Name: Beyin dilimlerinde nöronların çalışması için otomatik görüntü yönlendirmeli Yama Kelepçesi Uygulaması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Öğrenin, akut beyin dilimlerinde floresan hücreleri otomatik tespit ederek yama kelepçesi deneyleri yapmayı. Bilgisayarlı görü teknolojisi ile elektrofizyolojik kayıtların verimliliğini artırın ve farmakolojik taramalar için yüksek veri elde edin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Whitehall Vakfı&#39;ndan maddi destek için minnettarız. Değerli yorumları için Samuel T. Kissinger&#39;e teşekkür etmek istiyoruz.

1. Sistem Kurulumu <ol><li> Basınç kontrol ünitesini oluşturun. <ol><li> Basınç kontrol ünitesini devre haritasına göre monte edin ( Şekil 1 ). Gerekli parçaları, elektrik devre şemasına göre üretilen Baskılı Devre Kartı (PCB) üzerine lehimleyin ( Şekil 1b ). Standart rezistörler, LED&#39;ler, Metal Oksit Yarıiletken Alan Efekti Transistörleri (MOSFET&#39;ler), kondansatörler ve konektörleri kullanın ( Malzeme Tablosuna bakın). PCB üzerine lehim solenoid valfleri. Hava pompası ve hava basınç sensörünü elektrik kablosuyla PCB&#39;ye bağlayın. NOT: Basýnç kontrol ünitesini oluþturmak için gerekli bütün parçalarýn hazýrlanmasý yaklaýk 2 saat sürecektir. </li></ol></li><li> İkincil veri toplama (DAQ) kartını bağlayın. <ol><li> Tablo 1&#39;den sonra baskılı devre kartındaki veri çıkışlarını DAQ kartına bağlayın. NOT: DAQ panosu&quot;Tek uçlu mod&quot; ta çalışıyordum. Bağlantı noktası haritasını kullanım kılavuzunda bulabilirsiniz (bkz . Malzeme Tablosu ). </li><li> &quot;AIn Pr S&quot; yi analog giriş (AI) kanallarından birine ve &quot;R-Gr&quot; yi sekonder DAQ panosundaki analog zeminlerden birine bağlayın. </li><li> Amplifikatörden birincil çıkışı AI kanallarından birine ve toprağa sekonder DAQ kartının analog topraklarına bağlayın. NOT: Amplifikatörden birincil çıkışı bağlamak için standart bir BNC kablosu kullanılabilir. </li><li> Diğer ucunu soyun ve pozitif sinyali ( yani bakır damar) AI kanalına ve toprağa ( yani , damar etrafındaki ince tel) analog toprağa bağlayın. Birden fazla yama kanalı kullanılıyorsa, bu adımı ikinci bir kanal için tekrarlayın. NOT: DAQ kartına analog giriş sonraki adımlarda yapılandırılacaktır. </li><li> Gücü, ikincil DAQ kartının güç çıkışına bağlayın. Ayrı bir 12 V güç kullanın;Pompa için teşvik edin. </li></ol></li><li> Boruyu bağlayın. <ol><li> Hava pompasını ve iki valfı Tablo 2&#39;ye göre bağlayın. Son adımda valf 2 üstteki port, basınç sensörü ve pipet tutucusundan yumuşak boruyu bağlamak için 3 yönlü bir konnektör kullanın. </li><li> İki pipet kullanılıyorsa, pipet tutucusuna bağlanan boruya başka bir 3-yollu konektör ekleyin. Yama yaparken kullandığınız valfleri ve pipetleri manuel olarak değiştirin. </li></ol></li><li> Autopatcher IG&#39;yi yükleyin. NOT: Sistem gereksinimi: Autopatcher IG yalnızca Windows 7 çalıştıran bir bilgisayarda test edilmiştir. Diğer işletim sistemleri için onaylanmamıştır. Açıklanan prosedür, özellikle Malzeme Masasında listelenen donanım için geçerlidir. <ol><li> Autopatcher-IG&#39;yi GitHub&#39;dan indirin (https://github.com/chubykin/AutoPatcher_IG). </li><li> Python&#39;u kurun (sürüm ve karşıdan yükleme adresi için Malzeme Tablosuna bakın). </li><li> PyQt4&#39;ü kaldırKomut satırı terminalinde &quot;pip kaldırma PyQt4&quot; yazarak bir arşiv. Not: Sistem Qwt ve Opencv kitaplıkları ile uyumluluk sağlamak için PyQt4 kitaplığının daha eski bir sürümünü kullanır. </li><li> Tarihi tekerlek dosyalarından Python kütüphanelerini yükleyin (http://www.lfd.uci.edu/~gohlke/pythonlibs/). Aşağıdaki dosyaları bulun: Numpy (pymc-2.3.6-cp27-cp27m-win32.whl), Opencv (opencv_python-2.4.13.2-cp27-cp27m-win32.whl), Pyqt (PyQt4-4.11.4-cp27-none -win32.whl) ve Qwt (PyQwt-5.2.1-cp27-none-win32.whl). <ol><li> Tekerlek dosyalarını yüklemek için, dosyaların kaydedildiği dizine gidin ve &quot;pip install *** wheelfilename ***. Whl&quot; yazın. &quot;*** wheelfilename ***&quot; dosyasını dosyanın gerçek adıyla değiştirin. NOT: tekerlek dosya adındaki &quot;cp27&quot;, Python 2.7&#39;yi ve &quot;win32&quot; Windows 32-biti belirtmektedir. &quot;Win32&quot; çalışmazsa, &quot;win64&quot; i deneyin. </li></ol></li><li> CCD kamerayı kontrol etmek için yükleyiciyi indirin ve yükleyin64-bit (https://www.qimaging.com/support/software/). Ardından kamerayı Python&#39;da kontrol etmek için MicroManager for 64-bit&#39;i indirin (https://micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release). </li><li> Manipülatörleri ve mikroskop sahnesini kontrol etmek için, üretici tarafından sağlanan kontrol yazılımını yükleyin. NOT: Bunu yaparak, manipülatörleri kontrol etmek için gerekli olan sürücü de yüklenir. Yükleme paketi genelde bir CD-ROM&#39;da sağlanır. </li><li> İkincil DAQ kartını kontrol etmek için Evrensel Kitaplığı DAQ kartının satın alınmasıyla birlikte verilen CD-ROM&#39;dan yükleyin. </li></ol></li><li> Autopatcher IG için donanımı yapılandırın. <ol><li> Mikroskop sahne ve manipülatör kontrolörlerini USB bağlantı noktaları üzerinden bilgisayara bağlayın. </li><li> &quot;Yapılandırma&quot; klasöründeki &quot;ports.csv&quot; yapılandırma dosyasında COM port numaralarını ünite 0: mikroskop sahne, ünite 1: sol manipülatör