince etkili olmamaktadır. Geleneksel ters fazlı kartuş (C18 tipi) kullanılarak 3-NT analizi için numune temizliği olarak baskın SPE&#39;nin etkinliği sorgulanmış ve ardışık bir şekilde güçlü katyon değişimi (SCX) ve ters faz C18-OH SPE&#39;si önerilmiştir 6 , 7 , 19 . Yakın zamanda geliştirilen bir LC-MS / MS yöntemi, manuel C18 SPE, preparatif yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (HPLC) ve 3-NT 23&#39;ün analizi için online SPE&#39;nin çok aşamalı bir saflaştırma prosesini kullanmıştır. Bu yöntem 0.041 nM LLOQ ile klinik amaçlar için yeterince hassas olsa da, temizleme işlemi yoğun ve sıkıcıydı ve requiKırmızı 3 mL idrar, yüksek verim için fizibilitesini sınırlıyor. Bir moleküler olarak basılmış bir polimer temizleme işlemi 14 verimliliğini artırmak için SPE emici olarak kullanıldı, ancak elde edilen LLOQ (0.7 ug / mL) klinik örnekler için yeterince düşük değildi. Bir başka yöntem, 0.022 nM 24&#39;lük bir saptama limiti (LOD) elde etmek için numunenin temizlenmesi için iki boyutlu (2D) LC-MS / MS ve immünoafinite kromatografisini gerektirdi. Tüm bu yöntemler 3-NT değerlendirmesinde ilerleme kaydederken, hiçbiri klinik uygulamalar için gerekli duyarlılık, güvenilirlik ve verimliliği sağlamamıştır. Serbest 3-NT patolojisini ve bunun klinik ortamdaki oksidatif stresin bir biyobelirteç olarak rolünü araştırmak için basit, verimli, doğru ve kesin, yüksek verimli klinik uygulamalar için bir yöntem geliştirdik 25 . Minyatür karışık mod katyonuTürevlendirme, buharlaştırma ve 2D-LC&#39;yi gerektiren mevcut yöntemlerde görülen dezavantajları atlayarak basit ve etkili numune temizleme ve 3-NT&#39;nin zenginleştirilmesi için tek bir ekstraksiyonda elde edilen hange (MCX) 96 oyuklu ekstraksiyon mikroplağı uygulandı. Hareketli fazda katkı maddesi olarak% 0.01 HCOOH ile sıvı kromatografisi hızlı çevrim süresi ile gelişmiş bir sinyal yanıtı sundu. Seçicilik daha 3-NT ve iç standart (IS) her ikisi içinde selektif 3-NT ayrıştırma ve MRM geçişi kullanımı için hafif bir NH4OAc elüsyon çözeltisi uygulamasıyla geliştirilmiştir. Matris etkisi, kantifikasyon için indirgenmiş miktarda bir 13 C işaretli izotopik IS kullanılarak telafi edildi. Bu metodolojinin ortaya çıkmasıyla araştırmacılar ve klinisyenler klinik koşullardaki 3-NT rolünü doğrulayacak ve oksidatif stresin etkisini daha da keşfedebileceklerdir.

