Beyin dilimlerinde nöronların çalışması için otomatik görüntü yönlendirmeli Yama Kelepçesi Uygulaması

Bu teknolojinin genel amacı, bilgisayarlı görü kullanarak floresan hücreleri otomatik olarak tespit etmek ve akut beyin dilimlerindeki bu hücrelerin otomatik patch clamp işlemini gerçekleştirmektir. Bu yöntem; floresan olarak işaretlenmiş hücrelerin tanımlanması, hedeflenmesi ve patch clamp yapılması gibi patch clamp elektrofizyolojisi alanındaki temel zorlukların aşılmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, patch pipetlerini ve floresan hücreleri otomatik olarak tespit edebilmesi ve bu adımları otomatik patch clamp ile entegre edebilmesidir.

Bu yenilik, deneysel veri üretim kapasitesini önemli ölçüde artırmaktadır. Yüksek kapasiteli görüntü güdümlü otomatik patch clamp yöntemi, daha fizyolojik nöronal preparatlarda farmakolojik taramalar için kullanılabileceğinden, bu tekniğin etkileri nörolojik bozuklukların tedavisi veya teşhisine kadar uzanmaktadır. Bu yöntem ayrıca nöronal organelloidler veya dilim kültürleri, disosiye nöronların yanı sıra her türlü nöronal olmayan hücre gibi diğer in vitro preparatlara da uygulanabilir.

Bu prosedüre başlamak için amplifikatörü, mikroskop kontrol ünitesini ve manipülatör kontrol ünitesini açın. Ardından, öncelikle Autopatcher IG'nin yüklü olduğu dizine geçiş yaparak, bir komut satırı terminali üzerinden python ile Autopatcher IG'yi çalıştırın. Sonrasında, Python Autopatcher_IG yazın.

Komut satırı terminaline PYW yazın ve enter tuşuna basın. Ardından, cam pipeti tamamen iç çözelti ile doldurun ve başlık aşamasına yerleştirin. Pipet ucunu mikroskobun görüş alanına getirin ve odaklayın.

Mikroskop tablasındaki manipülatörleri hareket ettirmek için çevirmeli düğme kullanılıyorsa, klavyeden Z tuşuna basarak koordinatları güncelleyin. Birincil kalibrasyon, manipülatörün hareket açısını ve mesafesini mikroskop koordinat sistemine dönüştürür. Manipülatör, önceden ayarlanmış mesafelerle üç yönde ilerler ve yazılım, pipet ucunun mikroskop görüş alanı içindeki koordinatlarını tespit eder.

Pipetin yüklendiği ilgili ünite için ana GUI üzerindeki kalibrasyonu başlat düğmesine tıklayın. Ardından, ana GUI'nin alt kısmındaki kalibrasyonu kaydet seçeneğine tıklayarak kalibrasyonu kaydedin. Bu birincil kalibrasyon, düzeneğin fiziksel organizasyonu değiştirilmediği sürece yalnızca bir kez gerçekleştirilmelidir.

Bu adımda, kayıt haznesinin merkezine bir beyin kesiti yerleştirin. Beyin kesitini bir kesit tutucu veya harp ile sabitleyin. Floresan hücreyi tespit etmek için, dört kat büyütme altında ilgili alanı bulun.

Ardından, tıklayıp taşıma modunu açarak mikroskop tablasını hareket ettirin ve ilgilenilen alanın merkezine tıklayın. Alternatif olarak, mikroskop tablasını hareket ettirmek için tuş takımını kullanın. Daha sonra, yüksek büyütmeli lense geçiş yapın ve tuş takımındaki RF'yi kullanarak mikroskobu Z-ekseninde hareket ettirip odağı ayarlayın.

Yazılım, farklı derinliklerde bir dizi görüntü almak için mikroskobu ve kamerayı yönlendirir. Ardından, floresan işaretli hücreleri bulmak için bu görüntüler bilgisayarlı görü işlemine tabi tutulur. Nihai çıktı, tespit edilen hücre koordinatlarının bir listesidir.

Ana GUI sütun sıfırındaki hücreyi tespit et butonuna tıklayın. Eğer düzeneğin LED veya lazer ışık kaynağı TTL sinyali ile kontrol edilemiyorsa, LED'i veya lazeri manuel olarak açın. Gerektiğinde LED'i veya lazeri kapatın.

Hücre koordinatlarının bir listesi bellek konumları GUI'sinde görünecektir. Koordinatların yanındaki X düğmesine tıklayarak istenmeyen hücreleri listeden çıkarın. Alternatif olarak, hedef hücreler floresanla işaretlenmemişse, ana GUI'deki fare moduna tıklayın.