ve ünite 2: sağ manipülatör sırasına atayın. LPorts.csv dosyasındaki diğer parametreleri ( yani &quot;SCI&quot; ​​ve &quot;1&quot;) değiştirmeden bırakın. NOT: COM bağlantı noktası numarası bilgileri, üretici tarafından sağlanan manipülatör yapılandırma yazılımını çalıştırarak bulunabilir. &quot;Ayarlar&quot; sekmesine gidin, &quot;ayarlar&quot; ı ve &quot;Hareket&quot; sayfasını seçin ve üstteki her sekmenin etiketlerini okuyun. Alternatif olarak, bu bilgi PC Aygıt Yöneticisi&#39;nde bulunabilir. </li><li> Bir basınç sensörü ve patch kanalı 1 ve 2 (ünite 1 ve 2&#39;ye karşılık gelir) için analog giriş kanalı numaralarını DAQ kartına atayın. &quot;Configuration&quot; klasöründeki &quot;DAQchannels.csv&quot; dosyasına kanal numarasını girin. NOT: Değişiklikleri kaydederken bilgileri değiştirebileceğinden, .csv dosyalarını bir elektronik tablo yerine Not Defteri uygulamasıyla açmanız önerilir. </li></ol></li><li> Autopatcher IG&#39;yi çalıştırın. <ol><li> Amfi, mikroskop kontrol cihazı ve manipülatör kontrol cihazını açın. ensuAmplifikatör yazılımının çalışıyor olması. </li><li> Autopatcher IG&#39;yi Python ile bir komut satırı terminalinden aşağıdaki gibi çalıştırın: önce, Autopatcher IG&#39;nin kurulu bulunduğu dizini değiştirin (komut &quot;cd&quot;), komut satırı terminalinde &quot;python Autopatcher_IG.pyw&quot; yazın ve &quot;Giriş anahtarı. NOT: Autopatcher IG&#39;yi çalıştırmadan önce manipülatör kontrol yazılımını çalıştırmayın; çünkü Autopatcher IG&#39;nin donanım bulamamasına neden olan mikroskop sahne ve manipülatörü işgal edecektir. Manipülatör kontrol yazılımı, kontrol edilmesi gereken ilave modüller ( örn. Hat içi ısıtıcı) varsa, Autopatcher IG tamamen başlatıldıktan sonra çalıştırılabilir. </li></ol></li><li> Birincil pipeti kalibre edin. <ol><li> Daha önce açıklandığı gibi yama pipetleri çekin 9 . Çekilmiş bir cam pipeti iç çözeltiyle doldurun ve kafa aşamasına yükleyin. NOT: Boş cam pipetlerin altında farklı kontrastlar vardır.Ve mikroskopta hatalı kalibrasyona neden olabilir. </li><li> Mikroskop görüntü alanına pipet ucu taşıyın ve odak haline getirmek. Tuş takımı manipüle edicileri ve / veya mikroskop sahnesini hareket ettirmek için kullanılıyorsa, klavyedeki &quot;z&quot; ye basarak koordinatlarını güncelleyin. NOT: Bu işlem, klavye (mikroskop kademesi: A / D - x ekseni, W / S - y ekseni, R / F - z ekseni; manipülatörler: H / K - x ekseni, U / J - y ekseni, O / L - z ekseni, 1/2 birim numarası) hareketleri kontrol etmek için kullanılır, çünkü koordinatlar gerçek zamanlı olarak güncellenecektir. </li><li> Peteğin yüklendiği ilgili birim için ana Grafik Kullanıcı Arayüzü (GUI) üzerindeki &quot;Kalibrasyona Başla&quot; düğmesine tıklayın ( Şekil 2 ). NOT: Kalibrasyon tamamlandığında bir pop-up pencere açılacaktır. NOT: Kalibrasyon otomatik olarak gerçekleştirilecektir; yaklaşık 3,5 dakika sürecektir. Aynı düğmeyi tıklamak (şu an &quot;kalibrasyonu iptal et&quot; afTer başlatma kalibrasyonu) kalibrasyon denemesini iptal edecektir. </li><li> Ana GUI&#39;nin alt kısmındaki &quot;kalibrasyonu kaydet&quot; i (mevcut kalibrasyonu hem manipülatörler için kaydeder hem de gelecekte yüklenebilir) tıklayarak kalibrasyonu kaydedin. NOT: Düzgün çalışabilmesi için, düşük (4 veya 10X) ve yüksek (40X) büyütme alanı, ikincil kalibrasyon için hizalanmalıdır. Lütfen hizalama prosedürleri için kullanılan optik sistemin kullanım kılavuzuna bakın. </li></ol></li></ol> 2. Otomatik Yama Sıkıştırma Prosedürü <ol><li> Daha önce tarif edildiği gibi akut beyin dilimleri hazırlayın 10 . </li><li> Düzeltme kelepçesi için cam pipet hazırlayın. </li><li> Bir beyin dilimini kayıt odasının merkezine yerleştirin. Dilimi bir dilim tutma veya &quot;arp&quot; ile dengeleyin. </li><li> Floresan hücresi tespit edin. <ol><li> 4X lens altında ilgi alanını bulun. Cli&#39;yi açarak mikroskop sahnesini hareket ettirinCk-to-move (&quot;CTM&quot;) modunda gezinin ve ilgilenilen bölgenin merkezine tıklayın. Alternatif olarak, mikroskop aşamasını (A / D - x ekseni, W / S - y ekseni, R / F - z ekseni) taşımak için tuş takımını kullanın. </li><li> Yüksek büyütme lensine geçin ve tuş takımındaki R / F tuşunu kullanarak mikroskopu z ekseninde hareket ettirerek odaklamayı ayarlayın. NOT: Düşük ve yüksek büyütmeli merceklerin altındaki odak düzleminin z ekseni ile aynı veya benzer olacağı şekilde su banyosu seviyesini ayarlaması önerilir. </li><li> Ana GUI sütununda &quot;Birim 0&quot; adresindeki &quot;Hücre Algıla&quot; düğmesini tıklayın. Kurulumun LED veya lazer ışığı kaynağı TTL sinyaliyle kontrol edilemiyorsa, LED / lazeri elle açın; Hücre tespiti tamamlandığında bir pop-up penceresi belirecektir. <ol><li> Gerekirse LED / lazeri kapatın; &quot;Bellek konumları&quot; GUI&#39;sinde hücre koordinatlarının bir listesi görünür. Koordinatların yanındaki &quot;X&quot; düğmesini tıklatarak listeden istenmeyen hücreleri kaldırın. </li><li>Alternatif olarak, hedef hücreler flüoresan etiketli değilse, ana GUI&#39;de &quot;Fare modu&quot; nu tıklayın. İlgilenilen hücrenin üzerine tıklayın; Bir sayı olan sarı bir nokta hücrede görünür ve hücrenin koordinatları &quot;Bellek konumları&quot; GUI&#39;sinde görünür. </li></ol></li></ol></li><li> İkincil pipeti ayarla. <ol><li> İç çözeltiyle 