<table><tbody><tr><td>3-Nitro-L-tirozin</td><td>Sigma</td><td>N7389-5g</td><td></td></tr><tr><td>3-Nitro-L-tirozin-13C9</td><td>Sigma</td><td>652296-5.0mg</td><td></td></tr><tr><td>Kütle Spec Altın İdrar</td><td>Altın Batı Biyolojikler</td><td>MSG 5000-1L</td><td></td></tr><tr><td>Oasis MCX 96-kuyulu ve mikro; Elüsyon plakası</td><td>Sular</td><td>186001830BA</td><td></td></tr><tr><td>2 mL 96 kuyu toplama plakası</td><td>Phenomenex&nbsp; &nbsp;</td><td>AH0-7194</td><td></td></tr><tr><td>96 pozitif işlemci</td><td>Suları&nbsp;</td><td></td><td></td>186005521</tr><tr><td>LC-MS Ultra CHROMASOLV metanol&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma</td><td>14262-2L</td><td></td></tr><tr><td>LC-MS Ultra CHROMASOLV su</td><td>Sigma</td><td>14263-2L</td><td></td></tr><tr><td>Kütle spektrometresi için formik asit</td><td>Sigma</td><td>94318-50ML-F</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum hidroksit çözeltisi</td><td>Sigma</td><td>338818-1L</td><td></td></tr><tr><td>Ultra PFP propil kolonlar</td><td>Restek</td><td>9179362</td><td></td></tr><tr><td>5500 Üçlü dörtlü</td><td>AB Sciex&nbsp;</td><td>/</td><td>Daha fazla ayrıntı için</td></tr><tr><td>UFLC-XR</td><td>Shimadzu ile iletişime geçin&nbsp;</td><td>/</td><td>Daha fazla detay için üretim ile iletişime geçin</td></tr><tr><td>Integra 400 Plus&nbsp;</td><td>Roche</td> <td>/</td> <td>İdrar Kreatinin Jaff ve eacute; Gen 2 yöntemi</td></tr><tr><td>LCMS sertifikalı 12 x 32 mm vidalı boyunlu flakon</td><td>Sular</td><td>600000751CV</td><td></td></tr><tr><td>LCGC sertifikalı 12 x 32 mm vida boyunlu toplam geri kazanım şişesi</td><td>Sular</td><td>186000384C</td><td></td></tr><tr><td>5 mL taşıma tüpü</td><td>Phoenix</td><td>TT-3205</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Santrifüj tüpü</td><td>Kristaljen ve nbsp;</td><td>23-2263</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Santrifüj tüpü</td><td>Kristal&nbsp;</td><td>23-2266</td><td></td></tr><tr><td>eLine elektronik pipet</td><td>Sartorius</td><td>730391</td><td></td></tr><tr><td>Mikrofüj santrifüjü&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>A46474</td><td></td></tr><tr><td>OHAUS dengesi&nbsp; &nbsp;</td><td>Kennedy Terazileri, inc.</td><td>735</td><td></td></tr><tr><td>Vorteks karıştırıcı&nbsp;</td><td>Bernstead Termolyne</td><td>M16715</td><td></td></tr></tbody></table>

klinik uygulamalar İçin İnsan İdrarında 3-nitrotirosinin minyatür katı faz Çıkarma ve lc-ms / ms algılamasının entegrasyonu

Integration of Miniaturized Solid Phase Extraction and LC-MS/MS Detection of 3-Nitrotyrosine in Human Urine for Clinical Applications

Serbest 3-nitrotirosin (3-NT), oksidatif stres için olası bir biyolojik belirteç olarak yaygın şekilde kullanılmıştır. Çok çeşitli patolojik koşullarda artan 3-NT seviyeleri bildirilmiştir. Bununla birlikte, mevcut yöntemler, düşük endojen seviyedeki 3-NT&#39;yi güvenilir bir şekilde ölçmek için gerekli olan yeterli duyarlılık ve / veya özgüllükten yoksundur ve klinik uygulamalar için çok hantaldır. Bu nedenle, 3-NT düzeylerini doğru bir şekilde ölçmek ve patolojik koşullardaki 3-NT rolünü doğrulamak için analitik iyileştirmeye acilen ihtiyaç duyulmaktadır. Bu protokol, non-invaziv biyolojik belirteç olarak insan idrarında 3-NT&#39;nin hızlı ve doğru ölçümü için minik bir katı faz ekstraksiyonu (SPE) ile birlikte yeni bir sıvı kromatografi tandem kütle spektrometresi (LC-MS / MS) algılamasının gelişimini sunar Oksidatif stres için. 96 yuvalı bir plak kullanarak SPE, numune temizleme ve analit zenginleştirmeyi sıkıcı türetme ve buharlaştırma adımları olmadan birleştirerek işlemi basitçe belirginleştirdi, Solvent tüketimini azaltmak, atık bertaraf etmek, kirlenme riski ve genel işlem süresi. SPE elüsyon çözeltisi, pH 9, 25 mM amonyum asetat iş (NH4OAc) esas olarak seçicilik geliştirilmiş. Kütle spektrometresi sinyal tepkisi, çoklu reaksiyon izleme (MRM) geçişlerinin ayarlanması yoluyla geliştirildi. Bir pentaflorofenil (PFP) kolonuna (150 mm x 2.1 mm, 3 μm) katkı maddesi olarak% 0.01 HCOOH kullanılması, sinyal tepkisini 2.5 kat daha geliştirmiş ve toplam çalışma süresini 7 dakikaya kısaltmıştır. 10 pg / mL&#39;nin (0.044 nM) düşük bir niceleme limiti (LLOQ) elde edildi, bu da bildirilen testlere kıyasla önemli bir duyarlılık geliştirmeyi temsil etti. Bu basitleştirilmiş, hızlı, seçici ve duyarlı yöntem, iki pleyt numunesi (n = 192) 24 saatlik bir süre içinde işlenmesine izin verir. Geliştirilen analitik performans ve invaziv olmayan ve ucuz idrar örneklemesi göz önüne alındığında, önerilen test, klinik öncesi ve klinikte faydalıdırçalışmaları.

