Name: Bir akış oranı mikroreaktör MS Algılama Proteinlerin hızlı enzimatik işlenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Öğrenin, akış oranı mikroreaktör kullanarak proteinlerin hızlı enzimatik sindirimini ve kütle spektrometrisiyle tanımlanmasını. Bu yöntem, proteomik araştırmalar için hızlı ve uygun maliyetli bir çözüm sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, IML'ye NSF/DBI-1255991 hibesi ile desteklenmiştir.

Kılcal mikroreaktör hazırlanması 1. <ol><li> 100 um iç çap (ID) 360 um dış çap (OD) 7-8 cm uzunluğunda kılcal ve cam kılcal bıçağıyla 3-5 cm 20 um çapa x 90 mm OD kılcal X ekseni; herhangi çıkıntılı çapaklar olmadan, hem kılcal ucu temiz, düz bir kesim var mikroskop altında doğrulayın. </li><li> ~ 6 mm uzunluğunda, 100 um iç çap x 360 mm OD borunun bir ucuna 20 mikron iç çapa x 90 mm OD kılcal yerleştirin; ihtiyaç halinde, mikroskop altında bu işlemi dikkate alınmalıdır. </li><li> Q-ucu sonu ile 90 mikron OD / 100 mikron ID kılcal damarların birleştiği etrafında tutkal E6000 küçük bir damlacık uygulayın ve oda sıcaklığında tutkal kür O / N izin verin. </li><li> ~ 10-15 mm bir uzunluğa eklenir 20 um çapa x 90 mm OD kılcal kesme; Bu elektrosprey iyonizasyon yayıcı olacaktır. </li><li> Önceden kesilmiş 1/32 &quot;OD PEEK, 1/16&quot; OD PEEK ve 1/16 &quot;OD PTFE küvetuzunluğunda 4-5 cm parçalar halinde ing; Bu bir sızıntı ücretsiz bağlantı sağlamak için kılcal birlikleri kullanılan kollu olacak. </li><li> Bir PEEK birliğe 100 mikron ID x 360 mm OD kılcal ucunu bağlayın; Bir sızıntı ücretsiz bağlantı sağlamak için bir 1/32 &quot;PEEK kol kullanabilirsiniz. </li><li> Ekle / birliğin karşısında sonunda içine 5 cm uzunluğunda 1/16 &quot;PTFE tüp ~ bir parça sıkın. </li><li> önceden temizlenmiş / 2 ml bir cam şişe kurutuldu C18 (5 um) bir parçacık ~ 4 mg ağırlığında; , 0.5 ml izopropanol ilave şişeyi kapatın ve ultrasonikatör banyosunda bulamaç dağıtmak. </li><li> , 250 ul şırınga yaklaşık 200 ul bulamaç ile çekilme PEEK birliği 1/16 &quot;PTFE tüp şırınga iğne takın ve yavaş yavaş 100 mikron ID x 360 mikron OD kılcal içine bulamaç dağıtmak; olarak mikroskop altında gözlemlemek kılcal elde edilir 2-3 mm&#39;lik ambalaj uzunluğu kadar parçacıklar ile doldurur, bu mikroreaktör olacaktır (Şekil 1), 20 μ.m kimliği kılcal bir Keystone etkisi ile mikroreaktör partikülleri tutar. 15 </li><li> H2O / CH3CN 50:50 h / h 50 ul çözeltisi ~ ile mikroreaktör yıkayın ve daha sonra H2O / CH3CN 98 50 ul çözeltisi ~ ile: 2 h / h. </li></ol> Örnek Çözümleri 2. Hazırlık Not: Organik çözücü ve asitler ve çözelti hazırlama kullanımı içeren İşlemler davlumbaz ifa edilecek olan vardır. gözlük, eldiven ve koruyucu giysiler giyin. <ol><li> CH3 OH ile yıkayın ve bir kaç küçük cam şişeler (4 mi) ve polipropilen tüpleri (15 mi) kuru. </li><li> H2O / CH3CN içindeki bir çözeltisine, 10 ml hazırlama (98: 2 h / h), 15 ml polipropilen bir tüp içinde 200 ul CH3CN ile 9.8 mL H2O karıştırarak; sonikasyon ile karıştırın. </li><li> Oluşan bir çözeltiye 10 ml hazırlamak H2O / CH3CN (50:50 h / h), 15 ml polipropilen bir tüp içinde 5 ml H2 karıştırılarak &lt;/ sub&gt; O ile 5 ml CH3CN; sonikasyon ile karıştırın. </li><li> H2O / CH3CN, 4 ml 4 ul TFA (% 10) eklenmesi ile asitleştirilmiş sulu bir çözeltisi (TFA% 0.01 h / h) 4 ml hazırlanması: Bir 4 ml bir cam şişe içinde (98 2 h / h); sonikasyon ile karıştırın. </li><li> 4 ml H2O / CH3CN (50:50 h / h) &#39;de 4 ml bir cam şişeye 4 ul TFA (% 10) eklenmesi ile asitleştirilmiş, organik çözelti (TFA% 0.01 h / h) 4 ml hazırlamak; sonikasyon ile karıştırın. </li><li> 16 mg NH4 HCO3 tartılır 4 ml bir cam şişe içinde, bir analitik mikro-dengesi ile; (: 2 h / h 98) çözeltisi ve sonikasyon ile dispers, 2 O / CH3CN H 4 ml Bu sulu tampon içinde NH4 HCO3 (pH ~ 7.8), 50 mM çözeltisi ile sonuçlanır. </li><li> Standart proteinin 5 mg ağırlığında (örneğin, büyükbaş hayvan serum albümin, hemoglobin α / β, sitokrom c, karbonik anhidraz, α-2-HS-glikoprotein, vs.), bir 4 ml cam tüp içinde bir analitik mikro-dengesi ile; 4 mi DI wate eklemer ve sonikasyon ile dağıtmak; Bu, tipik olarak yüksek bir uM düzeyinde konsantrasyonu çözelti ile sonuçlanır. </li><li> NH4 HCO3 (50 mM), sulu tampon, uygun hacimde yüksek uM düzeyinde konsantrasyonu çözeltisi ile seyreltilmesi ile 1 ml protein çözeltisi (1-2 uM) hazırlama; sonikasyon ile karıştırın. </li><li> (50 mm) NH4 HCO3 170 ul sulu tampon 20 ug dizileme dereceli tripsin eritilerek tripsin çözeltisi (5 uM) hazırlama; sonikasyon ile dağılır. </li></ol> 3. Deneysel Kurulum Not: LTQ-MS sistemi, çeşitli örnek giriş yaklaşımlara kütle spektrometresi arabirim sağlayan bir ev yapımı XYZ kademeli içeren değiştirilmiş bir ESI kaynağı ile donatılmıştır. <ol><li> PEEK sendikası kılcal mikroreaktör ayırın ve PEEK Tee bağlanın. </li><li> PEEK Tee yan kolunda bir ~ 2 cm uzunluğunda Pt tel takın; Bir temin edilmesi için bir 1/32 &quot;PEEK kol kullanabilirsinizkaçak ücretsiz bağlantı ve Pt tel yalıtım. </li><li> PEEK Tee karşı ucuna (~ 0.5 m uzunluğunda) Örnek transferi kılcal kanallardan 50 mikron çapa x 360 um OD geç; Bir sızıntı ücretsiz bağlantı sağlamak için bir 1/32 &quot;PEEK kol kullanabilirsiniz. </li><li> XYZ-sahnede PEEK Tee Güvenli ve uzak kütle spektrometresi giriş kılcal ESI