Beyin dilimlerinde nöronların çalışması için otomatik görüntü yönlendirmeli Yama Kelepçesi Uygulaması
31 Temmuz 2017
Bu protokol, standart in vitro elektrofizyoloji ekipmanı için yakın zamanda geliştirilen bir sistemi kullanarak otomatik görüntü yönlendirmeli patch-clamp deneylerini nasıl yürüttüreceğinizi açıklamaktadır.
Bu teknolojinin genel amacı, floresan hücreleri otomatik olarak tespit etmek ve bu hücrelerin akut beyin dilimlerinde otomatik yama kelepçesi gerçekleştirmek için bilgisayar görüşünü kullanmaktır. Bu yöntem, floresan etiketli hücrelerin tanımlanması, hedeflenmesi ve yama kelepçesi gibi yama kelepçesi elektrofizyolojisi alanındaki temel zorlukların üstesinden gelmeye yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, yama pipetlerini, floresan hücreleri otomatik olarak algılayabilmesi ve adımları otomatik yama kelepçesi ile entegre edebilmesidir.
Bu yenilik, deneysel verimi önemli ölçüde artırır. Bu tekniğin etkileri, nörolojik bozuklukların tedavisine veya teşhisine kadar uzanır, çünkü yüksek verimli görüntü kılavuzlu otomatik yama kelepçesi, daha fizyolojik nöronal preparatlarda farmakolojik taramalar için kullanılabilir. Bu yöntem aynı zamanda nöronal organel typic veya dilim kültürleri, ayrışmış nöronlar ve nöronal olmayan hücreler gibi diğer in vitro preparatlara da uygulanabilir.
Bu prosedüre başlamak için amplifikatörü, mikroskop denetleyicisini ve manipülatör denetleyicisini açın. Ardından, önce Autopatcher IG'nin kurulu olduğu dizini değiştirerek Autopatcher IG'yi bir komut satırı terminalinden python ile çalıştırın. Ardından, Python Autopatcher_IG yazın.
PYW komut satırı terminalinde ve enter tuşuna basın. Bundan sonra, tüm cam pipeti dahili solüsyonla doldurun ve kafa aşamasına yükleyin. Pipet ucunu mikroskobun görüş alanına getirin ve odak noktasına getirin.
Mikroskop aşamasında manipülatörleri hareket ettirmek için tuş takımı kullanılıyorsa, klavyede Z tuşuna basarak koordinatları güncelleyin. Birincil kalibrasyon, manipülatörün hareket açısını ve mesafesini mikroskop koordinat sistemine dönüştürür. Manipülatör, önceden ayarlanmış mesafe ile üç yönde hareket eder ve yazılım, mikroskop görüş alanı içindeki pipet ucunun koordinatlarını algılar.
Pipetin yüklendiği ilgili birim için ana GUI'deki kalibrasyonu başlat düğmesine tıklayın. Ardından, ana GUI'nin altındaki kalibrasyonu kaydet'e tıklayarak kalibrasyonu kaydedin. Bu birincil kalibrasyonun, makinenin fiziksel organizasyonu değiştirilmedikçe yalnızca bir kez yapılması gerekir.
Bu adımda, kayıt odasının ortasına bir beyin dilimi yerleştirin. Beyin dilimini bir dilim basılı tutun veya bir arp ile sabitleyin. Floresan hücreyi tespit etmek için, dört kat büyütme altında ilgilenilen alanı bulun.
Ardından, hareket ettirmek için tıkla modunu açarak mikroskop aşamasını hareket ettirin ve ilgilenilen alanın merkezine tıklayın. Alternatif olarak, mikroskop aşamasını hareket ettirmek için tuş takımını kullanın. Ardından, yüksek büyütmeli merceğe geçin ve tuş takımındaki RF'yi kullanarak mikroskobu Z ekseninde hareket ettirerek odağı ayarlayın.
Yazılım, mikroskobu ve kamerayı farklı derinliklerde bir dizi görüntü çekmeye yönlendirir. Daha sonra bu görüntüler, floresan etiketli hücreleri bulmak için bilgisayarla görme işlemine tabi tutulur. Son çıktı, algılanan hücre koordinatlarının bir listesidir.
Ana GUI sütun birimi sıfırdaki hücreyi algıla düğmesine tıklayın. Kurulumun LED'i veya lazer ışık kaynağı TTL sinyali ile kontrol edilemiyorsa, LED'i veya lazeri manuel olarak açın. Gerekirse LED'i veya lazeri kapatın.
Bellek konumları GUI'sinde hücre koordinatlarının bir listesi görünecektir. Koordinatların yanındaki X düğmesini tıklayarak istenmeyen hücreleri listeden kaldırın. Alternatif olarak, hedef hücreler floresan olarak etiketlenmemişse, ana GUI'de fare modunu tıklatın.