1/3 cam pipet doldurun. Pipeti kafa aşamasına bağlı pipet tutucusuna yerleştirin. </li><li> Düşük büyütmeli mercek kullanın. Peti görsel alana getirin ve tuş takımını kullanarak odağı ayarlayın (H / K - x ekseni, U / J - y ekseni, O / L - z ekseni). Ünite 1 ile ünite 2 arasında geçiş yapmak için &quot;1&quot; ve &quot;2&quot; kullanın. </li><li> &quot;Kalibrasyonu yükle&quot; yi tıklayarak birincil kalibrasyonu yükleyin. Kullanılan birim altındaki ana GUI&#39;de &quot;İkincil kalibrasyon&quot; düğmesini tıklayın. Örneğin, ünite 2 kullanılırsa, &quot;Ünite 2&quot; bölümündeki &quot;İkincil kalibrasyon&quot; düğmesine tıklayınlumn. Yüksek büyütme lensine geçmek için açılır pencere yönergelerini izleyin. </li></ol></li><li> Hedefi hücreleyin. <ol><li> &quot;MultiClamp&quot; ( yani amplifikatör) yazılımının çalıştığından emin olun. &quot;Patch control&quot; GUI&#39;sini açmak için &quot;Patch control&quot; düğmesine tıklayın; Bu GUI&#39;yi açmak birkaç dakikanızı alabilir. </li><li> Ana GUI &quot;Birim 0&quot; sütununda &quot;40X&quot; işaretleyerek 40X büyütme lensini kullanın. &quot;Bellek konumu&quot; GUI&#39;sindeki koordinat listesindeki ilgi hücresinin yanındaki &quot;git&quot; düğmesine tıklayın; Mikroskop hücreye geçecektir. </li><li> Bir fare tıklamasını takiben hareketi etkinleştirmek için ana GUI&#39;de kullanılan ünitenin CTM düğmesine tıklayın. İlgilenilen hücrenin üzerine tıklayın; Pipet ucu hücrenin hareket edecektir. </li><li> &quot;Patch control&quot; GUI&#39;sindeki &quot;Patch&quot; düğmesine tıklayın. NOT: Otomatik yama başlayacak ve basınç ve direnç üzerinde izlenebilecektir.&quot;Patch control&quot; GUI. <ol><li> Giriş sinyalini iki ünite arasında değiştirmek için &quot;Birim 1 seçildi&quot; düğmesini kullanın. NOT: Sistem hedef hücreye yaklaşır, negatif basınç uygular, hücre zarı potansiyeliyle eşleşir ve basınç ve direnç eşikleri ve mantığı serisine dayanan gigaseal oluşumunu tespit eder. </li><li> &quot;Yama kontrolü&quot; GUI&#39;sindeki ilgili düğmelere tıklayarak otomatik işlemi her noktada yönetin. Örneğin, düzeltme denemesini iptal etmek için tekrar &quot;Düzeltme&quot; düğmesine tıklayın ve eşiğe bakılmaksızın, yama sürecini bir sonraki aşamaya ilerletmek için &quot;Sonraki aşamaya&quot; tıklayın. NOT: Bir gigazal oluştuğunda bir pop-up pencere kullanıcıyı bilgilendirir ve zap&#39;ı büyük negatif basınç ile birlikte uygulama seçeneği sunulur. </li></ol></li><li> Birleştirilen zap ve emme ile içeri girmek için &quot;Evet&quot; i seçin. Alternatif olarak, yalnızca emme ile girmek için &quot;Hayır&quot; ı seçin. <br/&gt; NOT: Başarılı bir tüm hücre yaması tamamlandığında, kullanıcıya deneme düzeltme günlüğünü kaydetmek için bir pop-up pencere hatırlatacaktır. </li><li> Deneme düzeltme günlüğünü kaydedin. NOT: Bir yama denemesi başarısız olursa, kullanıcıya bir açılır pencere bildirilir ve yama işlemi sıfırlanır. </li><li> Adım 2.4&#39;e dönün ve adımları farklı bir hücreyle tekrarlayın. </li></ol></li><li> Düzeltme eşikleri (isteğe bağlı). NOT: İlk pipet direnç aralığı, pozitif ve negatif basınç, devasa direnç vs için eşik değerler. Bir yapılandırma dosyasından değiştirilebilir. <ol><li> Sistemin kurulduğu yerde &quot;Configuration&quot; klasöründeki &quot;PatchControlConfiguration.csv&quot; dosyasını açın. Her bir eşik değerine karşılık gelen sayıları değiştirin. Değerlerin adlarını değiştirmeyin; Bu, sistemde tanınmayan girdilere neden olacaktır. </li><li> Yeni eşik değerlerini hemen &quot;Ct&#39;ye basarak uygulayınRl + L &quot;olarak ayarlandığında, programın yeniden başlatılması dosyadaki en yeni eşik değerini uygulayacaktır. </li></ol></li></ol> 3. Kayıt Yapma NOT: Bilgisayar kontrollü mikroelektrod amplifikatöründeki mod otomatik patcher yazılımı ile başarılı bir yama sağlandıktan sonra Current Clamp (&quot;IC&quot;) konumuna getirilir. Tam hücre yama kelepçesi kayıtları, seçilen kayıt yazılımı kullanılarak yapılabilir (bu sistem bir kayıt fonksiyonu içermez). Birden fazla hedef hücre tanımlandıysa, bir kayıt bittikten sonra adım 2.4&#39;e gidin ve başka bir hücre deneyin. <ol><li> Bir picospritzer (isteğe bağlı) kullanarak otomatik lokal ilaç uygulama deneyleri yapın. NOT: Burada, TTL sinyalleriyle harici donanımı kontrol etmek için ek &quot;Komut Sıra&quot; fonksiyonunun nasıl kullanılacağını açıklamak için bir örnek olarak bir yerel ilaç uygulaması denemesi kullanılır. <ol><li> Bağlantı noktası A cha0 ve sekonder DAQ kartı üzerindeki zemini, basamaksız bir BNC kablosu kullanarak basamaklayıcı üzerindeki başlatma tetik girişine (adım 1.2.3&#39;te açıklandığı gibi) kesin. Sayısallaştırıcıdaki bir dijital çıkış kanalını pikspiztör üzerindeki harici tetikleyiciye bağlayın. </li><li> Kullanıcı el kitabına göre pikspit yazıcının hazırlanması. Bir mikromanipülatöre bağlı olan ilaç püskürtmeli pipet tutacağı pikspritzer hava çıkışını bağlayın. </li><li> Seçilen bir ilaçla dolu bir pipet yükleyin. Pipet tutucusuna takın. Adım 1.7&#39;de açıklandığı gibi pipeti kalibre edin. </li><li> Adım 2.6&#39;da açıklandığı gibi bir hücrenin eklenmesinden sonra, &quot;fare modu&quot; altında kamera görünümü GUI&#39;sini (ana GUI&#39;den anahtarlamalı olarak) fare ile tıklayarak ilaç dağıtımında istediğiniz yeri seçin. Alternatif