yayıcı ~ 2 mm yerleştirin. </li><li> kütle spektrometresi ESI güç kaynağı kaynağına Pt tel bağlayın. </li><li> Paslanmaz çelik birliğe örnek transferi kılcal ucunu bağlayın; Bir sızıntı ücretsiz bağlantı sağlamak için 1/16 &quot;PEEK kol kullanabilirsiniz. </li><li> Paslanmaz çelik birliği karşı ucuna 4-5 cm uzunluğunda 1/16 &quot;PTFE tüp bağlayın ve PTFE tüp 250 ul şırınga iğneyi; örneğin (pompa açmak ve istenilen değerde akış hızını ayarlamak, 2 ul / dakika). </li><li> MS Enstrüman bir kontrol yazılım paketi içine girdi tandem MS veri toplama parametrelerianalizi yapmak için hazır kurulum için bir yöntem dosyası olarak kaydetmek d; LTQ-MS sistemi için, aşağıdaki veri bağımlı analiz parametreleri kullanabilirsiniz: dışlama kitle genişliği ile 180 saniye süreyle etkin dinamik dışlama 1,5 m / z ±; bir MS bir zoom ardından tarama ve MS ilk 5 en yoğun zirveleri üzerinde 2 tarama, 5 m / z ± tarama genişliği Büyütmek; çarpışma kaynaklı ayrışma izolasyon genişliği 3 m / z, normalize çarpışma enerjisi% 35, aktivasyon Q 0.25 ve aktivasyon zamanında 30 milisaniye olarak belirlenmiştir (CID) parametreleri. </li></ol> 4. mikroakışkan Kur <ol><li> Cam ya da polimerik substratlardan mikroakışkan cihazı hazırlanması; bir girişine bağlı 16-18 cihazının yerleştirimini Şekil 2A&#39;da verilmiştir bir mikroreaktör oluşan (1) (0.13 mm genişlik x 2 mm uzunluk x 50 mm derinlik) (2 ), çıkışı (3) ve bir yan bağlantı noktası (4); Akışkan manipülasyonları için birbirine kanal ~ vardır110 mikron genişliğinde ve ~ 50 mikron derin; Çok kanallı yapı (5), oluşan ~ 1.5-2 mm derinlik x 10 mm genişlik x yerleştirilmiş 100 mikron uzunluğunda mikrokanallar 25 mikron dışında, mikroreaktör parçacıkları tutmak için bir filtre görevi görür. </li><li> Veya sıvı teslim (Şekil 2B) için parçaları barındıran bir polimerik tavır oluşturulması yoluyla giriş delikleri için özel konnektörleri yapıştırma çip sıvı-teslim bağlantılarını etkinleştirin. 16 </li><li> Aşama 1.8 de tarif edildiği gibi C 18 partikülleri (5 um) bir bulamaç hazırlamak; çip yan bağlantı noktasına bağlı 1/16 &quot;PTFE boru kullanarak bir şırınga ile mikroreaktör bulamaç sağlamak (4) 90 ° C sıcaklıktaki bir fırın içerisinde epoksi yapıştırıcı ve 1 saat için tedavi ile birlikte partikül yüklemeden sonra ağız yalıtım 16. </li><li> kür O / N E6000 yapıştırıcı ile mühürlenir, izin, çıkış limanında bir kılcal (20 mikron ID x 90 mm OD x 10 mm uzunluk) yerleştirin; Bu (ESI yayıcı olur <sTrong&gt; 6). </li><li> 50 mikron ID x 360 mikron OD bağlayın (~ 0.5 m uzunluğunda) yonga giriş portuna örnek transferi kılcal (2); 3.6-3.7 tarif edildiği gibi, bir 250 ul şırınga ve şırınga pompasına kılcal karşıt ucunu. </li><li> Giriş portuna hemen önce numune transfer hattı üzerinde, bir hafif PEEK bağlantı parçası yerleştirin (2) ve T-şekilli yan koluna bir Pt tel takmak, 3.2 de tarif edildiği gibi; Bu ESI elektrot olacaktır. </li><li> kütle spektrometresi giriş kılcal ~ 2 mm uzakta konumlandırılmış ESI yayıcı ile XYZ sahnede mikroakışkan cihaz Güvenli; 3.8 de tarif edildiği gibi analiz için MS hazırlar. </li></ol> 5. Numune Yükleme, MS Analizi için proteolitik sindirim ve Elüsyon Tüm solüsyon / Örnek aktarım basamağı, bir şırınga pompası yardımıyla gerçekleştirilir ve ölü volum telafi etmek için, tamamlamak için bir kaç dakika daha izin vermelidir: Notve mikroreaktör transfer hatları ile ilişkili es; Gerekli zaman ilgili akış oranları bağlıdır. <ol><li> Mikroreaktör durulayın ve 2 O / CH3CN H sulu bir NH4 çözeltisi HCO3 (50 mM) infüzyonu ile analiz için hazırlayın: 5 dakika için 2 ul (98 2 h / h) / dk; 250 ul şırınga kullanın. </li><li> 2 ul örnek çözeltisi infüzyonu ile mikroreaktör protein örneği (1 uM) yük / dakika, 5 dakika boyunca; 250 ul şırınga kullanın. </li><li> 1-3 dakika / 2 ul dakika mikroreaktör üzerinde adsorbe protein üzerinde tripsin solüsyonu (5 mcM) demlenmeye. </li><li> TFA asitleştirilmiş sulu bir çözelti ile mikroreaktör durulayarak proteolitik sindirim süreci söndürün (% 0.01 hacim / hacim) H2O / CH3CN (98: 2 h / h) 2 ul / dakika, 5 dakika boyunca, 250 ul şırınga kullanın. </li><li> (Protein TFA bir asitleştirilmiş organik bir çözüm beslerken tarafından mikroreaktör gelen sindirmek akıtılarak% 0.01 başlath / h) H2O / CH3CN (50:50 h / h), 300 NL / dakika. </li><li> MS veri toplama süreci ve ESI voltajı (~ 2.000 V) açın; Adım 3.8 sağlanan veri toplama parametreleri kullanılarak MS veri elde; Triptik peptidlerin elüsyonu izleyin. </li></ol> 6. Veri İşleme <ol><li> Ham MS veri formatı ile uyumlu bir arama motoru ile tandem MS verileri işlemek. <ol><li> bir organizmanın belirli minimal gereksiz protein veritabanı kullanılarak LTQ-MS ham dosyaları işlemek; , Arama motoru ham veri yüklemek, sırasıyla 2 ve 1 Da ebeveyn ve fragmanı iyon kütle toleransları ayarlayın ve en fazla iki arama çatışmaları cevapsız ile sadece tam triptik parçaları kullanmak; posttranslasyonel modifikasyonlar için izin vermez; sırasıyla% 1 ve% 3, yüksek ve orta-güven yanlış keşif oranları (FDR) ayarlamak ve posttranslasyonel modifikasyonlar için izin vermez. </li></ol></li><li> sadece yüksek güven seçmek için verileri filtrelemekpeptid veritabanındaki proteinlere maçları; Protein ve peptid düzeyi sonuçlarını değerlendirmek. </li></ol>