Ardından, ilgilendiğiniz hücreye tıklayın, hücrede bir sayı içeren sarı bir nokta belirecek ve hücrenin koordinatları bellek konumları GUI'sinde görünecektir. Pipet ofset koordinatlarını tespit etmek üzere ikincil kalibrasyon yapmak için bir cam pipetin 1/3'ünü dahili solüsyonla doldurun. Ardından, pipeti kafa aşamasına bağlı pipet tutucusuna yükleyin.
Düşük büyütmede, birinci ünite ile ikinci ünite arasında geçiş yapmak için tuş takımında bir ve iki kullanın. Ardından, pipeti görsel alana getirin ve tuş takımını kullanarak odağı ayarlayın. Ardından, yük kalibrasyonuna tıklayarak birincil kalibrasyonu yükleyin.
Mikroskop merceğini yüksek büyütme oranına getirin ve ana GUI'ye 40 kez tıklayın. Pipet ucunu merkeze getirin. Ardından, kullanımda olan birimin altındaki ana GUI'deki ikincil kalibrasyon düğmesine tıklayın.
Bir hedef hücreye yama yapmak için, yama kontrol GUI'sini açmak için yama kontrol düğmesine tıklayın. Bellek konumu GUI'sindeki koordinat listesinde ilgilenilen hücrenin yanındaki git düğmesine tıklayın. Ardından, hareketi etkinleştirmek için ana GUI'deki ünitenin CTM düğmesine tıklayın.
Pipet ucunu hücreye taşımak için ilgilendiğiniz hücreye tıklayın. Manipülatörün mekanik sınırlaması nedeniyle, 500 mikrometreden daha uzun mesafeye seyahat ederken, hafif bir konumlandırma hatası olabilir. Büyük bir mekanik konumlandırma hatasını önlemek için, hedef hücrenin yakınında ikincil kalibrasyon yapılmalıdır.
Ardından, giriş sinyalini iki ünite arasında değiştirmek için üniteyi seçilen bir düğmeyi kullanın. Yama kontrol GUI'sindeki yama düğmesine tıklayın. Otomatik yama işlemi başlar ve basınç ve direnç, yama kontrol GUI'sinde izlenebilir.
Otomatik yama algoritması, direnci izler ve bir gigaseal oluşturmak için bir dizi mantık döngüsü aracılığıyla basıncı kontrol eder. Bir açılır pencere, bir gigaseal oluşumunu bildirir. Sistem, hücre-yüzey temasını tanımak için direnç değişimini kullanır.
Hücre yüzeyi temasının zamanında tespit edilmemesi durumunda, aynı otomatik yama denemesinde kalırken yama aşamasını ilerletmek için sonraki düğmeyi kullanın. Yama kontrol GUI'sindeki ilgili düğmelere tıklayarak otomatik işlemi herhangi bir noktada manipüle edin. Ardından, birleşik Zap ve emme ile içeri girmek için evet'i seçin.
Alternatif olarak, yalnızca emme ile içeri girmek için hayır'ı seçin. Ardından, deneme yama günlüğünü kaydedin. Bu şekil, komut dizisi GUI'sine yüklenen seçili konumları gösterir.
Sol sütun koordinatların listesini, sağ sütun ise her konum için TTL sinyalleri biçimindeki komutların listesini gösterir. İlaç uygulama deneyi sırasında, seçilen üç konuma karşılık gelen ekran görüntüleri aşağıdadır. KCL çözeltisi, görselleştirme amacıyla kırmızı floresan boya ile karıştırıldı.
Birinci ünite KCL içeren pipet ve ikinci ünite yama pipetiydi. Bu şekilde, adım akım enjeksiyonları düzenli bir sivri nöron göstermektedir. Burada, üç yerde 500 milimolar potasyum klorür çözeltisinin yerel uygulamasından elde edilen voltaj kelepçesi kayıt izleri gösterilmektedir.
İçe doğru akıma sahip kırmızı iz, potasyum klorür uygulaması yama hücresine yakın olduğunda denemeden kaydedildi. Kırmızı ok, potasyum klorür uygulamasının zamanlamasını gösterir. Bu yöntemi kullanarak, manuel yama uygulamaya kıyasla kapsamlı bir eğitim olmadan dört dakika içinde bir yama kelepçesi denemesi gerçekleştirilebilir.
Bu prosedürü takiben, araştırma projenizle ilgili soruları yanıtlamak için optogenetik, kemogenetik ve farmakolojik manipülasyonlar gibi diğer yöntemler de gerçekleştirilebilir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, sinirbilim alanındaki araştırmacıların, farklı in vitro preparatlarda sinaptik reseptörler ve iyon kanallarının yüksek verimli çalışmalarını keşfetmelerinin yolunu açabilir. Bu videoyu izledikten sonra, görüntü kılavuzlu otomatik yama kelepçesi deneylerinin nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, gelişmiş bilgisayar görüşü teknolojisi kullanarak otomatik görüntü-yönlendirmeli patch-clamp deneyleri gerçekleştirmek için bir yöntem tanımlar. Bu yaklaşım, akut beyin dilimlerinde floresan etiketli hücreleri tanımlama ve hedefleme verimliliğini artırır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Elektrofizyoloji
- Nörobilim
- Görüntüleme Teknikleri
Arka Plan
- Patch-clamp elektrofizyolojisi, nöronal aktiviteyi incelemek için kritik öneme sahiptir.