Şekil 1 , 3-NT&#39;nin, optimize edilmiş LC koşulu altında diğer yapısal olarak benzer tirosin analoglarından tamamen kromatografik olarak ayrıldığını göstermekte olup, bu da aşırı derecede aşırı bileşikler nedeniyle oluşan birlikte müdahale etkileşimlerini ortadan kaldırmakta ve dolayısıyla tahlil seçiciliğini arttırmaktadır. Ek olarak MA ve metanolde katkı maddesi olarak% 0.01 HCOOH ile 0.45 mL / dak&#39;lık bir akış oranında gradiyentli olarak elüsyon, hı...

Karma mod katyon değiştirme (MCX) 96-kuyulu bir mikroplak üzerinde verimli bir katı faz ekstraksiyonu ile birleşmiş seçici ve duyarlı bir sıvı kromatografi tandem kütle spektrometresi (LC-MS / MS) yöntemi, serbest 3-nitrotirosin 3-NT) insan idrarında yüksek verimle, klinik uygulamalar için uygundur.

Klinik Uygulamalar İçin İnsan İdrarında 3-Nitrotirosinin Minyatür Katı Faz Çıkarma ve LC-MS / MS Algılamasının Entegrasyonu

Free 3-nitrotyrosine (3-NT) has been extensively used as a possible biomarker for oxidative stress. Increased levels of 3-NT have been reported in a wide ...

LC-MS/MS ile kombine edilmiş bu minyatürize katı faz ekstraksiyonu analizinin genel amacı, klinik uygulamalar için insan idrarındaki serbest 3-nitrotirosini doğru bir şekilde nicelleştirmektir. Serbest 3-nitrotirosin, oksidatif stres için bir biyobelirteç görevi görür. Bununla birlikte; yetersiz hassasiyet, seçicilik ve zahmetli numune hazırlama işlemleri nedeniyle, klinik uygulamalar için biyolojik örneklerde 3-nitrotirosini doğru şekilde nicelleştirmek özel bir zorluk teşkil etmeye devam etmektedir.Oldukça hassas bir LC-MS/MS etkileşiminde etkili bir katı faz ekstraksiyonunu içeren bu teknik, konfigürasyon ve iki boyutlu LC ihtiyacı duymadan, insan idrarındaki düşük seviyeli endojen 3-nitrotyrosin miktarının hızlı, spesifik ve doğru bir şekilde belirlenmesine olanak tanır. Bu yöntem oksidatif stres araştırmaları hakkında bilgi sağlayabilse de, kompleks enflamatuar ve nörodejeneratif bozukluklar gibi diğer patolojik durumlar için de uygulanabilir. Antioksidanlar 3-nitrotyrosin seviyesini düşürebildiği için, bu tekniğin etkileri antioksidan tedavinin etkinliğinin izlenmesine doğru genişletilebilir. Bu prosedüre başlamak için, önceden hazırlanmış ve çözülmüş idrar örneklerini, stand

integration-miniaturized-solid-phase-extraction-lc-msms-detection-3

Research

JoVE Journal

Chemistry

Kimya

Gelecekteki klinik uygulama için tükürük örnekleme göz önüne alındığında, bir lolipop gibi ultrafiltrasyon (LLUF) prob insan oral kavite sığacak şekilde imal edilmiştir. NanoLC-LTQ kütle spektrometresi tarafından sindirilmemiş tükürük Direkt analizi büyük proteinler ve yüksek bolluk proteinler kaldırmak ve düşük bol peptidler daha tespit yapmak LLUF probların yeteneğini göstermiştir.

Bir Lollipop-Like Ultrafiltrasyon Probe Kullanımı İnsan Yerli Tükürük Peptidome Örnekleme: Klinik Kütle Spektrometresi için Peptid Algılama basitleştirin ve geliştirin

Hedefsiz metabolomik bir metabolik profili anlık üreten bir hipotez sağlar. Bu protokol, serum hücreler veya doku metabolitlerinin çıkarma ve analiz gösterecektir. Metabolitleri bir dizi sıvı-sıvı faz ekstraksiyon kullanılarak anket vardır, Mikrosirkülasyon Ultra Performanslı sıvı kromatografisi / diferansiyel analiz yazılımı için birleştiğinde yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi (UPLC-HRMS).

Ultra Performanslı Sıvı Kromatografi-Yüksek Çözünürlüklü Kütle Spektrometre (UPLC-HRMS) kullanarak Biyolojik Kaynaklar gelen hedefsiz Metabolomik

Bir elektrosprey iyonizasyon (ESI) kütle spektrometresine bağlı, şirket içi yerleşik akışlı triptik mikro reaktör ile proteolitik sindirim için hızlı bir protokol sunulmaktadır. Mikroreaktörün üretimi, deney düzeneği ve veri toplama süreci anlatılmaktadır.