<ol><li>Petersen, D. H. Microfluidic Bioreactors. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPetersen%2C+DH+%22Encyclopedia+of+Microfluidics+and+Nanofluidics%22">Encyclopedia of Microfluidics and Nanofluidics</a>. , Springer Science+Business Media. New York. (2014).</li>
<li>Matosevic, S., Szita, N., Baganz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamentals+and+applications+of+immobilized+microfluidic+enzymatic+reactors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Technol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Fundamentals and applications of immobilized microfluidic enzymatic reactors.</a> J. Chem. Technol. Biotechnol. 86 (3), 325-334 (2011).</li>
<li>Liu, Y., Liu, B., Yang, P., Girault, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+enzymatic+reactors+for+proteome+research%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Microfluidic enzymatic reactors for proteome research.</a> Anal. Bioanal. Chem. 390 (1), 227-229 (2008).</li>
<li>Wu, H., Zhai, J., Tian, Y., Lu, H., Wang, X., Jia, W., Liu, B., Yang, P., Xu, Y., Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+enzymatic-reactors+for+peptide+mapping%3A+strategy%2C+characterization%2C+and+performance%5BTitle%5D)+AND+%22LabChip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic enzymatic-reactors for peptide mapping: strategy, characterization, and performance.</a> LabChip. 4 (6), 588-597 (2004).</li>
<li>Jin, L. J., Ferrance, J., Sanders, J. C., Landers, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microchip-based+proteolytic+digestion+system+driven+by+electroosmotic+pumping%5BTitle%5D)+AND+%22LabChip%22%5BJournal%5D)">A microchip-based proteolytic digestion system driven by electroosmotic pumping.</a> LabChip. 3 (1), 11-18 (2003).</li>
<li>Asanomi, Y., Yamaguchi, H., Miyazaki, M., Maeda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme-immobilized+microfluidic+process+reactors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Enzyme-immobilized microfluidic process reactors.</a> Molecules. 7 (16), 6041-6059 (2011).</li>
<li>Aravamudhan, S., Joseph, P. J., Kuklenyik, Z., Boyer, A. E., Barr, J. R. Integrated microfluidic enzyme reactor mass spectrometry platform for detection of anthrax lethal factor. 31.st. Annual International Conference of the IEEE EMBS, , 1071-1074 (2009).</li>
<li>Liu, X., Lo, R. C., Gomez, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+a+microfluidic+enzyme+reactor+utilizing+magnetic+beads%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Fabrication of a microfluidic enzyme reactor utilizing magnetic beads.</a> Electrophoresis. 30 (12), 2129-2133 (2009).</li>
<li>Liu, Y., Xue, Y., Ji, J., Chen, X., Kong, J., Yang, P., Girault, H. H., Liu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gold+nanoparticle+assembly+microfluidic+reactor+for+efficient+on-line+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Gold nanoparticle assembly microfluidic reactor for efficient on-line proteolysis.</a> Mol. Cell. Proteomics. 6 (8), 1428-1436 (2007).</li>
<li>Wu, H., Tian, Y., Liu, B., Lu, H., Wang, X., Zhai, J., Jin, H., Yang, P., Xu, Y., Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Titania+and+alumina+sol-gel-derived+microfluidics+enzymatic-reactors+for+peptide+mapping%3A+design%2C+characterization%2C+and+performance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Titania and alumina sol-gel-derived microfluidics enzymatic-reactors for peptide mapping: design, characterization, and performance.</a> J. Proteome Res. 3 (6), 1201-1209 (2004).</li>
<li>Ji, J., Zhang, Y., Zhou, X., Kong, J., Tang, Y., Liu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+protein+digestion+through+the+confinement+of+nanozeolite-assembled+microchip+reactors%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Enhanced protein digestion through the confinement of nanozeolite-assembled microchip reactors.</a> Anal. Chem. 80 (7), 2457-2463 (2008).</li>
<li>Hustoft, H. K., Brandtzaeg, O. K., Rogeberg, M., Misaghian, D., Torsetnes, S. B., Greibrokk, T., Reubsaet, L., Wilson, S. R., Lundanes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+enzyme+reactor+and+high+resolving+chromatography+in+%26%2334%3Bsub-chip%26%2334%3B+dimensions+for+sensitive+protein+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Integrated enzyme reactor and high resolving chromatography in &#34;sub-chip&#34; dimensions for sensitive protein mass spectrometry.</a> Scientific Reports. 3 (3511), 1-7 (2013).</li>
<li>Pramanik, B. N., Mirza, U. A., Ing, Y. H., Liu, Y. H., Bartner, P. L., Weber, P. C., Bose, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microwave-enhanced+enzyme+reaction+for+protein+mapping+by+mass+spectrometry%3A+A+new+approach+to+protein+digestion+in+minutes%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Microwave-enhanced enzyme reaction for protein mapping by mass spectrometry: A new approach to protein digestion in minutes.</a> Protein Sci. 11 (11), 2676-2687 (2002).</li>
<li>Olszowy, P. P., Burns, A., Ciborowski, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pressure-assisted+sample+preparation+for+proteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Pressure-assisted sample preparation for proteomic analysis.</a> Anal. Biochem. 438 (1), 67-72 (2013).</li>
<li>Lord, G. A., Gordon, D. B., Myers, P., King, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tapers+and+restrictors+for+capillary+electrochromatography+and+capillary+electrochromatography-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Tapers and restrictors for capillary electrochromatography and capillary electrochromatography-mass spectrometry.</a> J. Chromatogr. A. 768, 9-16 (1997).</li>
<li>Lazar, I. M., Kabulski, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+LC+Device+with+Orthogonal+Sample+Extraction+for+On-Chip+MALDI-MS+Detection%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic LC Device with Orthogonal Sample Extraction for On-Chip MALDI-MS Detection.</a> Lab Chip. 13 (11), 2055-2065 (2013).</li>
<li>Harrison, D. J., Manz, A., Fan, Z. H., Ludi, H., Widmer, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capillary+electrophoresis+and+sample+injection+systems+on+a+planar+glass+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Capillary electrophoresis and sample injection systems on a planar glass chip.</a> Anal. Chem. 64 (17), 1926-1932 (1992).</li>
<li>Jacobson, S. C., Hergenroder, R., Koutny, L. B., Warmack, R. J., Ramsey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Injection+Schemes+and+Column+Geometry+on+the+Performance+of+Microchip+Electrophoresis+Devices%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Effects of Injection Schemes and Column Geometry on the Performance of Microchip Electrophoresis Devices.</a> Anal. Chem. 66 (7), 1107-1113 (1994).</li>
<li>Armenta, J. M., Perez, M. J., Yang, X., Shapiro, D., Reed, D., Tuli, L., Finkielstein, C. V., Lazar, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+Proteomic+Protocol+for+Biomarker+Fingerprinting+in+Cancerous+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Fast Proteomic Protocol for Biomarker Fingerprinting in Cancerous Cells.</a> J. Chromatogr. A. 1217, 2862-2870 (2010).</li>
<li>Doucette, A., Craft, D., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+Spectrometric+Study+of+the+Effects+of+Hydrophobic+Surface+Chemistry+and+Morphology+on+the+Digestion+of+Surface-Bound+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Mass Spectrometric Study of the Effects of Hydrophobic Surface Chemistry and Morphology on the Digestion of Surface-Bound Proteins.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 14, 203-214 (2003).</li>
<li>Lazar, I. M., Trisiripisal, P., Sarvaiya, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+Liquid+Chromatography+System+for+Proteomic+Applications+and+Biomarker+Screening%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Microfluidic Liquid Chromatography System for Proteomic Applications and Biomarker Screening.</a> Anal. Chem. 78 (15), 5513-5524 (2006).</li>
<li>Lazar, I. M., Karger, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+Open-Channel+Electroosmotic+Pumping+System+for+Microfluidic+Sample+Handling%2C%26%2334%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Multiple Open-Channel Electroosmotic Pumping System for Microfluidic Sample Handling,&#34.</a> Anal. Chem. 74 (24), 6259-6268 (2002).</li>
<li>Lazar, I. M., Rockwood, A. L., Lee, E. D., Sin, J. C. H., Lee, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+TOFMS+Detection+for+Capillary+Electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">High-speed TOFMS Detection for Capillary Electrophoresis.</a> Anal. Chem. 71 (13), 2578-2581 (1999).</li>
</ol>

