Bir akış oranı mikroreaktör MS Algılama Proteinlerin hızlı enzimatik işlenmesi

Bu protokolün genel amacı, bir elektrosprey iyonizasyon kütle spektrometresi ile protein tanımlamasını sağlamak için proteinlerin hızlı enzimatik sindirimini gerçekleştiren akış geçişli bir triptik mirkoreaktörün imalatını tanımlamaktır. Yöntem, yapı ve fonksiyonun aşağı akış karakterizasyonunu desteklemek için izole edilmiş ve saflaştırılmış proteinlerin amino asit dizisini göstermeye yardımcı olabilir. Bu protokolün ana avantajı, hızlı, uygun maliyetli ve mikrofabrikasyon platformlardan yararlanan iş akışlarına entegrasyona eğilimli olmasıdır.

Başlamak için, daha büyük cam kılcal boruyu yedi ila sekiz santimetre uzunluğa ve daha küçük olanı üç ila beş santimetre uzunluğa kesmek için bir cam kılcal balta kullanın. Her iki kılcal ucun da çıkıntılı çapaklar olmadan temiz, düz bir kesime sahip olduğunu doğrulamak için bir mikroskop kullanın. Küçük kılcal damarı, büyük olanın bir ucuna yaklaşık altı milimetre yerleştirin.

Ardından, kılcal damarların birleşim yerinin etrafına küçük bir tutkal damlası uygulamak için bir Q ucu kullanın ve yapıştırıcının gece boyunca oda sıcaklığında kürlenmesine izin verin. Ardından, yerleştirilen kılcal damarı yaklaşık 10 ila 15 milimetre uzunluğunda kesin. Bu uç, elektrosprey iyonizasyon yayıcı olarak işlev görecektir.

Daha büyük çaplı kılcal damarın diğer ucunu, dört ila beş santimetre uzunluğunda önceden kesilmiş ve bir PEEK rakoruna bağlanmış 1/32 inçlik bir PEEK tüpüne yerleştirin. Ardından, beş santimetre uzunluğundaki 1/16 PTFE boru parçasını rakorun diğer ucuna yerleştirin ve sıkın. Temiz, kuru iki mililitrelik bir cam dosyada, dört miligram C18 partikülünü ağırlıklandırın ve ardından 0,5 mililitre izopropanol ekleyin.

Şişeyi kapatın. Ultrasonicator banyosuna yerleştirin ve parçacıkları çözelti içinde eşit şekilde dağıtmak için sonikat yapın. Daha sonra, 200 mikrolitre C18 bulamacını çekmek için 250 mikrolitrelik bir şırınga kullanın.

Şırıngayı 1/16 inç PTFE boruya yerleştirin ve bulamacı yavaşça büyük kılcal damara dağıtın. Kılcal damar parçacıklarla dolarken, iki ila üç milimetre parçacık paketlemesi elde edilene kadar mikroskop altında gözlemleyin. Daha küçük kılcal boru, bu parçacıkları bir kilit taşı etkisi ile mikroreaktörde tutar.

Son olarak, mikroreaktörü 50 mikrolitre 50 ila 50 su ve asetonitril çözeltisi ile durulayın, ardından bir mikrolitre asetonitril ile karıştırılmış 49 mikrolitre su içeren 50 mikrolitre çözelti ile durulayın. Kılcal mikro reaktörü PEEK rakorundan ayırın ve bir PEEK-T'ye bağlayın. Ardından, PEEK-T'nin yan koluna sızıntısız bir bağlantı sağlamak için 1/32 inç PEEK manşon ile yalıtılmış iki santimetre uzunluğunda bir platin tel yerleştirin.

Yarım metre uzunluğunda bir numune transfer kılcal damarını PEEK-T'nin diğer ucuna bağlayın. Sızıntısız bir bağlantı sağlamak için 1/32 inç PEEK kılıf kullanın. PEEK-T'yi XYZ tablasına sabitleyin.

Ve elektrosprey iyonizasyon yayıcısını kütle spektrometresi giriş kılcalından yaklaşık iki milimetre uzağa yerleştirin. Ardından, platin teli kütle spektrometresinin elektrosprey iyonizasyon güç kaynağı kaynağına bağlayın. Ayrıca, sızıntısız bir bağlantı sağlamak için 1/16 inç PEEK manşon kullanarak numune transfer kılcalının diğer ucunu paslanmaz çelik rakora bağlayın.

Ardından, dört ila beş santimetre uzunluğunda 1/16 inç uzunluğunda bir PTFE boru parçasını paslanmaz çelik rakorun karşı ucuna bağlayın. Eşlik eden metin protokolünde açıklandığı gibi tandem MS veri toplama parametrelerini MS cihazını kontrol eden yazılım paketine girin. Analizi gerçekleştirmek için kurulumu hazırlamak üzere bunları bir yöntem dosyası olarak kaydedin.