- Belirli hücreleri tanımlamak ve hedeflemek zor olabilir.
- Otomatik teknikler deneysel verimliliği artırabilir.
- Floresan etiketleme, hücrelerin tanımlanmasına yardımcı olur.
Çalışmanın Amacı
- Patch-clamp deneyleri için floresan hücrelerin otomatik tespitini gerçekleştirmek.
- Elektrofizyolojik kayıtların verimliliğini artırmak.
- Nöronal preparatlarda farmakolojik taramayı kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Hücre tespiti için bilgisayar görüşü teknolojisi.
- Kayıt için otomatik patch-clamp kurulumu.
- Tespit ve kayıt süreçlerinin entegrasyonu.
- Çeşitli in vitro nöronal preparatlara uygulama.
Ana Sonuçlar
- Hücre tanımlama ve patch-clamping'in başarılı otomasyonu.
- Elektrofizyolojik deneyler için artırılmış verimlilik.
- Farmakolojik araştırmalarda potansiyel uygulamalar.
- Farklı hücre tiplerine uygulamada çeşitlilik.
Sonuçlar
- Bu teknik deneysel verimliliği önemli ölçüde artırır.
- Geleneksel patch-clamp yöntemlerindeki temel zorlukları ele alır.
- Yaklaşımın nörolojik hastalık araştırmaları için etkileri vardır.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Automated image-guided patch clamp addresses throughput limitations in neuronal electrophysiology, enabling scalable functional validation of ion channel and synaptic receptor targets. This capability supports early discovery workflows by reducing technical variability and increasing data density for lead identification campaigns. The method enhances predictive confidence in target validation by providing quantitative, reproducible electrophysiological readouts from physiologically relevant neuronal preparations.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through direct measurement of neuronal excitability and synaptic properties in fluorescently labeled cells.
- Operational Value: Reduces reliance on expert operators, standardizing patch clamp execution across users and sites.
- Predictive Value: Increases data yield per experiment, supporting statistical rigor in target engagement and mechanism of action studies.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized neuronal preparations suitable for downstream pharmacological and genetic screening campaigns.
- Quantitative Output: Provides real-time resistance and pressure metrics that enable automated seal formation detection and process optimization.
- Scalability: Supports multiplexed targeting of multiple cells per slice, increasing experimental density without proportional increases in operator time.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Facilitates study of neuronal phenotypes in acute brain slices, maintaining native circuitry and pathophysiological context.
- Translational Continuity: Bridges discovery electrophysiology with preclinical validation by enabling consistent readouts across model systems.
- Mechanistic De-risking: Allows direct assessment of compound effects on ion channel function and neuronal firing patterns in intact tissue.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery biology workflows as a functional validation step following target identification and preceding lead optimization, providing electrophysiological confirmation of target engagement in native neuronal environments.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling automated, high-fidelity recording of neuronal activity in response to pharmacological or genetic perturbations.
- Screening: Enhances assay reproducibility and throughput, allowing systematic evaluation of compound libraries on neuronal excitability and synaptic transmission.
- Analytics: Delivers quantitative electrophysiological readouts (e.g., spike frequency, input resistance, current-voltage relationships) that inform structure-activity relationships and target selectivity.
- Translational Research: Maintains physiological relevance by recording from neurons in acute brain slices, preserving native expression profiles and microenvironmental cues.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable electrophysiology capability applicable across neuroscience discovery programs targeting ion channels, GPCRs, and synaptic proteins.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves target validation confidence through direct, quantitative measurement of neuronal function in physiologically relevant preparations.
- Operational Value: Increases experimental throughput and reduces variability via automation of cell detection, targeting, and patch execution.
- Strategic Value: Enables faster go/no-go decisions by generating robust functional data early in the discovery pipeline.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets based on confirmed electrophysiological modulation in disease-relevant neuronal circuits.
Implementation Considerations
- Requires expertise in electrophysiology, computer vision integration, and micromanipulator operation for system setup and troubleshooting.
- Dependent on stable fluorescence labeling, appropriate patch pipette preparation, and environmental control for healthy slice maintenance.
- Necessitates standardized software protocols and calibration procedures to ensure reproducibility across experiments and users.
- Adaptation to non-neuronal or dissociated cell types may require adjustments to detection algorithms and patching parameters.
- Practical limitations include mechanical positioning errors at extended travel distances and dependency on optimal fluorescent signal-to-noise ratios for reliable cell detection.
