Bilgisayar destekli Çoklu elektrot Patch-kelepçe Sistemi
October 18th, 2013
Multi-elektrot patch-kelepçe kayıtları karmaşık bir görev oluşturmaktadır. Burada, deneysel adım birçok otomatik olarak, performans ve kayıtların sayısı kaliteyi iyileştirmek yol açan sürecini hızlandırmak için nasıl mümkün olduğunu gösterir.
Bu prosedürün genel amacı, tüm hücre modunda 12 hücreye kadar yama kelepçesi kayıtlarını gerçekleştirmektir. Bu, önce ilgilenilen her hücrenin konumunu işaretleyerek ve her hücreye bir pipet atayarak gerçekleştirilir. İkinci adım, her pipetin ucunu bulmak ve pipetleri otomatik olarak atanmış hücrelerinin yanına taşımaktır.
Ardından, her hücreye her seferinde bir pipetle yaklaşın. Hücre zarı ile sıkı contalar oluşturmak için son adım, hücrelerin zarını yırtmak ve tüm hücre kayıtlarını yapmaktır. Sonuç olarak, bilgisayar destekli çok elektrotlu yama kelepçe kaydı, küçük nöronal devrelerin ağ özelliklerini yüksek çözünürlükte göstermek için kullanılır.
Bu tekniğin manuel yama kelepçesi gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, bir ağda gözlemlenebilen bağlantı sayısının, kaydedilen nöron sayısının karesiyle artmasıdır. Bu tekniğin görsel olarak gösterilmesi önemlidir, çünkü yama kelepçesi adımlarının karmaşıklık ve gerçekleştirilmeleri gereken hız nedeniyle öğrenilmesi zor olabilir. Bu prosedüre, mikroskobun yer değiştirme aralığının merkezine ilgilenilen bölge ile bir beyin dilimi yerleştirerek başlayın.
Ardından, ilgilenilen hücreleri tanımlayın. Ardından, mikroskop koordinat sistemine göre hücrelerin konumunu kaydedin. Grafik arayüz, genel bir genel bakış için seçilen hücrelerin yanı sıra mikro pipetleri de gösterecek ve yazılım, görüntülerin üzerine yerleştirilecek hücre konumuna bir işaretleyici ekleyecektir.
Ek olarak, ileride başvurmak üzere hücrenin bir görüntüsü yakalanır. İlgilendiğiniz hücreleri seçtikten sonra, grafik arayüzdeki atama kontrollerini ayarlayarak tek tek hücreleri kaydetmek için kullanılacak pipetleri atayın. Son konumları göster onay kutusunu seçerek son yapılandırmanın bir önizlemesini görselleştirin.
Şimdi pipetleri hücre içi çözelti ile hazırlayın ve tutucularına yerleştirin. Baş aşamalarını sabitlemelerine yerleştirin, ancak öne doğru kaydırmayın. Pipet ucuyla banyoya dokunmaktan kaçınmak için pozitif basınç kontrolünü etkinleştirin ve tüm pipetleri seçin.
Uçların temiz kalacağından emin olmak için, her bir kafa aşamasını yavaşça yerine kaydırın. Ardından, A düğmesini basılı tutarken R iki düğmesine basarak mikroskobu dilimin iki milimetre üzerinde odak noktası olacak şekilde merkezi bir konuma getirin.Bu nokta A.At düğmeyi basılı tutarken L iki düğmesine basarak önceki deneyden kaydedilen her manipülatör için karşılık gelen konumu kullanın, ya görünümde pipetin belirgin bir gölgesi olmalı ya da pipet ekseni boyunca küçük bir hareket yeterli olmalıdır gözlemlemek için. Pipet şeklindeki küçük farklılıkların telafisi manuel olarak yapılmalıdır.
Ardından, pipet ucunu odak noktasına getirin. Ardından ucu video ekranının kırmızı orta noktasına yerleştirin. Mikroskobu hareket ettirmeden, denetleyicinin C düğmesini basılı tutarken Z düğmesine basarak yazılıma pipetin ekranın merkezinde olduğunu bildirin.