Yazarlar herhangi bir rakip mali çıkar beyan etmemektedir.

Bu çalışmada tarif mikroreaktör sağlayan kolay uygulanması en az 30 dakika, MS analizi ve tanılanması için proteinlerin enzimatik sindirim yapmak için deney düzeneği. Geleneksel yaklaşımlara kıyasla bu sistemin farklı avantajları, basitlik, hız, düşük reaktif tüketimi ve düşük maliyetleri içerir. Özel olarak, pahalı bir hareketsiz tripsin boncuk ve kartuş için bir ihtiyaç vardır. Kılcal mikroreaktör hazırlanması basit (Şekil 1A), ve genel olarak, bir kromatografi laboratuvarda bulunan standart kaynaklar...

saflaştırılmış proteinlerin belirlenmesi ve tanımlanması, genellikle MS teknikleri kullanılarak elde edilir. Protein bir enzimle sindirilir ve peptitler, basit bir infüzyon deney düzeneği kullanılarak MS ile analiz edilir. Proteolitik sindirim çoğu MS analiz yararlı kütle aralığında düşüş küçük peptid fragmanlarını üretmek için gerekli olan ve kolayca amino asit sekansı bilgi üretmek için düşük enerji çarpışma kaynaklı ayrışma yoluyla parçalanmış olabilir. izole edilmiş proteinler veya basit bir protein karışımları için, MS tespiti önce peptitlerin kromatografik ayrılması için başka bir ihtiyaç vardır. 25-50 peptidlerinin bir karışım, kolayca MS iyonu kaynağı, doğrudan bir şırınga pompası ile örnek infüzyonu ile analiz edilebilir. kütle spektrometresi analizi yapmak ve kısa zaman çerçevesi içinde bir proteinin dizisini teyit edebilir. modern veri elde etme yöntemleri ile, bu işlem, ağ yapılabilirbirkaç dakika, hatta saniye ithin. Kısa bir süre ölçeğinde tüm süreci tamamlamada sınırlayıcı faktör proteolitik sindirim adımdır. Tipik haliyle, bu işlem birkaç saat süreyle gerçekleştirilir (veya O / N), çözelti içinde, 37 ° C &#39;de, alt-tabaka kullanılarak: (50-100) enzim oranı: 1 arasındadır. Tarif edilmiştir mikroakışkan reaktörler veya ticari olarak temin edilebilen kartuş formunda, dakika ya da saniye hareketsizleştirilmiş enzim mikroreaktörlerde enzimatik sindirim süresini azaltmak için. 1-6 Tipik olarak enzim kovalent, kovalent olmayan bir fiziksel / adsorpsiyon, kompleks immobilize edilir oluşumu ya da kapsülleme, enzimatik işlemin 3,6 geliştirilmiş verimlilik ile elde edilmiş olmaktadır geniş yüzey-hacim ve enzim için alt-tabaka-oranları. immobilize reaktör diğer avantajları, MS analizinde enzimden otolitik ve parazit azalır enzim stabilitesi ve tekrar kullanılabilirliği geliştirilmiş bulunmaktadır. yaklaşımlar, cam ile ya da polimerik mikrofabrike cihaz çeşitli tarif edilmiştirantikor-antijen etkileşimleri, manyetik boncuklar üzerinde hareketsizleştirilmiş enzimleri kullanılarak, 7,8 9 titanyum-alümina sol-jel 10 ve nanozeolites, 11 içinde kapsüllenmiş ya da Ni-NTA veya His-Tag kompleks oluşumu yoluyla çekilen altın nano partiküler ağlarında yakalanmış. 6 Alternatif immobilize enzimler ile açık boru şeklindeki kılcal damarlar, hem de geliştirilmiştir. 12 Dahası, gelişmiş proteolitik bölünme 30-120 reaksiyon sürelerini azaltmak için kontrollü mikrodalga ışıması 13 veya basınç destekli veya basınç çevrim teknolojisi (PCT) kullanılarak ortaya konmuştur min. 14 İmmobilize enzim reaktörlerin birden avantajlarına rağmen, ticari kartuş maliyetleri yüksek olduğu, rutin kullanım için mikroakışkan cihazların kullanılabilirliği sınırlıdır ve ek araçları için ihtiyaç mikrodalga veya PCT teknolojileri sonuçlarının kullanılması. Bu çalışmanın amacı, circumve bir yöntem geliştirmektiBu dezavantajların NTS ve kolayca dakika içinde MS analizi için hazırlık proteinlerin enzimatik bölünme gerçekleştirmek için basit ve etkili bir yaklaşımla araştırmacılar güçlendirmek için, her laboratuarda uygulanabilir. yaklaşım kılcal ya da mikroakışkan cihaz önceden yüklenmiş olan hidrofobik, C18 partiküllerin kullanımına dayanır ve fazla enzimin infüzyonu sırasında enzimatik sindirme ile ve ardından bu parçacıklar üzerindeki ilgili protein (ler) adsorpsiyonu dolgulu yatak ve yakalanan protein (ler). Bu yaklaşımda, alt-tabaka kovalent olmayan etkileşimlerle hareketsizleştirilen edilir ve enzim hareketsiz hale getirilmiş proteine ​​fazla demlenir. proteolitik sindirim verimliliği, enzimatik işlem, daha az ve parçacıkların yüzeyinden uzaklıkları ve yayılma süreleri için protein açığa büyük bir tanecik yüzey alanı artmıştır kütle transferi, enzim etkinliğine etki eden herhangi bir kovalent bağlanması, yeteneği artar hızla değerlendirme,Farklı enzimler, disposability ve çoğullama e kombinasyonları süreci mikroakışkan biçimde yürütülür ise. Bu yaklaşım, standart proteinler ve ESI-MS tespiti önce proteolitik sindirimi için tripsin en yaygın olarak kullanılan enzim karışımı kullanımı ile gösterilmiştir. Bu çalışmada tespiti için kullanılan kütle spektrometresi doğrusal bir tuzak dört kutuplu (LTQ) enstrüman oldu.

