Klinik Uygulamalar İçin İnsan İdrarında 3-Nitrotirosinin Minyatür Katı Faz Çıkarma ve LC-MS / MS Algılamasının Entegrasyonu
14 Temmuz 2017
Karma mod katyon değiştirme (MCX) 96-kuyulu bir mikroplak üzerinde verimli bir katı faz ekstraksiyonu ile birleşmiş seçici ve duyarlı bir sıvı kromatografi tandem kütle spektrometresi (LC-MS / MS) yöntemi, serbest 3-nitrotirosin 3-NT) insan idrarında yüksek verimle, klinik uygulamalar için uygundur.
LC-MS/MS testi ile birleştirilen bu minyatür katı faz ekstraksiyonunun genel amacı, klinik uygulamalar için insan idrarındaki serbest 3-nitrotirozini doğru bir şekilde ölçmektir. Serbest 3-nitrotirozin, verime yardımcı olur ve oksidatif stres için bir biyobelirteçtir. Bununla birlikte, yetersiz duyarlılık, seçicilik ve hantal numune hazırlıkları nedeniyle klinik uygulamalar için biyolojik acil durumlarda 3-nitrotirozinin doğru bir şekilde ölçülmesi özel bir zorluk olmaya devam edecektir.
Son derece hassas bir LC-MS/MS etkileşiminde etkili bir katı faz ekstraksiyonu içeren bu teknik, insan idrarındaki düşük endojen 3-nitrotirozin seviyelerinin anayasa ve iki boyutlu LC'ye ihtiyaç duymadan hızlı, spesifik ve doğru bir şekilde belirlenmesini sağlar. Bu tekniğin etkileri, antioksidan tedavisinin etkinliğinin izlenmesine doğru genişletilebilir, çünkü 3-nitrotirozin seviyesi antioksidanlar tarafından azaltılabilir. Bu prosedüre başlamak için, önceden hazırlanmış ve çözülmüş idrar örneklerini, standartları ve QC örneklerini girdaplayın.
Girdaplamadan sonra, her numuneden 250 mikrolitre ekleyin ve iki mililitrelik 96 oyuklu temiz bir toplama plakasının 32 kuyusuna standart olarak ekleyin. Çift boş numune kuyucuğu hariç her bir oyuğa 50 mikrolitre önceden hazırlanmış dahili standart çalışma solüsyonu ekleyin. Daha sonra çift boş numune kuyucuğuna% 0.01 formik asit içeren 50 mikrolitre LC-MS sınıfı su ekleyin.
Bunu takiben, kuyucuklara %0.1 formik asit içeren 250 mikrolitre LC-MS sınıfı su ilave edilir. Daha sonra çözeltileri sekiz kanallı bir pipetle üç kez karıştırın ve SPE yüklenene kadar plakayı kapatın. Ardından, pozitif basınçlı bir işlemci üzerine karışık modlu bir katyon değişimi 96 oyuklu ekstraksiyon mikroplakası ve bir toplama rezervuarı yerleştirin.
Karışık modlu bir katyon değişim mikroplakası kullanan katı faz ekstraksiyonu, tek bir ekstraksiyonda aynı anda numune temizlemeyi ve 3-nitrotirozinin zenginleştirilmesini sağlar. Sorbentten 200 mikrolitre LC-MS dereceli metanol akıtarak ekstraksiyon plakasını koşullandırın. Karışımın sorbentten yavaşça akmasına izin vermek için düşük bir pozitif basınç ayarlamak için pozitif basınç işlemcisindeki basınç ayar düğmesini çevirin ve gerekirse basıncı ayarlayın.
Sorbentten %2 formik asit içeren 200 mikrolitre LC-MS dereceli su akıtarak dengeleyin. Sekiz kanallı bir pipet kullanarak, önceden karıştırılmış numunelerin her birinin tüm hacmini önceden koşullandırılmış ekstraksiyon plakasına dikkatlice yükleyin. Karışımın sorbentten yavaşça akmasını sağlamak için pozitif basınç işlemcisine düşük pozitif basınç ayarlayın ve basıncı gerektiği gibi ayarlayın.
Bunu takiben, sorbentten 200 mikrolitre LC-MS dereceli su ile% 2 formik asit akıtarak kuyuları yıkayın. 200 mikrolitre metanol ve su ile yıkadıktan sonra, kuyuları kurutmak için pozitif basınçlı işlemciyi yüksek basınca ayarlayın. Kuyular kuruduktan sonra, rezervuarı iki mililitrelik 96 oyuklu temiz bir toplama plakası ile değiştirin.