Tek tek pipet ucu yerleştirildikten sonra, a düğmesini basılı tutarken L düğmesine bir kez basarak aşağıdakinin bulunabilmesi için bu pipeti geriye doğru gönderin. Tüm pipet uçları tam olarak yerleştirildikten ve her pipet bir hücreye atfedildikten sonra. Grafik gösterim penceresinde hücre grubunun ortasına sağ tıklayarak ve açılır menüden seçenek kümesini seçerek pipetleri otomatik olarak ilgili hücrelerine yakın konumlandırın.
Küme seçenekleri penceresinde, şu anda konumlandırmak istediğiniz tüm pipetleri seçin ve işaretli pipetlerle git'e tıklayın. İlgilenilen her hücre kümesi için bu yordamı yineleyin. Son yaklaşımı gerçekleştirmek için, pipetlerin hücrelere göre konumunu, pipet ekseninde hücreden 200 mikron uzakta ve dikey yönde 200 mikron üzerinde olacak şekilde belirtin, bu da pipet ucunu dokunun dışında tutmak için yeterlidir.
Ardından pipetlerin yerleştirilmesi bitene kadar bekleyin. Ardından, C düğmesini basılı tutarken R düğmesine bir kez basarak mikroskobu pipete doğru hareket ettirin.Mikroskobu video ekranının herhangi bir yerinde ucuna odaklayarak ve C düğmesini basılı tutarken B düğmesine basarak her pipet konumunu yeniden kalibre edin. Konum doğru değilse, ucu video ekranının orta noktasına yerleştirin ve denetleyicinin C düğmesini basılı tutarken Z düğmesine basın.
Şimdi, mevcut pipet için ilgili hücrenin doğru şekilde işaretlendiğini, aktif olarak işaretlendiğini onaylayın. Aksi takdirde, mikroskobu, ilgilenilen hücreyi merkezi kırmızı nokta ile eşleştirecek şekilde hareket ettirin, C düğmesini basılı tutarken Y düğmesine basarak hücreyi işaretleyin, ardından pipeti atanan hücresinden 200 mikron uzağa yerleştirmek C.To düğmeyi basılı tutarken L iki düğmesine basın, mikroskop otomatik olarak ilgili konuma hareket edecektir. Pipet konumunu kırmızı nokta ile eşleşecek şekilde ayarlayın.
Ardından, R düğmesine bir kez basarak pipet ofsetini ayarlayın. x düğmesini basılı tutarken. x düğmesini basılı tutarken L'ye bir kez basarak test darbesini etkinleştirin.
Bundan sonra, pipeti yavaşça atfedilen hücresine hareket ettirin. Hücre zarının yüzeyinde bir çukur oluşumunu gözlemledikten sonra, uygulanan basıncın hücreye ulaşmasını sağlamak için Z düğmesini basılı tutarken Y düğmesine basarak kısa bir negatif basınç darbesi uygulayın. Bu noktada, x düğmesini basılı tutarken L iki düğmesine basılarak yaklaşık negatif 65 milivoltluk bir tutma potansiyeli oluşturulmalıdır.
Her hücre için bir giga conta oluşturulduktan sonra, negatif basınç uygulayarak zarları yırtmaya başlayın. Ardından, kayıt yapmak için stimülasyon toplama sistemini kullanın. Tek tek hücrelere birer birer darbeler veya darbe dizileri uygulayın ve kaydedilen bu hücreler arasındaki bağlantıyı haritalamak için kalan hücrelerin tepkilerini gözlemleyin.
Kayıtlar bittiğinde, masa radyo düğmesine sağ tıklayarak pipetleri dokudan yavaşça çekin. Pipetlerin eksenleri boyunca kısa bir mesafe geri çekilmesini sağlamak için 500 mikronluk geri çekilmiş pipetleri seçin. Ardından, hücrelerin pipetleri tamamen geri çekme potansiyelindeki kaymayı gözlemleyin.
Konumlandırma hızını hızlı olarak ayarlayın ve aynı işlemi tekrarlayın, ancak tümü seçeneğini seçin. Kullanılmış pipetleri, kafa aşamalarını yavaşça dışarı kaydırarak ve pipetleri tutuculardan sökerek çıkarın. İşte bireysel deneylerde haritalanan doğrudan sinaptik bağlantı ağlarına bir örnek.