<table><tbody><tr><td>İyon tuzağı ESI-MS</td><td>Termo Elektron</td><td>LTQ LTQ</td><td>kütle spektrometresi, tandem MS verilerini elde etmek için kullanılır</td></tr><tr><td>XYZ aşaması</td><td>Newport</td><td>Birden fazla parça</td><td>Ev yapımı XYZ aşaması, ticari LTQ nano-ESI kaynağını çeşitli numune dağıtım sistemlerinden girdi alacak şekilde uyarlamak için kullanılır</td></tr><tr><td>Stereo mikroskop</td><td>Edmund optik</td><td>G81-278</td><td>Mikroskop, mikroreaktör paketleme sürecini gözlemlemek için kullanılır</td></tr><tr><td>Analitik terazi/Metler</td><td>VWR</td><td>46600-204</td><td>Terazi, protein numunelerini tartmak için kullanılır</td></tr><tr><td>Ultrasonik banyo/Branson</td><td>VWR</td><td>33995-540</td><td>Sonik banyo, numuneleri karıştırmak/homojenleştirmek ve C18 parçacık bulamacını dağıtmak için kullanılır</td></tr><tr><td>Şırınga pompası 22</td><td>Harvard Aparatı</td><td>552222</td><td>Mikropompa, numuneyi ve enzimi paketlenmiş kılcal mikroreaktör</td></tr><tr><td>Milli-Q ultra saf su sistemi</td><td>EMD Millipore</td><td>ZD5311595&nbsp;</td> üzerine ve içinden yüklemek, durulamak ve ayrıştırmak için kullanılır;<td>MilliQ su sistemi, arıtılmış DI suyu hazırlamak için kullanılır</td></tr><tr><td>Pipetleyici/Eppendorf (1.000&nbsp; &mikro; l)</td> <td>VWR</td><td>53513-410</td><td>Pipetatör, küçük hacimli numune çözeltilerini ölçmek için kullanılır</td></tr><tr><td>Pipettor / Eppendorf (100&nbsp; &mikro; l)</td><td>VWR</td><td>53513-406</td><td>Pipetatör, küçük hacimli numune çözeltilerini ölçmek için kullanılır</td></tr><tr><td>Pipettor/Eppendorf (10&nbsp; &mikro; l)</td> <td>VWR</td><td>53513-402</td><td>Pipetatör, küçük hacimli numune çözeltilerini ölçmek için kullanılır</td></tr><tr><td>Erimiş silika kılcal (100 & mikro; m Kimlik x 360 ve mikro; m OD)</td><td>Polymicro Technologies</td><td>TSP100375</td><td>Bu kılcal, mikroreaktör</td></tr><tr><td>Erimiş silika kılcalının (20&nbsp; &mikro; m Kimlik x 100 ve mikro; m OD)</td> <td>Polymicro Technologies</td><td>TSP020090</td><td>Bu kılcal, ESI emitörünün imalatı için kullanılır</td></tr><tr><td>Erimiş silika kılcal (50 < &mikro; m Kimlik x 360 ve mikro; m OD)</td><td>Polymicro Technologies</td><td>TSP050375</td><td>Bu kılcal, numuneleri ve eluentleri şırınga pompasından kılcal mikroreaktöre aktarmak için kullanılır</td></tr>. <tr><td>Cam kılcal balta</td><td>Supelco</td><td>23740-U</td><td>Bu, erimiş silika kılcal damarları istenen uzunlukta kesmek için bir araçtır</td></tr><tr><td>Tutkal</td><td>Eklektik Ürünler</td><td>E6000 Craft</td><td>Bu yapıştırıcı, ESI yayıcıyı kılcal mikro reaktöre veya mikroakışkan çipe sabitlemek için kullanılır</td></tr><tr><td>Epoksi yapıştırıcı</td><td>Epo-Tek</td><td>353NDT</td><td>Bu yapıştırıcı, C18 parçacıklarının yüklendiği mikroakışkan giriş deliğini kapatmak için kullanılır</td></tr><tr><td>Ters faz C18 parçacıkları (5&nbsp; &mikro; m)</td> <td>Agilent Technologies</td><td>Zorbax 300SB-C18</td><td>Bunlar, proteinlerin adsorbe edildiği C18 parçacıklarıdır; parçacıklar bir 4&nbsp; mm x 20 cm C18 LC sütunu Agilent</td></tr><tr><td>Şırınga/camdan (250 & mikro; l)</td> <td>Hamilton</td><td>81130-1725RN</td><td>Cam şırıngalar, C18 parçacık bulamacını kılcal mikroreaktöre yüklemek ve numuneyi ve eluentleri mikroreaktöre iletmek için kullanılır</td></tr><tr><td>Dahili indirgeme PEEK Birliği (1/16 "ila 1/32")</td><td>Valco</td><td>ZRU1.5FPK</td><td>Bu birleşim 250 & mikro'yu bağlamak için kullanılır; l 5 & mikroyu yüklemek için mikroreaktöre şırınga; m parçacık bulamacı</td></tr><tr><td>Paslanmaz çelik rakor (1/16 ")</td><td>Valco</td><td>ZU1XC</td><td>Paslanmaz çelik rakor, cam şırınga iğnesini infüzyon kılcal</td></tr><tr><td>Mikro hacimli PEEK Tee konektörüne (1/32")</td> bağlamak için kullanılır.<td>Valco</td><td>MT.5XCPK</td><td>Peek tee, numune transfer kılcalını kılcal mikro reaktöre bağlamak için kullanılır; yan kolunda, Pt telinin takılmasını sağlar</td></tr><tr><td>Tee konektörü (hafif)</td><td>Valco</td><td>C-NTXFPK</td> Bu Tee konektörü, numune transfer hattı Pt kablosu (0.404 mm) <td>aracılığıyla mikroakışkan çipe ESI voltajı uygulamak için kullanılır.VWR</td></tr> <tr><td></td><td></td><td>66260-126</td><td>Pt teli, ESI üretimi için elektrik bağlantısı sağlar ve kütle spektrometresi ESI güç kaynağı</td></tr><tr><td>PTFE borusuna (1/16") bağlanır. OD)</td> <td>Valco</td><td>TTF115-10FT</td><td>Teflon boru, şırınga iğnesi ile paslanmaz çelik rakor arasında hava geçirmez bir bağlantı sağlamak için kullanılır&nbsp;</td></tr><tr><td>PEEK boru (0.015" Kimlik x 1/16 inç OD)</td> <td>Upchurch Scientific</td><td>1565</td><td>Peek boru, paslanmaz çelik rakor ile 50&nbsp arasında hava geçirmez bir bağlantı sağlamak için bir manşon olarak kullanılır; &mikro; m ID transfer kılcal</td></tr><tr><td>PEEK hortumu (0.015" Kimlik x 1/32" OD)</td> <td>Valco</td><td>TPK.515-25</td><td>Peek boru, erimiş silika kılcal damarlar ile Peek Tee Temiz kesim polimer boru kesici Valco JR-797 arasında sızıntısız bir bağlantı sağlamak için bir manşon olarak kullanılır</td></tr> Bu <tr><td></td><td></td><td></td><td>kesici, 1/16" ve 1/32' önceden kesmek için kullanılır ~ 4-5 cm uzunluğunda parçalar halinde sızdırmaz bağlantılar için manşon olarak kullanılan peek polimer boru</td></tr><tr><td>Amber flakon (2 ml)</td> <td>Agilent&nbsp;</td><td>HP-5183-2069</td><td>Şişeler, numune çözeltilerini ve C18 parçacık bulamacını hazırlamak için kullanılır;</td></tr><tr><td>Amber flakon (4 ml)</td><td>VWR</td><td>66011-948</td><td>Şişeler numune çözeltileri hazırlamak için kullanılır</td></tr><tr><td>Polipropilen tüp (15&nbsp; ml)</td><td>Fisher</td><td>12-565-286D</td><td>Şişeler tampon çözeltileri hazırlamak için kullanılır</td></tr><tr><td>Silindir (100 ml)</td><td>VWR</td><td>24710-463</td><td>Silindir, çözücü hacimlerini ölçmek için kullanılır</td></tr><tr><td>Silindir (10 ml)</td><td>VWR</td><td>24710-441</td><td>Silindir, çözücü hacimlerini ölçmek için kullanılır</td></tr><tr><td>Pipet uçları (1.000 & mikro; l)</td> <td>VWR</td><td>83007-386</td><td>Pipet uçları, küçük hacimli numune çözeltilerini ölçmek için kullanılır</td></tr><tr><td>Pipet uçları (100 ve mikro; l)</td> <td>VWR</td><td>53503-781</td><td>Pipet uçları, küçük hacimli numune çözeltilerini ölçmek için kullanılır</td></tr><tr><td>Pipet uçları (10 & mikro; l)</td><td>VWR</td><td>53511-681</td><td>Pipet uçları, küçük hacimli numune çözeltilerini ölçmek için kullanılır</td></tr><tr><td>: Cam yüzeyler,</td><td>Nanofilm</td><td>B270, beyaz taç, 3" x 3"</td><td>Bunlar, mikroçip üretimi için cam yüzeylerdir</td></tr><tr><td>Erkek somun bağlantısı (1/16")</td><td>Upchurch</td><td>P203X</td><td>Bu bağlantı parçası, transfer kılcal damarlarını mikroakışkan çipe bağlamak için kullanılır</td></tr><tr><td>Nanoport montajı</td><td>Upchurch</td><td>N-122H</td><td>Bu bağlantı parçası, transfer kılcal damarlarını mikroakışkan çipe bağlamak için kullanılır</td></tr><tr><td>Protein standartları</td><td>Sigma</td><td>Multiple #</td><td></td></tr> <tr><td>Asetonitril, HPLC sınıfı</td><td>Fisher</td><td>A955</td><td></td></tr><tr><td>Metanol, HPLC sınıfı</td><td>Fisher</td><td>A452</td><td></td></tr><tr><td>İzopropanol, HPLC sınıfı</td><td>Sigma</td><td>650447</td><td></td></tr><tr><td>Trifloroasetik asit</td><td>Sigma</td><td>302031</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum bikarbonat</td><td>Aldrich</td><td>A6141</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin, sıralama sınıfı</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr></tbody></table>

