Ayıklama ve çözümleme katekoiamin nörotransmitter ve onların metabolitleri yüksek basınçlı sıvı Kromatografi ile uygun bir yöntem

Bu prosedürün genel amacı, elektrokimyasal algılamalı yüksek basınçlı sıvı kromatografisine bağlı uygun bir katı faz ekstraksiyonu yoluyla bebeğin idrarındaki üç monoamin nörotransmiterini ve bunların iki metabolitini aynı anda belirlemektir. Bu yöntem, kısa sürede kolay kullanım ile eksiksiz bir numunedeki kararsız hedef bileşikleri tahmin edebilir ve belirleyebilir. Numuneleriniz, dar bir elyaf dolgulu katı yüzey çekirdeği ile kolayca önceden temizlenebilir ve numunedeki analitler kolayca zenginleştirilebilir, çözülebilir ve bir elektrokimyasal algılama sisteminde algılanabilir.

Bu yöntem için ilk olarak, biyolojik sıvılardaki katekolamin nörotransmiterlerinin ekstraksiyonu ve analizinin, direnç fonksiyonunun ve ilgili hastalıkların değerlendirilmesinde kritik olduğunu fark ettiğimizde aklımıza geldi. Bu yönteme yeni olan kişiler mücadele edecektir çünkü ışığa maruz kalmaktan kaçınılmalı ve ön tedavi süresi mümkün olduğunca kısa olmalıdır. Prosedürü gösteren, laboratuvarımızdan iki doktora öğrencisi olan Lanlan Wei ve Qing Han var.

Başlamak için, bileşiğin iki miligramını bir mililitre damıtılmış suya çözerek mililitre stok DPBA çözeltisi başına iki miligram hazırlayın. Çözeltiyi karanlıkta dört santigrat derecede saklayın. Analit genişleticileri hazırlarken, katekolaminlerin kimyasal yapısının ve özelliklerinin kararsız olduğunu ve kolayca ayrıştıkları için hazırlama işlemi genişleticilerinin çok hızlı olması ve ince güneş ışığına maruz kalmaktan kaçınılması gerektiğini unutmayın.

Ayrı 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerinde 1.0 miligram norepinefrin, epinefrin, dopamin, MHPG, DOPAC ve dahili standart DHBA tartın. Litre başına 0.01 mol hidroklorik asit çözeltisi içinde çözülmesi gereken epinefrin hariç bileşiklerin her birini çözmek için 1.0 mililitre damıtılmış su ekleyin. Hazırlanan standartları karanlıkta, analitler tamamen çözünene kadar yüksek hızda salın.

Bunlar birincil stoklardır ve eksi 20 santigrat derecede birkaç haftaya kadar saklanabilir. Norepinefrin, epinefrin, dopamin, DOPAC ve MHPG'nin ikincil analit stoklarını hazırlamak için, her bir birincil analit stokunun beş mikrolitresini ayrı beş mililitrelik santrifüj tüplerinde 4.975 mikrolitre damıtılmış suya aktarın. Bu çözeltileri günlük olarak taze olarak hazırlayın ve kullanılana kadar karanlıkta dört santigrat derecede saklayın.

DHBA için, beş mikrolitre birincil stoğu beş mililitrelik bir santrifüj tüpünde 4.995 mikrolitre damıtılmış suya aktarın ve karanlıkta dört santigrat derecede ayrı ayrı saklayın. Standart bir eğri oluşturmak için ikincil analit stoğu ile daha fazla seyreltme yapın. Solüsyonları karanlıkta dört santigrat derecede saklayın ve her gün taze olarak hazırlayın.

Ardından, uygun konsantrasyona sahip standart stoğu kullanarak ECD dedektörünün optimum voltajını test edin. Analitlerin en iyi tepe görünümüne sahip olduğu bir değer bulmak için voltajı değiştirin. 10 mililitre eluent çözücü hazırlamak için 5,5 mililitre damıtılmış su kullanın, ardından suya damla damla 1,5 mililitre asetonitril ve üç mililitre fosforik asit ekleyin.

Mobil fazı hazırlamak için, metin protokolünde listelenen bileşenleri temiz bir litrelik şişeye ölçün. 1.000 mililitreye 40 mililitre asetonitril ve damıtılmış su ekleyin. Çözeltideki madde tamamen eriyene kadar 15 dakika boyunca ultrasonik olarak çalkalayın ve titreştirin.

Cam elektrotlu bir pH metre kullanarak, mobil fazın pH değerini doymuş bir sodyum-hidroksit çözeltisi ile 4.21'e ayarlayın. Mobil fazı, safsızlıkları gidermek için 0,45 mikron poliviniliden florür mikro gözenekli membran ve vakumlu emme cihazı ile filtreleyin. Her kullanımdan önce mobil fazın gazını almak için 15 dakika boyunca ultrasonik titreşim kullanın.

Daha sonra, çoğu partikül girişimini gidermek için idrar örneklerini oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 1.510 kez G'de girdaplayın ve santrifüjleyin. Süpernatanları toplayın ve daha fazla deney için tortuyu atın. Analitleri etkili bir şekilde çıkarmak için, santrifüjlemeden hemen sonra Paketlenmiş Elyaf Katı Faz Ekstraksiyonuna veya PFSPE ön işlemine geçin.

Nanofiberleri aktive etmek için, 100 mikrolitre metanol ve 100 mikrolitre suyu, beş mililitrelik bir şırınga kullanarak PFSPE kolonundan yavaşça damla damla bastırın. İdrar örneği, hidrofobikliğini iyileştirmek ve katekolaminlerin ve metabolitlerin lifler tarafından emilmesine yardımcı olmak için DPPA çözeltisi ile karıştırılmalıdır. DHBA çözümü de dahili standart olarak eklenmelidir.