Bu üç bağlantı diyagramı, ilgili somatik mesafelere sahip beşinci katmanda kaydedilen 12 parametal hücreden oluşan setlerdir. Ve burada, kaydedilen parametal hücrelerin morfolojik boyanması üzerine bindirilmiş bağlantı diyagramı var. Bu şekil ortak komşu etkisini göstermektedir.
Mavi sütunlar, örneklenen ağdaki en az bir başka nörona aynı anda bağlı olan nöron çiftlerini gösterir. Sergi Birbirine bağlı olma olasılığı önemli ölçüde artmıştır. Burada, birden fazla ortak komşuyu paylaşan nöron çiftlerinin, örneklenen ağlarda şans eseri beklenenden daha sık meydana geldiğini, nöron çiftleri içindeki bağlantı olasılığının, ödeyen tarafından paylaşılan ortak komşuların sayısının bir fonksiyonu olarak arttığını göstermektedir.
Bu özellikler de küçük dünya kümelenmiş ağlarına yol açar. Bu şekil, Martin nty hücrelerinin işe alımının niceliksel olarak ölçülmesini göstermektedir. Bu, mavi renkli bir Martin hücresi üzerine sinaps oluşturan kırmızı renkli bir parametal hücrenin grafiksel bir temsilidir ve bu da ikinci bir parametal hücre üzerinde sinapsis oluşturur.
Siyahta, parametal hücrenin eşik stimülasyonu, Martin nty hücresinin işe alınmasına yol açar. Kolaylaştırıcı uyarıcı post-sinaptik potansiyellerin entegrasyonu yoluyla, işe alınan Martin nty hücresi daha sonra ikinci parametal hücreyi inhibe eder. Bu diyagram, artan sayıda yama kenetlenmiş parametal hücrelerin uyarılmasını ve başka bir parametal hücre üzerindeki etkilerini temsil eder.
Burada, uyarılan diğer yakındaki parametal hücrelerin sayısının bir fonksiyonu olarak bir parametal hücresinden kaydedilen ortalama inhibitör postsinaptik potansiyeller verilmiştir. Yerel bir devredeki DYS sinaptik inhibisyonunun genliği, dokuz veya daha fazla parametal hücre uyarıldığında doyma eğilimindedir ve DYS sinaptik inhibisyonu alan hücrelerin fraksiyonu, artan sayıda parametal hücre uyarıldıkça hızla bire yükselir. Bu prosedürü denerken, pipetlerin uçlarını temiz tutmak ve yaklaşma aşamasında kan damarlarından ve diğer hücrelerden kaçınarak doku bozulmasını en aza indirmek önemlidir.
Bu prosedürü takiben, yamalı kelepçe hücrelerinin başka bir hücre tipi tarafından yeniliği gibi ek soruları ele almak için foto stimülasyon gibi ek yöntemler kullanılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, birden fazla nöron için yama klempleme prosedürünü nasıl hızlandıracağınızı ve gerçekleştireceğinizi iyi anlamış olmalısınız.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu makale, çok elektrotlu yama klipsleme kayıtlarının otomasyonunu ele alır ve nöronal kayıtların verimliliğini ve kalitesini nasıl artırdığını vurgular. Prosedür, tüm hücre modunda 12'ye kadar hücrenin kaydedilmesini sağlar ve küçük nöronal devrelerin çalışmasını kolaylaştırır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Elektrofizyoloji
- Nörobilim
- Hücre Biyolojisi
Arka Plan
- Çok elektrotlu yama klipsleme kayıtları karmaşık ve zaman alıcıdır.
- Otomasyon, bu kayıtların hızını ve kalitesini iyileştirebilir.
- Nöronal devreleri anlamak, nörobilimciler için araştırma açısından çok önemlidir.
- Bu yöntem, ağ özelliklerinin yüksek çözünürlüklü analizini sağlar.
Çalışmanın Amacı
- Çok elektrotlu yama klipsleme kayıtlarının sürecini otomatik hale getirmek.