bir akış oranı mikroreaktör ms algılama proteinlerin hızlı enzimatik işlenmesi

Fast Enzymatic Processing of Proteins for MS Detection with a Flow-through Microreactor

kütle spektrometrisi (MS) büyük çoğunluğu, protein analiz yöntemleri, tipik olarak tripsin ile, saptama için enzimatik sindirim aşamasından önce dahil tabanlı. Bu adım, kütle spektrometrisi enstrümantasyon etkili tarama aralığı içinde MW &lt;3.000-4.000 Da genellikle, küçük molekül ağırlıklı peptid üretimi için gereklidir. Geleneksel protokoller 37 ºC&#39;de O / N enzimatik sindirim içerir. Son gelişmeler, tipik olarak, örneğin, mikrodalga ya da yüksek immobilize enzim ya da bir kaç dakika için proteolitik sindirimi için gerekli zamanı azaltmak tamamlayıcı fiziksel işlemler (bir dizi bir mikroreaktör kullanılmasını içeren, farklı stratejiler, gelişmesine yol açmıştır baskı). Bu çalışmada, bir proteinin hızlı bir enzimatik sindirim elde etmek için herhangi bir laboratuvar uygulanabilir basit ve maliyet-etkin bir yaklaşımı açıklar. Protein (veya protein karışımı) C18-bağlanmış ters fazlı yüksek perf üzerine emdirilirbir kılcal sütununda önceden sıvı kromatografisi (HPLC), silis parçacıkları sergilemiş ve sulu tampon içinde tripsin kısa bir süre için parçacıklar üzerinde demlenir. on-line MS algılanmasını sağlamak için triptik peptidler MS iyon kaynağı, doğrudan artan bir organik içeriğe sahip olan bir çözücü sistemi ile elüt edilmiştir. Bu yaklaşım, yüksek fiyatlı immobilize enzim parçacıklarının kullanımını önler ve işlemi tamamlamak için herhangi bir yardım gerektirmez. Protein sindirimi ve tam bir örnek analizleri sırasıyla ~ 30 dakika az 3 ~ daha dk gerçekleştirilebilir ve yapılabilir.

Proteolitik sindirim işleminin temsili bir sonuç, yukarıda tarif edilen mikroreaktörlerde (Şekil 1 ya da 2), Tablo 1 &#39;de verilmektedir sahip bir protein karışımı, eşzamanlı olarak gerçekleştirilir. Tablo belirli bir protein tespit benzersiz peptid dizilerini ihtiva eder, çapraz korelasyon skoru (Xcorr) (yani, ilgili tandem kütle spektrumunda deneysel-to-teorik maçın kalitesini karakterize bir skor), cevapsız bölünmeler sayısını, peptid şarj ...

Bir elektrosprey iyonizasyon (ESI) kütle spektrometresine bağlı, şirket içi yerleşik akışlı triptik mikro reaktör ile proteolitik sindirim için hızlı bir protokol sunulmaktadır. Mikroreaktörün üretimi, deney düzeneği ve veri toplama süreci anlatılmaktadır.

Bir akış oranı mikroreaktör MS Algılama Proteinlerin hızlı enzimatik işlenmesi

The vast majority of mass spectrometry (MS)-based protein analysis methods involve an enzymatic digestion step prior to detection, typically with trypsin. ...