Şimdi, tutulan analiti ve iç standardı ekstraksiyon plakasından yavaşça çıkarmak için 50 milimolar amonyum asetat çözeltisinden 25 mikrolitre uygulayın. Daha sonra eluenti nötralize etmek için %5 formik asit ile 50 mikrolitre LC-MS dereceli su ekleyin. 3-nitrotirozinin elüsyonu için hafif bir amonyum asetat çözeltisinin uygulanması, önemli ölçüde gelişmiş seçicilik ve hassasiyet sağlar.
Sıvı kromatografisi tandem kütle spektrometresi analizine hazırlık olarak numuneleri sekiz kanallı bir pipetle üç kez karıştırın. LC-MS/MS cihazını kurduktan sonra, 3-nitrotirozin LC-MS/MS yöntemini LC gradyan elüsyonu ile 10 dakika dengeleyin. Yöntemin dengelenmesiyle, LC gradyanı ilk gradyan elüsyonuna dengelenecektir.
Otomatik örnekleyici sıcaklığı dört santigrat dereceye ve fırın sıcaklığı 30 santigrat dereceye ayarlanacaktır. İdrar örneklerini, standartları ve kalite kontrol örneklerini içeren bir toplu iş listesi oluşturun. Ardından hazırlanan numuneleri enjekte ederek partiyi başlatın.
Tüm enjeksiyonları tamamladıktan sonra, nominal 3-nitrotirozin konsantrasyonuna karşı 3-nitrotirozin ve dahili standardın tepe alan oranının doğrusal regresyonu ile 3-nitrotirozin kantitasyonu için mililitre başına 10 ila 2.500 pikogram aralığında standart bir eğri oluşturun. Son olarak, belirlenen standart eğriyi kullanarak diğer tüm numuneleri ölçün ve QC numunelerinin belirlenen aralık içinde olup olmadığını belirleyin. İnsan idrar örneklerinden elde edilen LC verileri, 3-nitrotirozinin, optimize edilmiş koşul altında diğer yapısal olarak benzer tirozin analoglarından kromatografik olarak ayrıldığını göstermektedir, bu da bu çok aşırı bileşiklere bağlı ko-elüsyon girişimlerini ortadan kaldırır ve sonuç olarak tahlil seçiciliğinin derecesini arttırır.
Çift boş numunenin çoklu reaksiyon izleme kromatogramında bir 3-nitrotirozin sinyali gözlenmez, bu da tüm işlem boyunca 3-nitrotirozinin oluşmadığını gösterir. 3-nitrotirozinin temsili çoklu reaksiyon izleme kromatogramları ve sağlıklı bir birey için dahili standart burada gösterilmektedir. 3-nitrotirozin ve iç standardın alıkonma sürelerinde herhangi bir parazit sinyali gözlenmedi.
Burada temsili bir standart eğri gösterilmektedir. Üçten büyük bir sinyal-gürültü oranına sahip en düşük konsantrasyon olarak tanımlanan algılama sınırı, mililitre başına iki pikogram olarak belirlendi. Kantitasyonun alt sınırı mililitre başına 10 pikogram olarak belirlendi ve 10'dan büyük bir sinyal-gürültü oranı ile %20'lik belirsizlik ve doğruluk içindeki en düşük konsantrasyon olarak tanımlandı.
İnce ayarlı entegrasyon testi, azaltılmış matris etkisi, sorbent kullanımı ve atık bertarafı ile önemli ölçüde geliştirilmiş özgüllük, hassasiyet ve verim sağlar. Bu basit ve hızlı tahlil ile idrar örneği 24 saat içinde işlenebilir. Non-invaziv ve ucuz idrar örneklemesini dikkate alın.
Bu dikkate değer ölçüde geliştirilmiş yöntem, klinik öncesi ve klinik çalışmalarda oksidatif stres biyobelirteç olarak 3-nitrotirozinin rolünü değerlendirmek için çok uygundur.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, insan idrarındaki serbest 3-nitrotirosini kantitativleştirmek için son derece hassas bir sıvı kromatografi tandem kütle spektrometrisi (LC-MS/MS) yöntemi sunmaktadır. Yöntem, katı faz ekstraksiyonunu içermekte olup klinik uygulamalar ve oksidatif stres araştırmaları için uygun hale getirilmiştir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Klinik Biyokimya
- Oksidatif Stres Araştırması
Arka Plan
- Serbest 3-nitrotirosin, oksidatif stres için bir biyobelirteçtir.