olarak, ızgaradaki her piksel hedef konumlardan biri olarak bir ızgarayı tasarlamak için &quot;Izgara&quot; GUI&#39;yi kullanın. NOT: Izgara, fare ile sürükleyerek kamera görüntüsü GUI&#39;de manipüle edilebilir. </li><li> &quot;Komuta Sırası&quot; ndaEnce &quot;GUI&#39;de, ilaç pipetinin takılı olduğu manipülatör birimini seçin. İlaç dağıtımı için tüm koordinatları içe aktarmak için&quot; fare noktalarını yükle &quot;veya&quot; şebeke noktalarını yükle &quot;yi tıklayın. <ol><li> Sağ sütundaki belirli komut TTL sinyalini düzenlemek için her koordinat girişini tıklayın. İlk komut girdisinde, en sağdaki basamağı tıklayarak &quot;0&quot; dan &quot;1&quot; e çevirin ve + 5 V TTL sinyal gönderin. Saati (T) istediğiniz TTL sinyal süresine, ms cinsinden ayarlayın. </li><li> İkinci komut girişinde, tüm basamakları &quot;0&quot; olarak ayarlayın ve T&#39;yi denemenin kayıt uzunluğunun süresine ayarlayın. Tüm koordinat girdileri için komutları düzenleyin. Birden fazla TTL sinyali gerekiyorsa &quot;+&quot; işaretini tıklatarak komut girdileri ekleyin. NOT: 8 basamaklı bitler, gerekirse, ikincil DAQ&#39;da (portlar 1 - 3 pompayla ve iki valf tarafından işgal edilir) 0 - 7 numaralı A kanallarını gösterir. </li></ol></li><li> Veri toplama modülünde bir kayıt protokolü oluşturun böyleceBir taramanın başlangıcı harici başlatma tetikleyicisi tarafından tetiklenir. İlacın istenilen zamanda verilmesi için protokolü düzenleyin. </li><li> &quot;Komut Dizisi&quot; GUI&#39;sinde, tüm koordinatları çalıştırmak için soldaki &quot;Çalıştır&quot; ı tıklayın. Alternatif olarak, yalnızca seçilen diziyi çalıştırmak için sağdaki &quot;Çalıştır&quot; ı tıklayın. NOT: Pipet, her bir koordinatta hareket edecek ve kayıt süpürme işlemini başlatmak için TTL sinyalini tanımlandığı şekilde yürütülecektir. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes.</a> Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).</li>
<li>Collins, M. D., Gordon, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giant+liposome+preparation+for+imaging+and+patch-clamp+electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Giant liposome preparation for imaging and patch-clamp electrophysiology.</a> J Vis Exp. (76), (2013).</li>
<li>Kodandaramaiah, S. B., Franzesi, G. T., Chow, B. Y., Boyden, E. S., Forest, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+whole-cell+patch-clamp+electrophysiology+of+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated whole-cell patch-clamp electrophysiology of neurons in vivo.</a> Nat Methods. 9 (6), 585-587 (2012).</li>
<li>Desai, N. S., Siegel, J. J., Taylor, W., Chitwood, R. A., Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MATLAB-based+automated+patch-clamp+system+for+awake+behaving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">MATLAB-based automated patch-clamp system for awake behaving mice.</a> J Neurophysiol. 114 (2), 1331-1345 (2015).</li>
<li>Kodandaramaiah, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+and+operation+of+the+autopatcher+for+automated+intracellular+neural+recording+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protocols%22%5BJournal%5D)">Assembly and operation of the autopatcher for automated intracellular neural recording in vivo.</a> Nat Protocols. 11 (4), 634-654 (2016).</li>
<li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+autopatching+with+automated+pipette+and+cell+detection+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Integration of autopatching with automated pipette and cell detection in vitro.</a> J Neurophysiol. 116 (4), 1564-1578 (2016).</li>
<li>Perin, R., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+computer-assisted+multi-electrode+patch-clamp+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A computer-assisted multi-electrode patch-clamp system.</a> J Vis Exp. (80), e50630(2013).</li>
<li>Fertig, N., Blick, R. H., Behrends, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+cell+patch+clamp+recording+performed+on+a+planar+glass+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Whole cell patch clamp recording performed on a planar glass chip.</a> Biophys J. 82 (6), 3056-3062 (2002).</li>
<li>Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+patch-pipettes+and+sharp+electrodes+with+a+programmable+puller%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller.</a> J Vis Exp. (20), (2008).</li>
<li>Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-cell+Patch-clamp+Recordings+in+Brain+Slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices.</a> J Vis Exp. (112), (2016).</li>
<li>Campagnola, L., Kratz, M. B., Manis, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ACQ4%3A+an+open-source+software+platform+for+data+acquisition+and+analysis+in+neurophysiology+research%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neuroinform%22%5BJournal%5D)">ACQ4: an open-source software platform for data acquisition and analysis in neurophysiology research.</a> Front Neuroinform. 8 (3), (2014).</li>
<li>Kolb, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleaning+patch-clamp+pipettes+for+immediate+reuse%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Cleaning patch-clamp pipettes for immediate reuse.</a> Sci Rep. 6, (2016).</li>
</ol>