Bu protokolün genel amacı, elektrospray iyonizasyonlu kütle spektrometresi ile protein tanımlamasını mümkün kılmak için proteinlerin hızlı enzimatik sindirimini gerçekleştiren, akıştan geçirmeli bir tripsik mikroreaktörün hazırlanmasını tanımlamaktır. Bu yöntem, yapı ve fonksiyonun aşağı yönlü karakterizasyonunu desteklemek amacıyla, izole edilmiş ve saflaştırılmış proteinlerin amino asit diziliminin gösterilmesine yardımcı olabilir. Bu protokolün temel avantajı; hızlı, maliyet etkin olması ve mikro-fabrikasyon platformlarını kullanan iş akışlarına entegre edilmeye uygun olmasıdır.Başlamak için, cam kılcal boru kesici kullanarak büyük cam kılcal boruyu yedi ila sekiz santimetre, küçük olanı ise üç ila beş santimetre uzunluğunda kesin. Her iki kılcal boru ucunun da çıkıntılı çapaklar olmadan temiz ve düz bir şekilde kesildiğini doğrulamak için bir mikroskop kullanın. Küçük kılcal boruyu, büyük olanın bir ucuna yaklaşık altı milimetre girecek şekilde yerleştirin.Ardından, kapilerlerin birleşim yerine bir kulak çubuğuyla küçük bir damla yapıştırıcı uygulayın ve yapıştırıcının oda sıcaklığında bir gece boyunca kürlenmesini bekleyin. Daha sonra, yerleştirilen kapileri yaklaşık 10 ila 15 milimetre uzunluğunda kesin. Bu uç, elektrospray iyonizasyon yayıcısı olarak görev yapacaktır.Daha geniş çaplı kapiler borunun diğer ucunu, önceden dört ila beş santimetre uzunluğunda kesilmiş ve bir PEEK birleşim parçasına bağlanmış 1/32 inçlik PEEK tüpün içine yerleştirin. Ardından, beş santimetre uzunluğundaki 1/16 PTFE boru parçasını birleşim parçasının karşı ucuna yerleştirip sıkın. Temiz ve kuru iki mililitrelik bir cam vial içerisinde dört miligram C18 partikülünü tartın ve ardından 0.5 mililitre izopropanol ekleyin.Şişeyi kapatın. Parçacıkları çözelti içinde eşit şekilde dağıtmak için ultrasonik banyoya yerleştirin ve sonikasyon uygulayın. Ardından, C18 süspansiyonundan 200 µL çekmek için 250 µL'lik bir şırınga kullanın.Şırıngayı 1/16 inçlik PTFE tüpe yerleştirin ve bulamacı yavaşça büyük kapilere aktarın. Kapiler partiküllerle dolana kadar mikroskop altında gözlemleyin; iki ila üç milimetrelik bir partikül paketlemesi elde edilene kadar devam edin. Daha küçük olan kapiler tüp, kilit taşı etkisi (keystone effect) aracılığıyla bu partikülleri mikroreaktör içerisinde tutar.Son olarak, mikroreaktörü 50 µL su ve asetonitril'den oluşan %50-50'lik bir çözeltiyle, ardından 49 µL su ve 1 µL asetonitril içeren 50 µL'lik bir çözeltiyle durulayın. Kapiler mikroreaktörü PEEK birleştiriciden ayırın ve bir PEEK-T'ye bağlayın. Ardından, sızdırmaz bir bağlantı sağlamak için 1/32 inçlik bir PEEK kılıf ile izole edilmiş, iki santimetre uzunluğundaki bir platin teli PEEK-T'nin yan koluna yerleştirin.Yarım metre uzunluğundaki bir numune transfer kılcal borusunu PEEK-T'nin karşı ucuna bağlayın. Sızdırmaz bir bağlantı sağlamak için 1/32 inçlik bir PEEK kılıf kullanın. PEEK-T'yi XYZ tablası üzerine sabitleyin.Ardından, elektrospray iyonizasyon emitörünü kütle spektrometresi giriş kılcal borusundan yaklaşık iki milimetre uzağa yerleştirin. Daha sonra, platin teli kütle spektrometresinin elektrospray iyonizasyon güç kaynağına bağlayın. Ayrıca, sızdırmaz bir bağlantı sağlamak için 1/16 inçlik bir PEEK kılıf kullanarak, numune transfer kılcal borusunun karşı ucunu paslanmaz çelik birleşim parçasına bağlayın.Ardından, 4 ila 5 cm uzunluğundaki 1/16 inçlik bir PTFE boru parçasını paslanmaz çelik birleştirmenin karşı ucuna bağlayın. Eşzamanlı MS veri toplama parametrelerini, beraberindeki metin protokolünde açıklandığı şekilde MS cihazını kontrol eden yazılım paketine girin. Analiz işlemini gerçekleştirmek için kurulumu hazırlamak amacıyla bunları bir yöntem dosyası olarak kaydedin.LTQ MS sistemi, kütle spektrometresinin çeşitli numune giriş yöntemleriyle arayüzlenmesini sağlayan, kendi yapımımız bir XYZ tablasını içeren modifiye edilmiş bir ESI kaynağı ile donatılmıştır. 2% asetonitril içinde çözünmüş 50 millimolar bikarbonat içeren sulu bir çözelti ile 250 microliter'lık bir şırıngayı doldurun. Ardından, şırıngayı mikroreaktöre bağlayın ve şırınga pompasının altına yerleştirin.Analize hazırlamak için mikroreaktörü beş dakika boyunca dakikada iki mikrolitre hızla durulayın. Ardından, ilgili protein örneğini 250 mikrolitrelik bir şırıngaya yükleyin ve örnek çözeltisini beş dakika boyunca dakikada iki mikrolitre hızla infüze edin. Sonrasında, beş mikromolar trypsin çözeltisi yüklü 250 mikrolitrelik bir şırıngayı şırınga pompasının altına yerleştirin ve mikroreaktör üzerindeki adsorbe proteinin üzerinden bir ila üç dakika boyunca dakikada iki mikrolitre hızla infüzyon gerçekleştirin.Her deneyden önce tripsin çözeltisinin taze olarak çözdürülmesi ve hazırlanması kritik önem taşır. Bu işlem, protolitik enzimin aktivitesini ve mikroreaktörün yaklaşık 8 olan operasyonel pH değerini korumasını sağlayacaktır. Başka bir 250 microliter şırıngayı, %2 acetonitrile'e eklenmiş %0,1 trifluoroacetic acid içeren sulu bir çözelti ile doldurun.Mikroreaktörü beş dakika boyunca dakikada iki mikrolitre hızla yıkayarak proteolitik sindirim sürecini durdurmak için bu çözeltiyi kullanın. Ardından, %50 acetonitrile içeren %0,1 trifluoroacetic acid ile doldurulmuş bir şırıngaya geçiş yapın ve Elektrospray İyonizasyon voltajını yaklaşık 2000 volt değerine getirerek MS Veri Toplama Sürecini başlatın. Protein sindirim ürünlerini mikroreaktörden 20 ila 30 dakika boyunca dakikada 300 nanolitre hızla elüe etmeye başlamak için asitlendirilmiş çözeltiyi kullanın.Ekli metin protokolünde verilen veri toplama parametrelerini kullanarak kütle spektrometrisi verilerini elde edin. LTQ MS ham dosyalarını, önce ham verileri arama motoruna yükleyerek minimum düzeyde redundant bir protein veri tabanı kullanarak işleyin. Ardından, ana ve fragman iyon kütle toleranslarını sırasıyla iki ve bir dalton olarak ayarlayın ve arama için en fazla iki kaçırılmış bölünme içeren yalnızca tam tripsitik fragmanları kullanın.Ek olarak, yüksek ve orta güvenilirlikli yanlış keşif oranlarını sırasıyla %1 ve %3 olarak ayarlayın ve özellikle belirli modifikasyonlar aranmadığı sürece translasyon sonrası modifikasyonlara izin vermeyin. Son olarak, yalnızca yüksek güvenilirlikli peptit eşleşmelerini seçmek için verileri filtreleyin. Burada, mikroreaktörde proteolize tabi tutulmuş bir protein karışımından üretilen tripsik peptitlerden oluşan bir kütle spektrumu gösterilmektedir.Bu etiketler, en yoğun tripsik peptid iyonlarını temsil eder ve bunların dizilimini ve ilgili protein tanımlayıcısını sağlar. Bu mikroreaktör, proteinlerin enzimatik sindirimini gerçekleştirmek için uygulanması kolay bir deney düzeneği sunar ve 30 dakikanın altında bir sürede kütle analizi ve tanımlama yapılmasına olanak tanır. Bu prosedür uygulanırken, çözeltilerle temas eden flakonların ve enstrümantasyonun temizliğinin korunmasının, numune kontaminasyonunu önlemek için kritik olduğunu hatırlamak önemlidir.Bu prosedürün ardından, generatif peptitlerin daha iyi karakterize edilmesini sağlamak ve proteinlerin yapısıyla ilgili ek soruları yanıtlamak için diğer kütle spektrometrisi veri toplama yöntemleri kullanılabilir. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, proteonomik alanındaki araştırmacıların protein analizi için daha hızlı protokoller geliştirmesine ve biyolojik örneklerin yüksek verimli incelenmesine olanak tanıyan yeni mikrofalitik platformların geliştirilmesini araştırmalarına zemin hazırlamıştır. Bu teknik, 25 ila 50 peptit üreten oldukça basit protein karışımlarının analizi ile sınırlıdır.Bu peptitler, basit infüzyon deneyleri ile analiz edilebilir ve MS analizinden önce sıvı kromatografik ayırma gerektirmezler. Organik çözücülerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken açık alevlerden kaçınmak gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.

