Kanser Hücre Kültürlerinden Toplanan Ortamda Sıvı Kromatografi-Kütle Spektrometresi ile Analiz Edilen Seçilmiş Kynureninlerin Eşzamanlı Nicelemesi

Kinüreninler, kanser de dahil olmak üzere çeşitli hastalıklarda bağışıklık tepkisi düzenlemesi ile ilişkilidir. Çoklu kinüreninleri tanımlamak için güvenilir ve doğrulanmış yöntemler, daha etkili tedavilerin geliştirilmesine yardımcı olur. Protokolümüz, kanser hücre kültürlerinden toplanan besiyerinde kinürenin yolu tarafından üretilen farklı triptofan metabolitlerini tanımlamak için kütle spektrometresi ile birleştirilmiş sıvı kromatografisi kullanır.

Deneyimsiz kullanıcılar, numune hazırlama veya veri toplama ve yorumlama aşamalarında bazı zorluklar yaşayabilir. Protokolümüzü ve önerilerimizi takip ederek hatalardan kaçınabilir ve güvenilir veriler elde edebilirsiniz. Reaktiflerin stok çözeltilerini hazırlamak için, her bir reaktifin 0.3 miligramını bir şişede en yüksek doğrulukta tartın ve her bir reaktifin litre stok çözeltileri başına bir gram elde etmek için her bir reaktifi 300 mikrolitre uygun çözücü içinde çözün.

Kömürle muamele edilmiş kültür ortamını hazırlamak için, konik bir tüpte 280 miligram aktif kömürü tartın ve ilgilenilen hücreleri kültürlemek için hazırlanan sıvı ortamdan beş mililitre ekleyin. Tüpü ortam ve odun kömürü ile bir tahterevalli külbütöründe iki saat oda sıcaklığında ve dakikada 50 salınımla çalkalayın. İnkübasyonun sonunda, kömürü santrifüjleme ile çökeltin ve kömürü bozmadan süpernatanı dikkatlice toplayın, ardından ortamı 0.45 mikrometrelik bir şırınga filtresi kullanarak süzün.

Kalibrasyon çözeltisini hazırlamak için, kömürle muamele edilmiş kültür ortamını litre 3NT çözeltisi başına 0,75 mikrolitre 0,1 gram ile doldurun ve tüm kalibrasyon aralıklarını kapsayacak şekilde en az altı farklı konsantrasyona kadar 3-H kinürenin, 3-HAA kinürenin ve ksantürenik asit ekleyin. Girdaplamadan sonra, numune deproteinizasyonu için her tüpe %1 formik asit takviyeli 150 mikrolitre eksi 20 santigrat derece soğuk metanol ekleyin ve tüpleri tekrar sıkıca kapatın ve girdaplayın. Eksi 20 santigrat derecede 40 dakikalık bir inkübasyondan sonra, numuneleri santrifüjleyin ve her bir süpernatantın 270 mikrolitresini ayrı ayrı düz tabanlı cam şişelere aktarmak için otomatik bir pipet kullanın.

Şişeleri bir buharlaştırıcıya yerleştirin ve uçucu bileşenleri yaklaşık 30 dakika boyunca nazikçe buharlaştırmak için su metanol fraksiyonları için uygun programı kullanın. Tüpler kuruduğunda, her bir numuneyi su içinde 60 mikrolitre% 0.1 formik asit içinde sulandırın ve her bir çözeltiyi santrifüjleme için ayrı ayrı 1.5 mililitrelik tüplere aktarmadan önce numuneleri vorteksleyin. Tortuyu bozmadan, süpernatanları konik cam eklere sahip kromatografik şişelere aktarın ve şişeleri bir LC-MS otomatik örnekleyiciye yerleştirin.

Numuneleri çalıştırmadan önce, kabarcıkları gidermek ve tüm solvent kanallarını doldurmak için LC sistemini mobil faz ile temizleyin. Ardından, kolonda sabit bir basınç gözlenene kadar sistemi %100 çözücü A ile yıkamadan önce koruma ve analitik sütunu yaklaşık 30 dakika %100 asetonitril ile yıkayın, ardından veri toplama yazılımında uygun LC parametrelerini ayarlayın ve numuneleri LC sisteminde çalıştırmak için bir çalışma listesi oluşturun. Kalibrasyon eğrisini oluşturmak için, veri toplama yazılımında, kalibrasyon standartlarını iş listesine ekleyin ve standartları üç nüsha halinde çalıştırın, ardından 3-hidroksikinürenin, kinürenin, 3-hidroksiantranilik asit, 3-nitrotirozin ve ksantürenik aside karşılık gelen tepe alanını sırasıyla yaklaşık 4.4, 10, 16, 21 ve 30 dakikalık tutma süresinde ölçün.