Geçici olmayan patent başvurusu &quot;SİSTEMLER VE YÖNTEMLER OTOMATİK GÖRÜNTÜ YÖNLENDİRİLMİŞ YARIM-KPLAMP ELEKTROFİZYOLOJİSİNE VİTRO,&quot; ABD Seri No: 15 / 353,719, 16 Kasım 2016, Ref. No: PRF 67270-02.

Burada, in vitro olarak otomatik görüntü yönlendirmeli yama tutma kayıtları için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu işlemin ana adımları aşağıda özetlenmiştir. Birincisi, bilgisayarla görme, mikroskop kullanılarak elde edilen bir dizi görüntü kullanarak pipetin ucunu otomatik olarak tanımak için kullanılır. Bu bilgi daha sonra mikroskop ile manipülatör koordinat sistemleri arasındaki koordinat dönüşüm fonksiyonunu hesaplamak için kullanılır. Bilgisayarla görme, flüoresan etiketli hücreleri otomatik olarak algılamak...

Yama kenetleme tekniği ilk uyarılabilir membranların 1 iyonik kanal incelemek için 1970&#39;lerde Neher ve Sakmann tarafından geliştirilmiştir. O zamandan beri, yama sıkıştırma, nöronlar, kardiyomiyositler, Xenopus oositleri ve yapay lipozomlar dahil olmak üzere birçok farklı hücre tipinde hücresel, sinaptik ve devre seviyesinde - hem in vitro hem de in vivo - birçok farklı çalışmada uygulanmıştır 2 . Bu süreç, bir hücrenin doğru tanımlanması ve hedeflenmesi, hücreye yakın yama pipetini taşımak için karmaşık mikromanipülatör kontrolü, sıkı bir gigaseal yama oluşturmak için uygun zamanda pipete pozitif ve negatif basınç uygulanmasını, Ve tam hücreli bir yama konfigürasyonu oluşturmak için bir kırılma. Mandal sıkıştırma genellikle manuel olarak yapılır ve ustalık için kapsamlı eğitim gerektirir. Yama ile deneyimli bir araştırmacı için bileKelepçe, başarı oranı nispeten düşüktür. Daha yakın zamanda, patch-clamp deneylerini otomatikleştirmek için çeşitli girişimler yapılmıştır. Otomasyonu başarmak için iki temel strateji geliştirildi: yama sürecinin otomatik kontrolü ve yeni ekipmanların ve tekniğin baştan tasarlanmasını sağlamak için standart patch clamp ekipmanının güçlendirilmesi. Eski strateji, mevcut donanıma uyarlanabilir ve in vivo kör yama kelepçesi 3 , 4 , 5 , akut beyin dilimleri, organotipik dilim kültürlerinin in vitro yama kelepçesi ve kültürlenmiş ayrışmış nöronlar da dahil olmak üzere çeşitli yama kelepçesi uygulamalarında kullanılabilir 6 . Aynı anda birden çok mikromanipülatör kullanarak kompleks yerel devrelerin sorgulanmasını sağlar 7 . Düzlemsel yama yöntemi, yüksek verimli eşzamanlı p elde edebilen yeni kalkınma stratejisinin bir örneğidirİlaç tarama amaçları için askıdaki hücrelerin atch kelepçesi 8 . Bununla birlikte, düzlemsel yama yöntemi, özellikle uzun proseslere sahip nöronlar veya kapsamlı bağlantılar içeren sağlam devreler olmak üzere tüm hücre tipleri için geçerli değildir. Bu, geleneksel patch clamp teknolojisinin önemli bir avantajı olan sinir sisteminin karmaşık devre haritalarına uygulanmasını sınırlar. Standart yama kelepçesi donanımını güçlendirerek elle yama klemp prosesini in vitro otomatik hale getiren bir sistem geliştirdik. Autopatcher IG sistemimiz, otomatik pipet kalibrasyonu, floresan hücre hedef belirleme, pipet hareketinin otomatik kontrolü, otomatik tam hücre yamalama ve veri günlüğü sağlar. Sistem, otomatik olarak farklı derinliklerde birden fazla beyin dilimi imgesi edinebilir; Bilgisayar vizyonu ile analiz edebilecek; Ve floresan etiketli hücrelerin koordinatları da dahil olmak üzere bilgi çıkarmak. Bu bilgiler daha sonraIlgilenilen hücreleri hedeflemek ve otomatik olarak düzeltmek için kullanılır. Yazılım, birkaç açık kaynak kütüphanesi kullanarak, özgür, açık kaynaklı bir programlama dili olan Python&#39;da yazılmıştır. Bu, diğer araştırmacılara erişebilmesini sağlar ve elektrofizyoloji deneylerinin tekrarlanabilirlik ve titizliğini geliştirir. Sistem, modüler bir tasarıma sahiptir; böylece ek donanım, burada gösterilen mevcut sistemle kolayca arayüz oluşturabilir.

<table><tbody><tr><td>CCD Kamera</td><td>QImaging</td><td>Rolera Bolt</td><td></td></tr><tr><td>Elektrofizyoloji teçhizatı</td><td>Scientifica</td><td>SliceScope Pro 2000</td><td>Mikroskop ve manipülatörleri içerir. Bu el yazmasında gösterilen üretici tarafından sağlanan manipülatör kontrol yazılımı " Linlab2 ".</td></tr><tr><td>Amplifikatör</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td>MultiClamp 700B</td><td>bilgisayar kontrollü mikroelektrot amplifikatörü</td></tr><tr><td>Sayısallaştırıcı</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td>Axon Digidata 1550</td><td></td></tr><tr><td>LED ışık kaynağı</td><td>Soğuk LED</td><td>pE-100</td><td>488 nm dalga boyu</td></tr><tr><td>Veri toplama kartı</td><td>Ölçüm Hesaplama</td><td>USB1208-FS</td><td>İkincil DAQ. Şu kılavuza bakın: http://www.mccdaq.com/pdfs/manuals/USB-1208FS.pdf</td></tr><tr><td>Solenoid valfler</td><td>Lee Co.</td><td></td><td></td>LHDA0531115H</tr><tr><td>Hava pompası</td><td>Sanal endüstri</td><td>VMP1625MX-12-90-CH</td><td></td></tr><tr><td>Hava basıncı sensörü</td><td>Freescale yarı iletken</td><td>MPXV7025G</td><td></td></tr><tr><td>Dilim tutma</td><td>Warner instruments</td><td>64-1415 (SHD-40/2)</td><td>Dilim Ankraj Kiti, RC-40 için Düz Odacık, 2,0 mm, 19,7 mm</td></tr><tr><td>Python</td><td>Anaconda</td><td>sürüm 2.7 (Windows için 32 bit)</td><td>https://www.continuum.io/downloads</td></tr><tr><td>Vidalı Terminaller</td><td>Sparkfun</td><td>PRT - 08084</td><td>Vidalı Terminaller 3,5 mm Aralık (2 Pimli)</td></tr><tr><td>(2 Pimli)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>N-Kanal MOSFET 60 V 30 A</td><td>Sparkfun</td><td>COM - 10213</td><td></td></tr><tr><td>DIP Soketler Lehim Kuyruğu - 8 Pimli</td><td>Sparkfun</td><td>PRT-07937</td><td></td></tr><tr><td>LED - Temel Kırmızı 5 mm</td><td>Sparkfun</td><td>COM-09590</td><td></td></tr><tr><td>LED - Temel Yeşil 5mm</td><td>Sparkfun</td><td>COM-09592</td><td></td></tr><tr><td>DC Namlu Güç Jakı/Konektörü (SMD)</td><td>Sparkfun</td><td>PRT-12748</td><td></td></tr><tr><td>Duvar Adaptörü Güç Kaynağı - 12 V DC 600 mA</td><td>Sparkfun</td><td>TOL-09442</td><td></td></tr><tr><td>Bağlantı Kablosu - Çeşitler (Katı Çekirdek, 22 AWG)</td><td>Sparkfun</td><td>PRT-11367</td><td></td></tr><tr><td>Kilitleme Erkek x Dişi x Dişi Musluk</td><td>ARK-PLAS</td><td>RCX10-GP0</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Tygon S3 E-3603 Esnek Borular</td><td>Fisher scientific</td><td>14-171-129</td><td>Dış Çap: 1/8 inç İç Çap: 1/16 inç.</td></tr><tr><td>BNC erkek - BNC erkek koaksiyel kablo</td><td>Belkin Bileşenleri</td><td>F3K101-06-E</td><td></td></tr><tr><td>560 Ohm Direnç (% 5 tolerans)</td><td>Radioshack</td><td>2711116</td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer</td><td>Genel Vana</td><td>Picospritzer II</td><td></td></tr></tbody></table>

