Dilim yama klemp tekniği öğrenme kaynaklı plastisite analiz etmek için
November 11th, 2017
Dilim yama klemp tekniği içsel özelliklerini ve uyarıcı ya da inhibitör sinapslarda plastisite öğrenme kaynaklı değişiklikleri analiz etmek için etkili bir yöntemdir.
Merhaba, benim adım Dai Mitsushima. Burada, eğitimsiz hayvanlarda yama kelepçesi verilerini karşılaştırarak eğitimli hayvanlarda beyin dilimlerinin nasıl yapıldığını göstereceğiz. Öğrenmeye bağlı sinaptik plastisiteyi analiz edebiliriz.
Merhaba, benim adım Hiroyuki Kida. Bu deneyde, Rotor çubuk testi kullanılarak motor çalışmasının nöromekanizması araştırılmıştır. Rotor çubuğu testi, kemirgenlerin motor bilişini değerlendirmek için yaygın olarak kullanılmaktadır.
Bu yöntemin avantajı, döndürücü hızını artırarak test sırasında keşif seviyesini değiştirebilmemizdir. Rotor çubuğu testi. Motor görevinden önce, rotor çubuğu aparatı 300 saniye boyunca 4 ila 40 rpm arasında hızlanma moduna ayarlanmalıdır.
Sıçanlara her test için on deneme yapıldı. Denemeler arasındaki zaman aralığında 30 saniye idi. İlk eğitim seansı sırasında, fareler genellikle düşük hızlarda bile çubuktan düşer ve bazen yanlış yönde yürürler.
Bununla birlikte, eğitimi tekrarladıktan sonra, sıçan daha yüksek bir hızda yürüyebilir. Çubuk üzerindeki gecikmeyi ölçerek, farenin becerinin öğrenme performansını tahmin edebiliriz. Burada rotor çubuğu testinin sonuçlarını görebiliriz.
Bu şekilde görüldüğü gibi motor becerinin kazanılması için iki günlük bir eğitim yeterlidir. İlk denemedeki gecikme ile karşılaştırıldığında, post hoc analiz, eğitim günlerinin son denemesinde önemli bir iyileşme gösterdi. Çubuk üzerindeki gecikmeyi ölçerek, farenin becerinin öğrenme performansını tahmin edebiliriz.
Ardından, size bir engelleyici kaçınma testi göstereceğiz. Bu test, bağlamsal öğrenme performansını analiz etmede yararlıdır. İnhibitör kaçınma aparatı, bir tuzak kapısı ile ayrılmış aydınlık ve karanlık taraflardan oluşur.
Eğitim seansı sırasında fareler ışıklı alana yerleştirilir ve ortama alışmaları için kısa bir süre verilir. Kapı açıldıktan sonra, fareler karanlık alana istedikleri zaman girmekte serbesttir. Karanlık alana girdikten sonra kapı kapatılır ve farelere iki saniye boyunca hafif bir elektrik şoku verilir.
Denemenin tamamlanmasının ardından 30 dakika boyunca kafeslerine geri döndürülen fareler, cihazın ışıklandırılan alanına tekrar yerleştirilir. Şoktan otuz dakika sonra, eğitimli sıçanlar karanlık alana girmeden önce sürekli olarak daha uzun bir gecikme gösterdi. Burada inhibitörden kaçınma testinin sonuçlarını görebiliriz.
Elektrik çarpmasından sonra, fareler karanlık alandan kaçınmayı ve normalde tercih etmeyecekleri ışıklı tarafta kalmayı öğrendiler. Karanlık taraftan kaçınma eğilimi, bağlamsal anıların edinildiğini gösterir. Eğitim sonrası beyin dilimleri.
Kesiden önce, tüm makasları, kanama durdurucuları ve beherleri kırılmış buzla soğutuyoruz. Burada diseksiyon için hazırlığımızı görebilirsiniz. Beyin diseksiyonu mümkün olduğunca çabuk yapılmalıdır.
Bu derin uyuşturmadan sonra, sıçan kırılmış buz içeren sığ bir tepsiye yerleştirilir ve karın boşluğunu açmak için bir kesi yapılır. Diyafram kesisinden sonra, başka bir yan kesi yapılır. Göğüs boşluğunu açmak için, kostal kıkırdak bir hemostat kullanılarak topaklanmalıdır.
Kalbi açığa çıkardıktan sonra, sol ventrikülün arka kısmına 18 gauge paslanmaz çelik bir iğne yerleştirilir. İğnenin ucu, aort duvarından görülebilmelidir. Sağ kulak kepçesi kesildikten sonra perfüzyona başlanır.
Hem iğnenin hem de şırınganın önce gazlı buz gibi soğuk diseksiyon tamponu ile doldurulduğundan emin olun. Herhangi bir hava kabarcığı da perfüzyondan önce çıkarılmalıdır. İlk olarak, kafatasının arka tarafını kesin.