Bir akış oranı mikroreaktör MS Algılama Proteinlerin hızlı enzimatik işlenmesi

Α-prokollajen sitokrom P450s tarafından kanserojen nitrozaminler ve mutasyonlar neden DNA-zarar intermediates üretir kabul edilen metabolik yoludur. Ancak, yeni verileri daha fazla nitrosamides oksidasyon oluşabilir gösterir. Biz genel bir tarif yöntemi nitrosamides tespit için üretilen vitro sitokrom P450 katalize metabolizması nitrozaminler.

Nitrosamide oluşumu nitrozaminler sitokrom P450s tarafından in Vitro metabolizma saptamak için bir genel yöntem

Biz aynı anda üç monoamin nörotransmitter belirlenmesi ve iki onların metabolitleri bebekler idrar için yüksek basınçlı sıvı Kromatografi (HPLC) elektrokimyasal algılama (ECD) ile birleştiğinde uygun bir katı fazlı çıkarma mevcut. Biz Ayrıca metaboliti MHPG beyin hasarı erken tanısı için potansiyel bir biyomarker olarak bebekler için tanımlar.

Ayıklama ve çözümleme katekoiamin nörotransmitter ve onların metabolitleri yüksek basınçlı sıvı Kromatografi ile uygun bir yöntem

Biz bir yüksek performanslı sıvı kromatografi elektrokimyasal dedektör (HPLC-ECD) kullanarak hava örnekleyici prefilters--dan kesmek 6 mm çaplı mermi ile 3-nitrotyrosine atmosferik proteinlerin kimyasal değişimleri tespit etmek için bir yöntem mevcut.

3-Nitrotyrosine atmosferik ortamlar üzerinden yüksek performanslı sıvı kromatografi elektrokimyasal dedektör sistemi tespiti

Burada biz bir yüksek-den geçerek yöntemi ile kalite kontrol multisegment enjeksiyon-kılcal göre geliştirilmiş çözünürlük ve ilaç kötüye kullanımı ve bunların metabolitleri büyük paneller tespiti için sağlar kapsamlı uyuşturucu gözetimi için tarif Elektroforez-kütle spektrometresi.

Multisegment enjeksiyon-kılcal Elektroforez kütle spektrometresi kullanılarak yüksek üretilen iş ve kapsamlı uyuşturucu gözetim

Tirozin-nitrated proteinlerin proteomik profilleme 3-nitrotirozin modifikasyonunda düşük bolluk nedeniyle zorlu bir teknik olmuştur. Burada, nitropeptid zenginleştirme ve model olarak angiotensin II kullanarak profil oluşturma için yeni bir yaklaşım açıklanmaktadır. Bu yöntem diğer in vitro veya in vivo sistemlerde uzatılabilir.

Anjiyotensin II tarafından gösterilen nitropeptid profil oluşturma ve tanımlama

Burada, tek bir dörtlüktolü kütle spektrometresi ile birlikte sıvı kromatografisi ile analiz edilen kanser hücre kültürlerinden toplanan ortamda kynurenine pathway'de (kynurenine, 3-hydroxykynurenine, ksantürenik asit, 3-hidroksiranilik asit) üretilen dört farklı triptofan metabolitinin belirlenmesi için bir protokol açıklanmıştır.

Kanser Hücre Kültürlerinden Toplanan Ortamda Sıvı Kromatografi-Kütle Spektrometresi ile Analiz Edilen Seçilmiş Kynureninlerin Eşzamanlı Nicelemesi

Bu protokol, tümörle ilişkili proteaz aktivitelerinin ex vivo analizi yoluyla bakım noktası kanser teşhisini mümkün kılan bir CRISPR-Cas aracılı, multianalit sentetik idrar biyobelirteç testini açıklar.

Taşınabilir Teşhis için CRISPR-Cas Aracılı Multianalit Sentetik İdrar Biyobelirteç Testi

Öğrenin, minyatür katı faz çıkarma ve LC-MS/MS kullanarak insan idrarında 3-nitrotirosini klinik uygulamalar için hassas bir şekilde nasıl ölçebilirsiniz. Bu yöntem oksidatif stres araştırmalarında yüksek duyarlılık sağlar.

Klinik Uygulamalar İçin İnsan İdrarında 3-Nitrotirosinin Minyatür Katı Faz Çıkarma ve LC-MS / MS Algılamasının Entegrasyonu

Daha fazla video keşfet