100 mikrolitre idrar örneğini mililitre DPBA çözeltisi başına 100 mikrolitre iki miligram ve mililitre DHBA dahili standart çözeltisi başına 30 mikrolitre 100 nanogram ile 0.5 mililitrelik bir Eppendorf tüpünde karıştırın. Ardından, hava basıncının kuvvetini kullanarak karışık numune çözeltisini beş mililitrelik gaz tipi plastik bir şırınga ile PFSPE kolonundan bastırın. SPE kolonuna 100 mikrolitre DPBA solüsyonu yüklemek için beş mililitrelik gaz tipi plastik bir şırınga kullanarak kolonu üç kez süzün ve solüsyonu hava basıncıyla kartuştan yavaşça itin.

Bu durulama adımı gereklidir, çünkü DPBA çözeltisi analitler korunurken safsızlıkları giderebilir, böylece analitler için hassasiyeti ve seçiciliği artırabilir. Daha sonra, PFSPE kolonuna 50 mikrolitre eluent yükleyin ve elüatı 0,5 mililitrelik bir Eppendorf tüpü ile toplayarak kolondan itin. Sistemdeki havanın gazını almak için HPLC gaz gidericiyi açın.

Numune analizlerinden önce, temel gürültüyü dengelemek ve azaltmak için sistem mobil faz ile 0,5 saatten fazla çalışmalıdır. Otomatik bir örnekleyici kullanarak 20 mikrolitre elüattan numune alın ve ardından HPLC ECD sistemine enjekte edin. Çalıştırmalar tamamlandığında, dedektör arayüzünü kullanarak dedektör hücresini kapatın.

Cihaza zarar verebileceğinden dedektörün arkasındaki anahtarla hücreyi kapatmayın. Mobil faz bileşimini manuel olarak %10 metanol ve %90 su olarak değiştirin. En az 30 dakika çalıştıktan sonra, mobil fazı manuel olarak HPLC sınıfı metanol olarak değiştirin.

Metanolde korumak için sistemi yaklaşık 15 dakika çalıştırın. Bu adımın önerilen çalışma süresine göre çalıştırılmaması, sütuna ve dedektöre zarar verebilir. Akışı kapatın ve ardından gaz gidericiyi kapatın.

Metin protokolünde açıklandığı gibi katekolamin analizine devam edin. Çivili su numunesinin hedefler ve dahili standart ile kromatogramı ekstraksiyon yapılmadan gösterilir. Protokoldeki HPLC koşulu altında, PFSPE yönteminin beş hedef tepe noktası iyi ayrılmıştır ve ticari bir fenilboronik asit kartuşu tarafından ekstrakte edilenlerden önemli ölçüde daha yüksektir.

Ayrıca, PBA kartuşu çıkarma sonucunda DOPAC tepe noktası görünmedi, bu da PBA sütununun DOPAC'ı ayıklama yeteneğine sahip olmadığını gösterir. İdrar örneği çıkarıldığında, PFSPE yöntemi sadece iyi bir tepe tanımlaması ile hedefleri çıkarmakla kalmadı, aynı zamanda idrardaki girişimin çoğundan da kurtulabildi. Her bir bileşik için, düşük konsantrasyonla iyi doğrusallık gösteren tepe alanının oranı çizilerek kalibrasyon eğrileri oluşturuldu.

Gerçek idrar örnekleri ile doğrulama için, 28 yüksek riskli bebek ve 22 sağlıklı bebeğin idrar örnekleri test edildi. Bazı katekolaminler yüksek riskli ve sağlıklı gruplar arasında anlamlı olarak farklı olmasa da, yüksek riskli bebeklerde kontrol grubuna göre daha yüksek miktarda MHPG metaboliti vardı. Bu nedenle, idrar MHPG seviyesi, yüksek riskli bebeklerin erken teşhisi için potansiyel bir belirteç olabilir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik dakikalar içinde yapılabilir. Prosedürü denerken, külleri taze hazırlamayı, endişeyi hızlı çalıştırmayı ve doğrudan güneş ışığına maruz kalmayı önlemeyi unutmamak önemlidir. Absorpsiyon ve durulama adımlarında difenilborat-asit-çözelti ilavesi de kritik öneme sahiptir.

Bu prosedürü takiben, plazma veya beyin omurilik sıvısında katekolaminlerin ve metabolitlerin sonlandırılmamasını ölçer. Alsliver diğer biyolojik sıvıların test edilmesinde bu protokolün evrenselliğini belirlemek için yapılabilir. Geliştirildikten sonra, bu teknik, araştırmacıların nörogelişimsel eksiklikler ile çocuk örneklerinde idrar katekolamin seviyesi arasındaki ilişkiyi incelemesinin yolunu açtı.

Bu videoyu izledikten sonra, nair figürleri ve basit bir cihazla katı faz ekstraksiyon yönteminin nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız, PCE PS hava fibulleri kurumsal atık DPBA, idrar örneklerindeki katekolamin nörotransmiterlerinin temizlenmesine yardımcı olabilir. Bu teknik, bebeklerde beyin hasarı riski taşıyan cassis'in erken teşhisine kadar uzanır. Çünkü karşılaştırmalı analizde otizmli çocukların tekli MHPG'sinde anormal farklılıklar ortaya çıkmış, bu da katekolamin metabolitlerinin önemli bir aday belirteç olabileceğini göstermektedir.