Ardından, ilgili hücreye tıklayın; hücre üzerinde numaralı sarı bir nokta belirecek ve hücrenin koordinatları bellek konumları GUI'sinde görünecektir. Pipet ofset koordinatlarını tespit etmek amacıyla ikincil kalibrasyon yapmak için cam bir pipetin 1/3'ünü iç çözelti ile doldurun. Daha sonra, pipeti kafa tablasına takılı olan pipet tutucuya yerleştirin.

Düşük büyütmede, birinci ve ikinci ünite arasında geçiş yapmak için tuş takımındaki bir ve iki numaraları kullanın. Ardından, pipeti görüş alanına getirin ve tuş takımını kullanarak odaklamayı ayarlayın. Sonrasında, kalibrasyonu yükle seçeneğine tıklayarak birincil kalibrasyonu yükleyin.

Mikroskop lensini yüksek büyütmeye getirin ve ana GUI üzerinde 40 kez tıklayın. Pipet ucunu merkeze getirin. Ardından, ana GUI'de, kullanımda olan birimin altındaki ikincil kalibrasyon düğmesine tıklayın.

Bir hedef hücreyi yamalamak için, yama kontrol GUI'sini açmak üzere yama kontrol düğmesine tıklayın. Bellek konumu GUI'sindeki koordinat listesinde, ilgilenilen hücrenin yanındaki git düğmesine tıklayın. Ardından, hareketi etkinleştirmek için ana GUI'deki ünitenin CTM düğmesine tıklayın.

Pipet ucunu hücreye taşımak için ilgilenilen hücreye tıklayın. Manipülatörün mekanik kısıtlaması nedeniyle, 500 mikrometreden daha uzun mesafelerde hareket ederken hafif bir konumlandırma hatası oluşabilir. Büyük bir mekanik konumlandırma hatasını önlemek için, hedef hücrenin yakınında ikincil kalibrasyon gerçekleştirilmelidir.

Ardından, giriş sinyalini iki ünite arasında değiştirmek için "unit one selected" düğmesini kullanın. Yama kontrolü GUI'sindeki "patch" düğmesine tıklayın. Otomatik yama işlemi başlayacaktır ve basınç ile direnç, yama kontrolü GUI'si üzerinden izlenebilir.

Otomatik yamama algoritması, bir gigaseal oluşturmak için bir dizi mantık döngüsü aracılığıyla direnci izler ve basıncı kontrol eder. Bir açılır pencere, gigaseal oluşumunu bildirir. Sistem, hücre-yüzey temasını tanımak için direnç değişimini kullanır.

Hücre yüzeyi temasının zamanında tespit edilmemesi durumunda, aynı otomatik patching denemesinde kalarak patching aşamasını ilerletmek için "next" (sonraki) düğmesini kullanın. Patch kontrol GUI'sindeki ilgili düğmelere tıklayarak otomatik süreci herhangi bir noktada yönetebilirsiniz. Ardından, birleşik Zap ve vakum ile müdahale etmek için "yes" (evet) seçeneğini belirleyin.

Alternatif olarak, yalnızca emiş ile giriş yapmak için hayır seçeneğini belirleyin. Ardından, deney yama günlüğünü kaydedin. Bu şekil, komut dizisi GUI'sine yüklenen seçili konumları göstermektedir.

Sol sütun koordinat listesini, sağ sütun ise her bir konum için TTL sinyalleri biçimindeki komut listesini göstermektedir. Burada, seçilen üç konuma karşılık gelen ilaç uygulaması deneyi sırasındaki ekran görüntüleri yer almaktadır. Görselleştirme amacıyla KCL çözeltisi kırmızı floresan boya ile karıştırılmıştır.

Birinci ünite KCl içeren pipet, ikinci ünite ise patch pipetidir. Bu şekilde, basamak akım enjeksiyonları düzenli spike atan bir nöronu göstermektedir. Burada, üç farklı konuma 500 milimolar potasyum klorür çözeltisinin lokal uygulamasından elde edilen voltaj klempli kayıt izleri gösterilmiştir.

İçe doğru akımı gösteren kırmızı iz, potasyum klorür uygulamasının yama hücresine yakın olduğu deneyden kaydedilmiştir. Kırmızı ok, potasyum klorür uygulamasının zamanlamasını belirtmektedir. Bu yöntem kullanılarak, manuel yamalamaya kıyasla kapsamlı bir eğitim gerekmeden dört dakika içinde bir yama kenetleme deneyi gerçekleştirilebilir.

Bu prosedürün ardından, araştırma projenizle ilgili soruları yanıtlamak amacıyla optogenetik, kemogenetik ve farmakolojik manipülasyonlar gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, nörobilim alanındaki araştırmacıların farklı in vitro preparatlarda sinaptik reseptörlerin ve iyon kanallarının yüksek kapasiteli çalışmalarını yürütmelerine yol açabilir. Bu videoyu izledikten sonra, görüntü kılavuzlu otomatik patch clamp deneylerinin nasıl gerçekleştirileceği konusunda kapsamlı bir anlayışa sahip olmalısınız.