beyin dilimlerinde nöronların çalışması için otomatik görüntü yönlendirmeli yama kelepçesi uygulaması

Application of Automated Image-guided Patch Clamp for the Study of Neurons in Brain Slices

Tam hücre yama kelepçesi, tekli hücrelerin elektriksel özelliklerini ölçmek için altın standart yöntemdir. Bununla birlikte, in vitro yama kelepçesi, karmaşıklığı ve kullanıcı operasyonu ve kontrolüne yüksek bağımlılığı nedeniyle zorlu ve düşük üretim tekniği kalmaktadır. Bu el yazması, akut beyin dilimlerinde in vitro tüm hücre yaması klemp deneyleri için görüntü yönlendirmeli bir otomatik tutma kelepçesi sistemini göstermektedir. Sistemimiz, floresan etiketli hücreleri algılamak ve bir mikromanipülatör ve dahili pipet basınç kontrolü kullanarak tam otomatik yama için onları hedeflemek için bir bilgisayar görme tabanlı algoritma uygular. Bütün süreç, insan müdahalesi için asgari gereklilikler ile son derece otomatiktir. Elektrik direnci ve dahili pipet basıncı da dahil olmak üzere gerçek zamanlı deney bilgileri gelecekteki analizler ve farklı hücre tiplerine göre optimizasyon için elektronik olarak belgelenmiştir. Sistemimiz akut beyin bağlamında tanımlansa daN dilim kayıtlarında, aynı zamanda ayrışmış nöronların, organotipik dilim kültürlerinin ve diğer nöronal olmayan hücre tiplerinin otomatik görüntü yönlendirmeli yama kelepçesine de uygulanabilir.

<html> Sistemimiz akut beyin dilimleri, fare ile uyarılmış Pluripotent Kök Hücreler (iPSC&#39;ler) nöronlara ayırdıklarında hücreleri düzeltme yeteneği ve yapay olarak ilgi kanallarını ifade eden HEK 293 hücreleri üzerinde test edilmiştir. Şekil 3 , görsel kortekste floresan olarak etiketlenmiş tabaka 5 piramidal nöronları hedefleyen Thy1-ChR2-YFP transgenik farelerini (B6.Cg-Tg (Thy1-COP4 / EYFP) 18Gfng / J) kullanan bir deney göstermektedir. Hedef hücre, ot...

Bu protokol, standart in vitro elektrofizyoloji ekipmanı için yakın zamanda geliştirilen bir sistemi kullanarak otomatik görüntü yönlendirmeli patch-clamp deneylerini nasıl yürüttüreceğinizi açıklamaktadır.

Beyin dilimlerinde nöronların çalışması için otomatik görüntü yönlendirmeli Yama Kelepçesi Uygulaması

Whole-cell patch clamp is the gold-standard method to measure the electrical properties of single cells. However, the in vitro patch clamp remains a ...