- Kayıtların performansını ve miktarını iyileştirmek.
- Nöronal devre özelliklerinin çalışmasını kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Her ilgili hücrenin pozisyonunu işaretlemek.
- Her hücreye bir pipet atamak.
- Pipetlerin atanan hücrelerin yanında otomatik olarak hareket ettirilmesi.
- Sıkı sızdırmazlıklar oluşturmak ve tüm hücre kayıtları yapmak.
Ana Sonuçlar
- Yama klipsleme sürecinin başarılı şekilde otomasyona geçirilmesi.
- Birden fazla hücreden kayıt yaparken verimliliğin artırılması.
- Küçük nöronal devreler üzerinde yüksek çözünürlüklü veriler.
- Nöronların ağ özelliklerinin gösterilmesi.
Sonuçlar
- Otomasyon, yama klipsleme kayıt kabiliyetlerini önemli ölçüde artırır.
- Bu yöntem, nöronal ağlar hakkında daha iyi anlayışa yol açabilir.
- Gelecekteki uygulamalar, çeşitli nörobilimciler araştırma alanlarında genişleyebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Multi-electrode patch-clamp systems enable high-resolution mapping of neuronal network connectivity, a critical step in target validation for CNS drug discovery. By increasing throughput and reliability of electrophysiological recordings, this approach supports mechanistic de-risking of synaptic modulators and network-modulating compounds. The computer-assisted interface reduces operator-dependent variability, improving data consistency for lead optimization decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of synaptic connectivity and circuit-level phenotypes in disease-relevant neuronal preparations.
- Operational Value: Increases recording yield per experiment, reducing time and resource investment per data point.
- Predictive Value: Supports functional validation of targets by measuring direct physiological effects on network dynamics.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates quantitative electrophysiological readouts (e.g., IPSC amplitude, seal formation) suitable for compound screening cascades.
- Reproducibility: Standardized pipette positioning and pressure controls minimize well-to-well variability across multi-electrode arrays.
- Scalability: Capacity to record up to 12 cells simultaneously enables dose-response profiling across interconnected neuronal populations.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Recordings from layer 5 pyramidal neurons in brain slices support translational validity for cortical circuit disorders.
- Mechanistic De-risking: Enables observation of polysynaptic recruitment and inhibition patterns (e.g., Martinotti cell mediation) to predict off-target circuit effects.
- Translational Continuity: Connectivity mapping provides a biomarker-aligned readout for assessing compound impact on network homeostasis.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target engagement validation to preclinical mechanism of action studies, particularly for compounds modulating synaptic transmission or neuronal excitability.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of synaptic protein targets by measuring functional consequences on connected neurons.
- Screening: Enables assay standardization through automated pipette alignment and test pulse validation, improving Z'-factor potential.
- Analytics: Provides quantitative dependent variables such as holding potential, seal resistance, and postsynaptic current amplitude for comparative condition analysis.
- Translational Research: Links molecular perturbations to emergent network properties like small-world clustering and common neighbor effects.
- Enterprise Reuse: Centralized software interface allows cross-project standardization across electrophysiology teams and sites.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances target confidence by revealing poly-synaptic mechanisms and circuit-level compensation.
- Operational Value: Reduces hands-on time per recording and increases success rate through guided visual feedback and error-proofing steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early insight into network-level drug effects beyond single-cell physiology.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on their ability to modulate specific connectivity patterns.
Implementation Considerations
- Requires expertise in electrophysiology, neuronal slicing, and patch-clamp technique.
- Depends on compatible microscope, manipulator, and pressure control systems integrated with custom software.
- Necessitates standardization of cell identification, pipette assignment, and positioning protocols across users.
- Adaptation to disease models requires validation of neuronal health and slice viability in the preparation.
- Limited by the physical accessibility of target brain regions and the health of neurons in acute slices.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:22
Cell Selection
2:23
Prepare the Pipettes and Locate the Pipette Tips
4:07
Approaching the Cells
5:38
Establish the Cell-attached and Whole-cell Configuration for Recording
7:58
Results: A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System
10:16
Conclusion