Bir in vitro hücre kültüründen süpernatan örnekleri toplamak için, ilgilenilen hücrelerin 48 saatlik standart hücre kültüründen sonra, her bir oyuktan 500 mikrolitre süpernatanı ayrı ayrı 1.5 mililitrelik tüplere aktarın ve hücre kalıntılarını santrifüjleme ile çıkarın, daha sonra orta süpernatanları analize kadar eksi 80 santigrat derece depolama için yeni tüplere aktarın ve hücre peletlerini protein tahmin analizine kadar eksi 20 santigrat derecede tutun. LC-MS analizi için numune hazırlamak için, çözülmüş her bir kültür ortamı numunesinin 149.25 mikrolitresini yeni bir 1.5 mikrolitrelik tüpe aktarın ve her tüpe litre başına 0.75 mikrolitre 0.1 gram 3NT çözeltisi ekleyin. Numuneleri gösterildiği gibi hazırladıktan sonra, her tüpe %1 formik asit takviyeli 150 mikrolitre eksi 20 santigrat derece metanol ekleyin ve numuneyi gösterildiği gibi LC-MS analizi için hazırlayın.

İş listesi tamamlandığında, her bir analitin tepe alanını ölçün ve her bir deney numunesinde bulunan analitlerin konsantrasyonlarını hesaplamak için her analit için ayrılmış ayrı bir doğrusal kalibrasyon denklemi kullanın. Kültür ortamı örneğine karşılık gelen hücresel protein içeriğini değerlendirmek için, her bir hücre peletini 100 mikrolitre PBS içinde yeniden süspanse edin ve örnekleri buz üzerinde çözmeden önce eksi 20 santigrat derecede bir saat dondurun. Numuneleri üç kez dondurarak-çözdürdükten sonra, hücre lizatlarını santrifüjleme ile toplayın ve süpernatanları peletleri bozmadan yeni tüplere aktarın.

Numuneyi 10 kez taze PBS ile seyreltin ve 96 oyuklu bir plakanın uygun oyuklarına iki kopya halinde uygun hacimlerde sığır serum albümini standart solüsyonu ekleyin. Her bir hücre lizat numune süpernatantından 10 ila 15 mikrolitreyi 96 oyuklu plakanın uygun oyuklarına yükleyin ve hem standart hem de numune kuyucuklarını kuyu başına 50 mikrolitre PBS'lik bir nihai hacme kadar doldurun. Daha sonra, her bir kuyucuğa beş kez ultra saf su ile seyreltilmiş 200 mikrolitre bir Bradford reaktifi ekleyin ve plakayı oda sıcaklığında en az beş dakika inkübe edin.

İnkübasyonun sonunda, plakayı bir mikroplaka okuyucusuna yükleyin ve absorbansı 595 nanometrede ölçün, daha sonra her bir numunedeki protein miktarının hesaplanmasına izin vermek için bir kalibrasyon eğrisi oluşturun ve her bir kinüreninin konsantrasyonunu toplam protein içeriğine bölün. İşte litre başına 4.5 gram D-glukoz ve %10 fetal sığır serumu içeren besiyerlerinin analizi sırasında elde edilen tek dört kutuplu kütle spektrometresi sonuçları. Numune içinde kinürenin varlığını gösteren küçük tepe noktasına dikkat edin.

LC sinyallerinde bir kayma veya uyumsuzluklar gözlemlenebileceğinden, analitlerin uygun tutma sürelerini doğrulamak için gerçek numune verilerine ihtiyaç duymadan önce bir kalite kontrol numunesi çalıştırın. Birlikte elüsyonlu matris bileşenleri, hedef analitler için seçilen ana yük oranı ile iyonlar üretebilir. Örneğin, bu analizde, bilinmeyen bileşiğin tepe noktası, ana yük oranı 206'nın iyonunun izlendiği tarama periyodunda ortaya çıktı.

Tutma süresinin uyumsuzluğu nedeniyle, sinyal analite karşılık gelmedi. Triptofan izotopu, ana yük oranı 206 ile aynı iyonu paylaşmasına rağmen, kromatografik analiz, triptofan sinyalinin ksantürenik asit sinyalinden iyi bir şekilde ayrıldığını ortaya çıkardı, bu da test edilen kanser hücresi ortamında bulunan triptofan seviyesinin ksantrenik asit miktar tayinini etkilemediğini gösterdi. İki tip kanser hücresi hattından elde edilen kültür ortamının bu analizi, değerlendirilen insan epitelyal meme kanseri hücrelerinin farklı miktarlarda triptofan metabolitleri salgıladığını, test edilen insan yumurtalık kanseri hücrelerinin ise önemli ölçüde daha yüksek seviyelerde kinürenin ürettiğini göstermektedir.

Numune hazırlama sırasında dahili bir standart kullanmak, güvenilir veri toplamaya yardımcı olur. Verilerin protein içeriğine normalleştirilmesi, bireysel kuyucuklardaki hücre sayısı değişkenliklerini düzeltir. Protokolümüz, ek analitleri belirlemek için daha da genişletilebilir, ancak farklı deneysel koşullar altında kültür ortamında birikebilir.