Bu teknolojinin genel amacı, bilgisayarlı görü kullanarak floresan hücreleri otomatik olarak tespit etmek ve akut beyin dilimlerindeki bu hücrelerin otomatik patch clamp işlemini gerçekleştirmektir. Bu yöntem; floresan olarak işaretlenmiş hücrelerin tanımlanması, hedeflenmesi ve patch clamp yapılması gibi patch clamp elektrofizyolojisi alanındaki temel zorlukların aşılmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, patch pipetlerini ve floresan hücreleri otomatik olarak tespit edebilmesi ve bu adımları otomatik patch clamp ile entegre edebilmesidir.Bu yenilik, deneysel veri üretim kapasitesini önemli ölçüde artırmaktadır. Yüksek kapasiteli görüntü güdümlü otomatik patch clamp yöntemi, daha fizyolojik nöronal preparatlarda farmakolojik taramalar için kullanılabileceğinden, bu tekniğin etkileri nörolojik bozuklukların tedavisi veya teşhisine kadar uzanmaktadır. Bu yöntem ayrıca nöronal organelloidler veya dilim kültürleri, disosiye nöronların yanı sıra her türlü nöronal olmayan hücre gibi diğer in vitro preparatlara da uygulanabilir.Bu prosedüre başlamak için amplifikatörü, mikroskop kontrol ünitesini ve manipülatör kontrol ünitesini açın. Ardından, öncelikle Autopatcher IG'nin yüklü olduğu dizine geçiş yaparak, bir komut satırı terminali üzerinden python ile Autopatcher IG'yi çalıştırın. Sonrasında, Python Autopatcher_IG yazın.Komut satırı terminaline PYW yazın ve enter tuşuna basın. Ardından, cam pipeti tamamen iç çözelti ile doldurun ve başlık aşamasına yerleştirin. Pipet ucunu mikroskobun görüş alanına getirin ve odaklayın.Mikroskop tablasındaki manipülatörleri hareket ettirmek için çevirmeli düğme kullanılıyorsa, klavyeden Z tuşuna basarak koordinatları güncelleyin. Birincil kalibrasyon, manipülatörün hareket açısını ve mesafesini mikroskop koordinat sistemine dönüştürür. Manipülatör, önceden ayarlanmış mesafelerle üç yönde ilerler ve yazılım, pipet ucunun mikroskop görüş alanı içindeki koordinatlarını tespit eder.Pipetin yüklendiği ilgili ünite için ana GUI üzerindeki kalibrasyonu başlat düğmesine tıklayın. Ardından, ana GUI'nin alt kısmındaki kalibrasyonu kaydet seçeneğine tıklayarak kalibrasyonu kaydedin. Bu birincil kalibrasyon, düzeneğin fiziksel organizasyonu değiştirilmediği sürece yalnızca bir kez gerçekleştirilmelidir.Bu adımda, kayıt haznesinin merkezine bir beyin kesiti yerleştirin. Beyin kesitini bir kesit tutucu veya harp ile sabitleyin. Floresan hücreyi tespit etmek için, dört kat büyütme altında ilgili alanı bulun.Ardından, tıklayıp taşıma modunu açarak mikroskop tablasını hareket ettirin ve ilgilenilen alanın merkezine tıklayın. Alternatif olarak, mikroskop tablasını hareket ettirmek için tuş takımını kullanın. Daha sonra, yüksek büyütmeli lense geçiş yapın ve tuş takımındaki RF'yi kullanarak mikroskobu Z-ekseninde hareket ettirip odağı ayarlayın.Yazılım, farklı derinliklerde bir dizi görüntü almak için mikroskobu ve kamerayı yönlendirir. Ardından, floresan işaretli hücreleri bulmak için bu görüntüler bilgisayarlı görü işlemine tabi tutulur. Nihai çıktı, tespit edilen hücre koordinatlarının bir listesidir.Ana GUI sütun sıfırındaki hücreyi tespit et butonuna tıklayın. Eğer düzeneğin LED veya lazer ışık kaynağı TTL sinyali ile kontrol edilemiyorsa, LED'i veya lazeri manuel olarak açın. Gerektiğinde LED'i veya lazeri kapatın.Hücre koordinatlarının bir listesi bellek konumları GUI'sinde görünecektir. Koordinatların yanındaki X düğmesine tıklayarak istenmeyen hücreleri listeden çıkarın. Alternatif olarak, hedef hücreler floresanla işaretlenmemişse, ana GUI'deki fare moduna tıklayın.Ardından, ilgili hücreye tıklayın; hücre üzerinde numaralı sarı bir nokta belirecek ve hücrenin koordinatları bellek konumları GUI'sinde görünecektir. Pipet ofset koordinatlarını tespit etmek amacıyla ikincil kalibrasyon yapmak için cam bir pipetin 1/3'ünü iç çözelti ile doldurun. Daha sonra, pipeti kafa tablasına takılı olan pipet tutucuya yerleştirin.Düşük büyütmede, birinci ve ikinci ünite arasında geçiş yapmak için tuş takımındaki bir ve iki numaraları kullanın. Ardından, pipeti görüş alanına getirin ve tuş takımını kullanarak odaklamayı ayarlayın. Sonrasında, kalibrasyonu yükle seçeneğine tıklayarak birincil kalibrasyonu yükleyin.Mikroskop lensini yüksek büyütmeye getirin ve ana GUI üzerinde 40 kez tıklayın. Pipet ucunu merkeze getirin. Ardından, ana GUI'de, kullanımda olan birimin altındaki ikincil kalibrasyon düğmesine tıklayın.Bir hedef hücreyi yamalamak için, yama kontrol GUI'sini açmak üzere yama kontrol düğmesine tıklayın. Bellek konumu GUI'sindeki koordinat listesinde, ilgilenilen hücrenin yanındaki git düğmesine tıklayın. Ardından, hareketi etkinleştirmek için ana GUI'deki ünitenin CTM düğmesine tıklayın.Pipet ucunu hücreye taşımak için ilgilenilen hücreye tıklayın. Manipülatörün mekanik kısıtlaması nedeniyle, 500 mikrometreden daha uzun mesafelerde hareket ederken hafif bir konumlandırma hatası oluşabilir. Büyük bir mekanik konumlandırma hatasını önlemek için, hedef hücrenin yakınında ikincil kalibrasyon gerçekleştirilmelidir.Ardından, giriş sinyalini iki ünite arasında değiştirmek için "unit one selected" düğmesini kullanın. Yama kontrolü GUI'sindeki "patch" düğmesine tıklayın. Otomatik yama işlemi başlayacaktır ve basınç ile direnç, yama kontrolü GUI'si üzerinden izlenebilir.Otomatik yamama algoritması, bir gigaseal oluşturmak için bir dizi mantık döngüsü aracılığıyla direnci izler ve basıncı kontrol eder. Bir açılır pencere, gigaseal oluşumunu bildirir. Sistem, hücre-yüzey temasını tanımak için direnç değişimini kullanır.Hücre yüzeyi temasının zamanında tespit edilmemesi durumunda, aynı otomatik patching denemesinde kalarak patching aşamasını ilerletmek için "next" (sonraki) düğmesini kullanın. Patch kontrol GUI'sindeki ilgili düğmelere tıklayarak otomatik süreci herhangi bir noktada yönetebilirsiniz. Ardından, birleşik Zap ve vakum ile müdahale etmek için "yes" (evet) seçeneğini belirleyin.Alternatif olarak, yalnızca emiş ile giriş yapmak için hayır seçeneğini belirleyin. Ardından, deney yama günlüğünü kaydedin. Bu şekil, komut dizisi GUI'sine yüklenen seçili konumları göstermektedir.Sol sütun koordinat listesini, sağ sütun ise her bir konum için TTL sinyalleri biçimindeki komut listesini göstermektedir. Burada, seçilen üç konuma karşılık gelen ilaç uygulaması deneyi sırasındaki ekran görüntüleri yer almaktadır. Görselleştirme amacıyla KCL çözeltisi kırmızı floresan boya ile karıştırılmıştır.Birinci ünite KCl içeren pipet, ikinci ünite ise patch pipetidir. Bu şekilde, basamak akım enjeksiyonları düzenli spike atan bir nöronu göstermektedir. Burada, üç farklı konuma 500 milimolar potasyum klorür çözeltisinin lokal uygulamasından elde edilen voltaj klempli kayıt izleri gösterilmiştir.İçe doğru akımı gösteren kırmızı iz, potasyum klorür uygulamasının yama hücresine yakın olduğu deneyden kaydedilmiştir. Kırmızı ok, potasyum klorür uygulamasının zamanlamasını belirtmektedir. Bu yöntem kullanılarak, manuel yamalamaya kıyasla kapsamlı bir eğitim gerekmeden dört dakika içinde bir yama kenetleme deneyi gerçekleştirilebilir.Bu prosedürün ardından, araştırma projenizle ilgili soruları yanıtlamak amacıyla optogenetik, kemogenetik ve farmakolojik manipülasyonlar gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, nörobilim alanındaki araştırmacıların farklı in vitro preparatlarda sinaptik reseptörlerin ve iyon kanallarının yüksek kapasiteli çalışmalarını yürütmelerine yol açabilir. Bu videoyu izledikten sonra, görüntü kılavuzlu otomatik patch clamp deneylerinin nasıl gerçekleştirileceği konusunda kapsamlı bir anlayışa sahip olmalısınız.

application-automated-image-guided-patch-clamp-for-study-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu video, dendritik membran yüzeyinden yama kelepçesi kaydı için bir tekniği göstermektedir. Bu, dopaminerjik nöronlardaki dendritlerin ve altta yatan voltaj kapılı iyon kanallarının elektriksel özelliklerini doğrudan incelemeye yardımcı olur.