Ardından yanal bir kesim yapın, ardından beyni ortaya çıkarmak için bir merkez kesim yapın. Diseksiyon sonrasında, beyin beş dakika boyunca köpüren buz gibi soğuk tampona yerleştirilmelidir. Diseksiyona devam etmeden önce, filtre kağıdı buz gibi soğuk tampon kullanılarak ıslatılmalıdır.
Daha sonra beyin buz gibi paslanmaz çelik bir sahneye yerleştirilir. Kesme aşamasının açısı, beyin dilimi için doğru bir kesme açısı sağlamak için çok önemlidir. Yanlış bir açı, hedef piramidal nöronları potansiyel olarak kesebilir.
Kırpma işleminden sonra, vibraton aşamasına bir damla süper yapıştırıcı yerleştirilmelidir. Sıkı yapışmayı sağlamak için, fazla diseksiyon tamponu bir parça filtre kağıdı kullanılarak çıkarılmalıdır. Vibraton kullanılarak, ince beyin dilimleri köpüren buz gibi soğuk bir tamponda muhafaza edilebilir.
Hedef alanımız primer motor kortekstir. Hedef beyin bölgesi İris makası kullanılarak kesilebilir. Arayüz haznesi plastik bir gıda kabı kullanılarak yapılabilir.
Arayüz odasının kapağı gazı tutmak için gereklidir. Dilimler bir kızılötesi-DIC mikroskobu kullanılarak gözlenir. Burada birincil motor kortekste Katman 2/3 nöronlarının bir örneğini görebiliriz.
Yama kayıt pipetleri uygun hücre içi solüsyon ile doldurulur. Akım kelepçesi analizi için çözüm, gerilim kelepçesi analizinden farklıdır. Temsili sonuçlar.
Mevcut kelepçe tekniği, içsel hücre özelliklerini analiz etmek için kullanışlıdır. Rotor rod eğitiminden sonra, primer motor korteksteki Layer 2/3 nöronlarından akım kelepçe verilerini elde edebildik. Panel A, akım enjeksiyonlarının neden olduğu tipik izleri gösterir.
Panel B, enjekte edilen akım ile sivri uç sayısı arasındaki ilişkiyi gösterir. Bir günlük eğitimli sıçanlar daha az sivri uça neden olurken, iki günlük eğitimli sıçanlar, eğitimsiz sıçanlara göre çok daha fazla sivri uça neden oldu. Alt panellerde görülebileceği gibi, bir günlük eğitimli sıçanlar daha düşük dinlenme potansiyeli, daha yüksek başak eşiği ve daha derin hiperpolarizasyon sonrası sergiledi.
İki günlük eğitimli sıçanlar daha yüksek dinlenme potansiyeli ve membran direnci sergiledi. Voltaj kelepçesi tekniği, öğrenmeye bağlı sinaptik plastisiteyi analiz etmek için kullanışlıdır. Burada, bağlamsal eğitimden sonra CA1 nöronlarından gelen verileri görebiliriz.
Tek glutamat veya GABA vezikülleri tarafından indüklenen CA1 nöronlarından minyatür post sinaptik akımlar elde ettik. Paneller A ve B, minyatür post sinaptik akımın temsili izlerini göstermektedir. Tetrodotoksin varlığında, eksi 16 milivoltta minyatür EPSC'ler ve sıfır milivoltta minyatür IPSC'ler aynı nöronlarda sırayla ölçüldü.
Panel C, minyatür EPSC ve minyatür IPSC genliklerinin eğitimsiz, eğitilmiş, eşleştirilmemiş ve geçişli sıçanlarda iki boyutlu grafiklerini gösterir. Panel D, minyatür frekansların çizimlerini gösterir. Alt panellerde görülebileceği gibi, bağlamsal eğitimler, nöronlara sinaptik girdilerin çeşitliliğini teşvik eden hem uyarıcı hem de inhibitör sinapsları önemli ölçüde güçlendirdi.
Özetle, akım kelepçesi tekniği, hücre özelliğindeki öğrenme kaynaklı değişiklikleri analiz etmek için kullanışlıdır. Ayrıca, voltaj-kelepçe tekniği, uyarıcı ve inhibitör sinapslarda öğrenmeye bağlı plastisiteyi analiz etmek için güçlü bir araçtır. Bu analizlerin ayrıntılı sonuçları aşağıdaki yayınlarda bulunabilir.
Genel Bakış
Bu makale, sinaptik özelliklerde ve plastisitede öğrenme kaynaklı değişiklikleri analiz etmek için slice patch clamp tekniğini gösterir. Çalışma, eğitimli sıçanlarda motor biliş ve bağlamsal öğrenmeye odaklanmaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Elektrofizyoloji
- Davranış Analizi
Arka Plan
- Slice patch clamp tekniği, sinaptik fonksiyonu incelemek için kritik öneme sahiptir.
- Motor biliş, rotor çubuk testi kullanılarak değerlendirilebilir.
- Bağlamsal öğrenme, inhibitör kaçınma testleri aracılığıyla değerlendirilir.