LTQ MS sistemi, kütle spektrometresinin çeşitli numune giriş yaklaşımlarına arayüzlenmesini sağlayan, ev yapımı bir XYZ aşaması içeren değiştirilmiş bir ESI kaynağı ile donatılmıştır. 250 mikrolitrelik bir şırıngayı% 2 asetonitril içinde çözülmüş 50 milimolar bikarbonat sulu çözeltisi ile yükleyin. Ardından, şırıngayı mikroreaktöre bağlayın ve şırınga pompasının altına yerleştirin.

Analize hazırlamak için mikroreaktörü ve dakikada iki mikrolitreyi beş dakika durulayın. Daha sonra, ilgilenilen protein örneğini 250 mikrolitrelik bir şırıngaya yükleyin ve örnek çözeltiyi beş dakika boyunca dakikada iki mikrolitre infüze edin. Daha sonra, şırınga pompasının altına beş mikromolar tripsin çözeltisi ile yüklenmiş 250 mikrolitrelik bir şırınga yerleştirin ve emilen proteinin mikroreaktör üzerinde bir ila üç dakika boyunca dakikada iki mikrolitre infüze edin.

Her deneyden önce tripsin çözeltisinin taze olarak çözülmesi ve hazırlanması çok önemlidir. Bu, protolitik enzimin aktivitesini ve mikroreaktörün yaklaşık 8 pH değeri olan operasyonel pH'ını korumasını sağlayacaktır. %250 asetonitril'e eklenen %0 trifloroasetik asitten oluşan sulu bir çözelti ile 2 mikrolitrelik başka bir şırınga yükleyin.

Mikroreaktörü beş dakika boyunca dakikada iki mikrolitre durulayarak proteolitik sindirim sürecini söndürmek için bu çözeltiyi kullanın. Ardından, %50 asetonitril'e eklenen %01 trifloroasetik asit ile doldurulmuş bir şırıngaya geçin ve Elektrosprey İyonizasyon voltajında MS Veri Toplama İşlemini yaklaşık 2000 volta getirin. Protein sindirimini mikroreaktörden 20 ila 30 dakika boyunca dakikada 300 nanolitre ile ayırmaya başlamak için asitleştirilmiş çözeltiyi kullanın.

Ekteki metin protokolünde sağlanan veri toplama parametrelerini kullanarak toplu spesifikasyon verilerini elde edin. Önce ham verileri arama motoruna yükleyerek LTQ MS ham dosyalarını minimum düzeyde yedekli bir protein veritabanı kullanarak işleyin. Ardından, ana ve parça iyon kütle toleranslarını sırasıyla iki ve bir dalton olarak ayarlayın ve arama için yalnızca iki adede kadar kaçırılmış bölünmeye sahip tamamen triptik parçalar kullanın.

Buna ek olarak, yüksek ve orta güvenilirlikli yanlış bulma oranlarını sırasıyla %1 ve %3 olarak ayarlayın ve özellikle belirli değişiklikler aramadığınız sürece çeviri sonrası değişikliklere izin vermeyin. Son olarak, yalnızca yüksek güvenilirlikli peptit eşleşmelerini seçmek için verileri filtreleyin. Burada, mikroreaktörde proteolize tabi tutulan bir protein karışımından üretilen triptik peptitlerden oluşan bir kütle spektrumu gösterilmektedir.

Bu etiketler, en yoğun triptik peptit iyonlarını temsil eder ve dizilerini ve karşılık gelen protein tanımlayıcılarını sağlar. Bu mikroreaktör, proteinlerin enzimatik sindirimini gerçekleştirmek için uygulaması kolay bir deney kurulumu sağlar ve 30 dakikadan daha kısa sürede kütle analizi ve tanımlaması sağlar. Bu prosedürü denerken, solüsyonlarla temas eden şişelerin ve enstrümantasyonun temizliğini korumanın, numune kontaminasyonunu önlemek için kritik öneme sahip olduğunu unutmamak önemlidir.

Bu prosedürü takiben, üretken peptitlerin daha iyi bir karakterizasyonunu sağlamak ve proteinlerin yapısı ile ilgili ek soruları yanıtlamak için diğer kütle spektrometresi veri toplama yöntemleri kullanılabilir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, proteonomik alanındaki araştırmacıların proteinlerin analizi için daha hızlı protokoller geliştirmelerinin ve biyolojik örneklerin yüksek verimli keşfedilmesini sağlayan yeni mikrofalitik platformların geliştirilmesini keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu teknik, 25 ila 50 peptit üreten oldukça basit protein karışımlarının analizi ile sınırlıdır.

Bu peptitler basit infüzyon deneyleri ile analiz edilebilir ve MS analizinden önce sıvı kromatografik ayrım gerektirmez. Organik çözücülerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman açık alevlerden kaçınmak gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.