fast-enzymatic-processing-proteins-for-ms-detection-with-flow-through

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Elektrik alanların uygulama tarafından bir dizi elektrot - Dijital Mikroakiskan ayrık damlacıklar (ml ~ nL) manipülasyon ile karakterize bir tekniktir. Hızlı, sıralı, minyatür otomatik biyokimya testleri yürütmek için çok uygundur. Burada, birkaç proteomik işlem adımlarını otomatik olarak yetenekli bir platform raporu.

Otomatik Proteomik İşleme Dijital Mikroakiskan

Bu çalışmada biz ~ 8 μs iki çözüm karıştırma yeteneğine sahip mikroakışkan mikser imalat ve kullanımının açıklanması. Ayrıca UV floresan ve floresan rezonans enerji transferi (FRET) kullanarak spektroskopik tespiti ile bu karıştırıcı kullanımını göstermektedir.

Protein Katlama Öğrenmenin mikroakışkan Mikserler

Uyumlu esneklik proteini fonksiyonunda önemli bir rol oynamaktadır. Burada, düzenli ve düzensiz protein işlevi sürücü hızlı yapısal değişiklikleri algılama için hidrojen döteryum değişimi bağlanmış zamana bağımlı elektrosprey iyonizasyon kütle spektrometresi kullanılmasını tarif eder.

Zaman çözülmesi elektro sprey iyonizasyon Hidrojen-döteryum Değişim Kütle Spektrometre Protein Yapısı ve Dinamikleri incelenmesi için

Burada montaj ve demontaj biolayer Interferometry (BLI) kullanarak şarbon toksini izlemek için bir iletişim kuralı mevcut. Montaj/demontaj biyoalgılayıcı yüzeyinde, büyük protein kompleksleri yüzey Görselleştirme ve elektron mikroskobu ve kütle spektrometresi, sırasıyla kullanarak kompleksleri bileşenlerinin tanımlaması için serbest bırakılır.

Dinamik Protein kompleksleri analiz monte ve kütle spektrometresi ve Elektron Mikroskopisi kullanılarak Biolayer Interferometry biyoalgılayıcı--dan serbest bırakmak

Burada, kütle spektrometresi için numunelerin hazırlanması için bir on-membran sindirim tekniği için bir protokol sunuyoruz. Bu teknik, protein-protein etkileşimlerinin uygun analizini kolaylaştırır.

Bir on-membran sindirim tekniği kullanılarak protein-protein etkileşimlerinin değerlendirilmesi

Elektrowetting tabanlı dijital mikroakışkan, manipülasyonunu kolaylaştırmak için mikrolitre hacimli damlacıkların görünür temas açısında voltaj güdümlü bir değişiklik kullanan bir tekniktir. Bunu fonksiyonel manyetik boncuklarla birleştirmek, enzime bağlı İmmünosorbent Test (ELISA) kullanılarak numune hazırlama ve patojenlerin tanımlanması için birden fazla laboratuvar ünitesi operasyonunun entegrasyonunu sağlar.

Otomatik Enzimbağlantılı İmmünosorbent Assay için Elektrowetting tabanlı Dijital Mikroakışkanplatformu

Lanthipeptide sentezleri peptit doğal ürünlerin biyosentezi sırasında katalizör multistep reaksiyonları. Burada, lanteptid sentezlerinin konformasyonel dinamiklerini ve peptit doğal ürün biyosentezinde yer alan diğer benzer enzimleri incelemek için bunların kullanılabileceği sürekli, aşağıdan yukarıya, hidrojen-döteryum değişim kütle spektrometresi (HDX-MS) iş akışını açıklıyoruz.

Peptit Biyosintetik Enzimleri Araştırmak için Hidrojen-Döteryum Değişim Kütle Spektrometresi (HDX-MS) Platformu

Protokol, klinik örneklerden elde edilen proteinlerin Çoklu Reaksiyon İzlemesi (MRM) için üçlü dörtlü kütle spektrometresi kullanımını sağlamayı amaçlamaktadır. Alınması gereken tüm önlemlerle klinik numuneler için numune hazırlamadan veri analizine kadar sistematik bir iş akışı sağladık.

İnsan Beyin Dokusundan Proteinlerin Çoklu Reaksiyon İzleme Tabanlı Tespiti Kullanılarak Nicel Proteomik İş Akışı

Proteinlerin hücre içi hızlı fotokimyasal oksidasyonu (IC-FPOP) adı verilen bir protein ayak izi tekniği kullanılarak yerel hücre ortamındaki protein yapısını ve etkileşim alanlarını karakterize etmek için yeni bir statik platform kullanılır.

Hareketli XY Stage ile Platform İnkübatörü: Proteinlerin Hücre İçi Hızlı Fotokimyasal Oksidasyonunu Uygulamak İçin Yeni Bir Platform

Monomerik alfa-sinükleinin yapısal topluluğu fizyolojik fonksiyonunu ve fizikokimyasal özelliklerini etkiler. Mevcut protokol, fizyolojik koşullar altında bu içsel olarak düzensiz proteinin monomeri hakkında konformasyonel bilgileri belirlemek için milisaniye hidrojen / döteryum değişim kütle spektrometrisinin ve müteakip veri analizlerinin nasıl gerçekleştirileceğini açıklamaktadır.

Fizyolojik Koşullar Altında Alfa-Sinüklein Yapısal Dinamiğinin İncelenmesi için Milisaniye Hidrojen / Döteryum Değişim Kütle Spektrometresi

Burada, kimyasal problar ve kütle spektrometrisi kullanarak doğal hücrelerden ve dokulardan hastalığa özgü protein-protein etkileşimlerinin yakalanmasını ve tanımlanmasını sağlamak için bir protokol sunuyoruz. Ortaya çıkan etkileşim veri kümeleri, dinamik ağ işlev bozukluklarını ve hastalıkla bağlantılı yol değişikliklerini ortaya çıkarmak için özel bir web tabanlı platform aracılığıyla analiz edilir.

Hastalıkta İşlevsel Olmayan Protein-Protein Etkileşimlerinin Haritalanması

Öğrenin, akış oranı mikroreaktör kullanarak proteinlerin hızlı enzimatik sindirimini ve kütle spektrometrisiyle tanımlanmasını. Bu yöntem, proteomik araştırmalar için hızlı ve uygun maliyetli bir çözüm sunar.

Bir akış oranı mikroreaktör MS Algılama Proteinlerin hızlı enzimatik işlenmesi

Daha fazla video keşfet