- Sinaptik plastisiteyi anlamak, öğrenme mekanizmalarına ilişkin bilgiler için gereklidir.
Çalışmanın Amacı
- Sıçanlarda öğrenme kaynaklı sinaptik plastisiteyi analiz etmek.
- Eğitilmiş ve eğitilmemiş hayvanlar arasındaki sinaptik özellikleri karşılaştırmak.
- Motor koşuyun nöromekanizmasını araştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Motor beceri edinimini değerlendirmek için rotor çubuk testi.
- Bağlamsal bellek analizi için inhibitör kaçınma testi.
- Beyin dilimi hazırlığı ve patch clamp kayıtları.
- Sinaptik aktiviteyi analiz etmek için akım ve voltaj clamp teknikleri.
Ana Sonuçlar
- İki günlük eğitim, motor beceri performansını önemli ölçüde geliştirmiştir.
- Eğitilmiş sıçanlar, eğitilmemiş sıçanlara göre daha iyi sinaptik özellikler sergilemiştir.
- Akım clamp verileri, eğitilmiş sıçanlarda artan süspansiyon aktivitesi göstermiştir.
- Voltaj clamp sonuçları, minik postsinaptik akımlarda değişiklikler olduğunu göstermiştir.
Sonuçlar
- Çalışma, slice patch clamp tekniğinin etkinliğini doğrulamaktadır.
- Eğitim, hem motor becerileri hem de sinaptik plastisiteyi artırır.
- Bu bulgular, öğrenmenin sinirsel temelini anlamaya katkıda bulunur.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
The slice patch clamp technique enables direct measurement of learning-induced changes in neuronal excitability and synaptic strength, providing mechanistic insights into neural circuit adaptation. This approach supports target validation in neuroscience drug discovery by linking behavioral phenotypes to cellular and synaptic phenotypes. It enhances predictive confidence in early discovery by de-risking hypotheses about compound effects on plasticity-related pathways.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring changes in resting membrane potential, spike threshold, and membrane resistance in trained versus untrained neurons.
- Scientific Value: Clarifies pathway involvement by demonstrating learning-induced increases in spiking activity in layer II/III pyramidal neurons of motor cortex.
- Scientific Value: Supports biological de-risking by quantifying synaptic plasticity at both excitatory and inhibitory synapses in hippocampal CA1 neurons following contextual learning.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems (acute brain slices) for downstream assessment of compound effects on intrinsic and synaptic neuronal properties.
- Scientific Value: Enables assay standardization through sequential recording of mEPSCs and mIPSCs from the same neuron, reducing variability in synaptic strength measurements.
- Scientific Value: Provides quantitative outputs (amplitude, frequency of postsynaptic currents) that support reliable compound evaluation in phenotypic screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates disease-relevant system utility by modeling learning-induced plasticity in motor cortex and hippocampus, regions relevant to cognitive and motor disorders.
- Scientific Value: Ensures translational continuity from behavioral training (rotor rod, inhibitory avoidance) to cellular readouts, supporting mechanism-based target validation.
- Scientific Value: Facilitates risk-adjusted advancement decisions by identifying compounds that normalize learning-induced hyperactivity or synaptic imbalance.
Pipeline & Workflow Integration
The technique integrates into the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification, particularly for targets modulating neuronal excitability or synaptic transmission.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by comparing neuronal properties between behaviorally trained and naive animals to validate target engagement.
- Screening: Delivers assay readiness via stable, reproducible whole-cell patch clamp recordings in acute slices, enabling dose-response analysis of test compounds.
- Analytics: Generates key readouts including spike count, resting potential, membrane resistance, and mEPSC/mIPSC amplitude/frequency to quantify neuronal and synaptic responses.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by linking learning-induced synaptic changes to potential biomarkers of circuit dysfunction in neuropsychiatric disease models.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable electrophysiology platform applicable across brain regions (e.g., sensory cortex, amygdala) and learning paradigms, maximizing asset utilization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in how learning alters neuronal and synaptic function.
- Operational Value: Promotes standardization through defined slice preparation, perfusion, and recording protocols that enhance reproducibility across laboratories.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing direct electrophysiological evidence of target-mediated effects on plasticity pathways.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds that reverse pathological plasticity without disrupting baseline function.
Implementation Considerations
- Requires expertise in electrophysiology, brain slicing, and behavioral neuroscience to ensure data quality and interpretation.
- Dependent on instrumentation including vibratomes, patch clamp amplifiers, perfusion systems, and infrared-DIC microscopy for successful slice preparation and recording.
- Necessitates cross-team standardization between behavior, histology, and electrophysiology groups to align training paradigms with slice timing and region targeting.
- Involves adaptation considerations when applying the technique to different brain regions or neuron types, such as adjusting slice orientation or intracellular solution composition.
- Limited by the acute nature of brain slices, which restricts longitudinal studies but preserves native circuitry for ex vivo mechanistic analysis.