- Biyolojik örneklerde doğru kantitasyon, hassasiyet ve seçicilik sorunları nedeniyle zordur.
- Mevcut yöntemler genellikle zahmetli numune hazırlıklarını içerir.
- Oksidatif stres, nörodejeneratif bozukluklar da dahil olmak üzere çeşitli patolojik durumlarla bağlantılıdır.
Çalışmanın Amacı
- İnsan idrarındaki serbest 3-nitrotirosinin doğru kantitasyonu için bir yöntem geliştirmek.
- Oksidatif stres üzerine klinik uygulamaları ve araştırmaları kolaylaştırmak.
- Antioksidan tedavi etkinliğinin izlenmesini sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Minyatür katı faz ekstraksiyonu.
- Sıvı kromatografi tandem kütle spektrometrisi (LC-MS/MS).
- İdrar numunelerinin yüksek verimli analizi.
- Standartlar ve kalite kontrol örneklerinin hazırlanması.
Ana Sonuçlar
- Yöntem, düşük düzeyde 3-nitrotirosinin hızlı ve spesifik belirlenmesine izin verir.
- Geleneksel yöntemlere göre hassasiyet ve seçiciliği artırır.
- Sonuçlar, oksidatif stres ve ilgili durumlar hakkında bilgi sağlayabilir.
- Antioksidan tedavilerinin izlenmesinde potansiyel uygulamalar.
Sonuçlar
- Geliştirilmiş LC-MS/MS yöntemi klinik uygulamalar için etkilidir.
- Biyolojik örneklerde 3-nitrotirosinin kantitasyonundaki zorlukları ele alır.
- Bu teknik, oksidatif stres ve bunun etkileri üzerine araştırmaları geliştirebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Accurate quantification of low-abundance biomarkers like 3-nitrotyrosine in human urine is critical for oxidative stress research and clinical biomarker validation. This miniaturized SPE-LC/MS/MS method delivers enhanced sensitivity and selectivity, enabling reliable detection of endogenous 3-NT levels without derivatization or lengthy sample preparation. The high-throughput format supports preclinical and clinical studies requiring rapid, non-invasive biomarker assessment for go/no-go decisions in antioxidant therapeutic development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of oxidative stress pathways by providing quantitative 3-NT measurements as a functional biomarker.
- Operational Value: Reduces mechanistic ambiguity through specific detection of free 3-NT in complex biological matrices.
- Predictive Value: Supports target confidence by correlating 3-NT levels with disease states and antioxidant intervention outcomes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers a standardized, reproducible assay with low matrix effect for consistent compound screening.
- Operational Value: Miniaturized SPE on 96-well plates allows processing of 192 samples in 24 hours, improving workflow efficiency.
- Scalability: Reduced solvent consumption and waste disposal lower operational costs for large-scale biomarker studies.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase oxidative stress mechanisms to preclinical validation via quantifiable urinary biomarker.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables monitoring of antioxidant treatment effectiveness through measurable reductions in 3-NT levels.
- Disease Relevance: Applicable to inflammatory and neurodegenerative disorders where oxidative stress plays a pathogenic role.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification to preclinical validation by providing a robust oxidative stress readout.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and biological de-risking by quantifying 3-NT as a downstream effector of reactive nitrogen species.
- Screening: Enables assay readiness with high sensitivity (LLOQ 10 pg/mL) and selectivity for reliable compound evaluation in urine.
- Analytics: Provides quantitative MRM-based readouts with signal-to-noise >10 for accurate concentration determination across a 10–2500 pg/mL range.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through biomarker alignment with oxidative stress pathology and antioxidant response.
- Enterprise Reuse: The miniaturized SPE-LC/MS/MS platform is reusable across multiple studies, reducing revalidation burden.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in oxidative stress biomarker measurement, reduction of false positives from interferences.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and high throughput (192 samples/24h) enable consistent cross-study comparisons.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions in antioxidant development via quantifiable biomarker modulation.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of compounds based on biomarker engagement and mechanism validation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in LC-MS/MS method development and solid phase extraction optimization.
- Needs access to positive pressure processors, 96-well SPE plates, and PFP chromatographic columns.
- Demands standardization of sample handling, internal standard use, and MRM transition settings across sites.
- Adaptation to other biological matrices may require reoptimization of elution and cleanup conditions.
- Practical limitation: Method is specific to free 3-NT; total 3-NT measurement would require hydrolysis steps not included here.