Bir Beyin Dilimindeki Dopaminerjik Nöronun Dendritinden Yama-Kelepçe Kayıtları

Bu video, ince uçlu bir pipetin beyin dilimlerinin yakınına yerleştirilmesini ve bir nöronal hücre ile bir mühür oluşturmasını göstermektedir. Emme, hücre zarını kırar, böylece elektrofizyoloji deneyleri için akım ölçümlerini sağlayan bir tam hücre yama kelepçesi oluşturur.

Beyin Dilimlerinde Elektrofizyolojik Kayıtlar için Tüm Hücre Voltaj-Kelepçe Konfigürasyonunun Oluşturulması

Bu videoda, nörona özgü floresan proteinler içeren transgenik beyin dilimlerinden elektriksel aktivitenin aynı anda görüntülenmesi ve kaydedilmesi için bir yöntem özetlenmektedir. Prosedür, beyin diliminin havalandırılmış yapay beyin omurilik sıvısı ile bir perfüzyon odasında tutulmasını, floresan etiketli hücreleri uyarmak için bir ışık kaynağı kullanılmasını ve elektrik sinyallerinin çok kanallı bir prob ve yama kelepçesi ile kaydedilmesini içerir.

Beyin Dilimlerindeki Nöronal Hücrelerin Eş Zamanlı Optik ve Elektrofizyolojik İzlenmesi

Bu videoda, beyin dilimleri bir kayıt odasında hareketsiz hale getiriliyor ve ilgilenilen hücreler konumlandırılıyor ve bilgisayar kontrollü bir mikroskop kullanılarak odaklanılıyor. Otomatik görüntü işleme sistemi daha sonra hücre zarını kapatmak ve elektrik sinyallerini izlemek için bir yama pipetini hassas bir şekilde konumlandırır.

Beyin dilimlerindeki nöronları incelemek için otomatik görüntü kılavuzlu yama kelepçesi tekniği

Bu video, bir beyin dilimini sabitleyerek, pipetleri tüm hücre konfigürasyonlarını elde etmek için konumlandırarak ve postsinaptik yanıtları kaydetmek için presinaptik nöronları uyararak sinaptik bağlantıları haritalama prosedürünü gösterir, böylece nöronal bağlantıyı aydınlatır.

Akut Beyin Dilimlerinde Nöronal Bağlantıların Eşleştirilmiş Yama Kelepçesi Kaydı

Bu yazıda, akut izole beyin dilimleri arasında nöronlarda ligand kapılı iyon kanal fonksiyonunu incelemek için kullanışlı bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, standart yama kelepçe teknikler kullanılarak kaydedilmiş nöronlar için ilaçların lokal uygulama için bir ilacın dolu bir mikropipet kullanımını içerir.

Fare Beyin dilimleri içinde Nikotinik Asetilkolin Reseptör Fonksiyon Okumak Uyuşturucu Yerel Uygulama

Akut beyin dilimlerinde sinaptik olarak eşleşmiş nöronların yama-kelepçe kayıtları ve eş zamanlı hücre içi biyosit dolumu, yapısal ve fonksiyonel özelliklerinin ilişkili bir analizine izin verir. Bu protokolün amacı, nöronal mikro devrelerden elektrofizyolojik kaydın temel teknik adımlarını ve bunların müteakip morfolojik analizlerini tanımlamaktır.

Akut Beyin Dilimleri nöronal Mikro şemalar Elektrofizyolojik ve Morfolojik Karakterizasyonu Eşleştirilmiş Patch-Kelepçe Kayıtlar Kullanma

Bu iletişim kuralı bir en iyi duruma getirilmiş Nuygulanmasını gösteren-metil-D-glucamine (NMDG) koruyucu kurtarma yöntemi beyin dilim hazırlık. Bir tek medya formülasyon güvenilir bir şekilde sağlıklı beyin dilimleri her yaştan ve çeşitli deneysel uygulamalar için hayvanlardan elde etmek için kullanılır.

En iyi duruma getirilmiş bir Nkullanarak akut beyin dilimleri hazırlanması-metil-D-glucamine koruyucu kurtarma yöntemi

Bu protokol tüm hücre yama-kelepçe kayıtları gerçekleştirmek için temel usul adımları açıklar. Bu teknik nöronların elektriksel davranışının çalışma sağlar ve beyin dilimleri yapıldığında, hala nispeten iyi korunmuş beyin devreleri entegre edilmiştir nöronlardan farklı nöron işlevlerinin değerlendirilmesine olanak sağlamaktadır.

Beyin Dilimleri tüm hücre Patch-kelepçe Kayıtlar

Dilim yama klemp tekniği içsel özelliklerini ve uyarıcı ya da inhibitör sinapslarda plastisite öğrenme kaynaklı değişiklikleri analiz etmek için etkili bir yöntemdir.

Dilim yama klemp tekniği öğrenme kaynaklı plastisite analiz etmek için

Ex vivo beyin dilimleri, uçucu anesteziklerin afferent girdilere uyarılmış yanıtlar üzerindeki etkilerini incelemek için kullanılabilir. Optogenetik, talamokortikal ve kortikokortikal afferentleri primer olmayan neokortekse bağımsız olarak aktive etmek için kullanılır ve sinaptik ve ağ yanıtları izofluran ile modüle edilir.

Beyin Dilimlerinde Afferent Yolakların Optogenetik Aktivasyonu ve Uçucu Anesteziklerle Yanıtların Modülasyonu

Öğrenin, akut beyin dilimlerinde floresan hücreleri otomatik tespit ederek yama kelepçesi deneyleri yapmayı. Bilgisayarlı görü teknolojisi ile elektrofizyolojik kayıtların verimliliğini artırın ve farmakolojik taramalar için yüksek veri elde edin.

Beyin dilimlerinde nöronların çalışması için otomatik görüntü yönlendirmeli Yama Kelepçesi Uygulaması

Daha fazla video keşfet