Name: Bilgisayar destekli Çoklu elektrot Patch-kelepçe Sistemi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-18T18:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: Keşfedin bilgisayar destekli çoklu elektrot patch-kelepçe yöntemini, 12 nöronu aynı anda kaydederek sinir devrelerinin ağ özelliklerini yüksek çözünürlükle incelemek için. Bu teknik manuel yöntemlere göre verimliliği ve kayıt kalitesini önemli ölçüde artırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz yama kelepçe prosedür otomasyonu için iyileştirmeler değerli tavsiyeler Gilad Silberberg, Michele Pignatelli, Thomas K. Berger, Luca GAMBAZZI ve Sonia Garcia teşekkür etmek istiyorum. Biz değerli tavsiye ve yazılım uygulama ile yardım için Rajnish Ranjan teşekkür ederim. Bu çalışma, AB Synapse proje ve kısmen İnsan Frontiers Bilim Programı tarafından finanse edildi.

1.. Ekipmanları Hazırlık <ol><li> Bilgisayardan kontrol manipülatörler <ol><li> Seri port (RS-232) üzerinden bir bilgisayara her mikromanipülatördür denetleyici kutusuna bağlayın. </li><li> Sorgulama ve seri port üzerinden gönderilecek ayarlarını, konumlandırma için komutları uygulamak. Verilen hız ve donanım uyumluluk sorunları C / C + + programlama dili olarak tavsiye edilir. </li><li> Sıfır motorlar ve pozitif hareket motorları uzağa yönlendirilir ile ilgili olarak mümkün olan en konumu böylece manipülatörlerin referans sistemini standart hale getirilmiştir. </li><li> 2 mm numune odak düzlemi (koordinatlar [0, 0, 2000]) üzerinde merkezi bir konumda mikroskop yerleştirin. </li><li> Store, her bir manipülatör için, bir pipet ucu mikroskop görüş alanının merkezinde gözlenmesine olanak sağlayacak yerel koordinatlar. Bu her elektrot için ilk referans noktasıdır. </li></ol></li><li> Visualizedirler elektrot konumları. Bu bir deney sırasında her elektrodun pozisyonunu takip edebilmek için çok yararlıdır. Bir grafik gösterimi Bunu sağlamanın en kolay yoludur. Bu amaçla referans her elektrodun sistemleri ve mikroskop eşleşme. Bunu gerçekleştirmek için basit bir yoldur: <ol><li> Görüş alanının merkezine bir elektrot ucu getirin. </li><li> Manipülatör her eksen üzerindeki konumunu ve mikroskop her ekseni saklayın. </li><li> Manipülatör göreceli olarak büyük bir hareket (1 mm) x-ekseni ile çalıştırın. </li><li> Bir kez daha, sadece mikroskop hareketli ucu bulun. </li><li> Geçen ölçüldü yana mikroskop pozisyonda farkı hesaplayın. Bu mikroskop eksenleri üzerine elektrot eksen hareketinin tahminler vardır. </li><li> Y ve elektrot manipülatör Z eksenleri için 2.5 - 2.3 adımları tekrarlayın. Bu mikroskop üzerine çıkıntıların bir matris (&lt;belirlenmelidir eksenlerine izin verirstrong&gt; Şekil 2) de kosinüs matrisi denir: <img alt="Denklem 1" src="/files/ftp_upload/50630/50630eq1.jpg"></li><li> Mümkün koordinat sistemi mikroskop belirli bir konuma ulaşmak için elektrot manipülatör tarafından gerekli üç boyutlu olarak hareketleri, hesaplamak için bu matris tersine çevirme: <img alt="Denklem 2" src="/files/ftp_upload/50630/50630eq2.jpg"></li><li> Ilk referans noktasını kullanarak ve kosinüs matrisi mikroskopta her elektrodun pozisyonunu belirlemek koordinatları. </li><li> Mikroskop, düzenli aralıklarla, her elektrodun konumu koordinatları göre, grafik olarak gösterir. Biz elektrot konumlarını her 40 msn'den çekmek için C / C + + çizim kütüphaneleri (GDI +) kullanmayı seçti. </li><li> 1.2.7 birkaç milimetre pozisyon değişiklikleri ihtiyaç varsa manipülatör açıları değiştirilebilir veya her seferinde, örneğin, elektrot tipi değiştirildiğinde - tekrarlayın 1.2.1 adımları. </li></ol></li><li> Positio saklamak etkinleştirinBu tür hücreler ya da anatomik referans noktaları olarak dokuda ilgili özelliklerinden ns, mikroskopta koordine eder. </li><li> Videoyu Edinme ve ilgili bilgi bindirmek. <ol><li> Mekanik mikroskop kameranın yatay ekseni ile mikroskop hareket x-ekseni hizalayın. </li><li> Bilgisayarınızda canlı video ve bindirme yeteneği ve bir yazılım geliştirme kiti (SDK) ile bir framegrabber yükleyin. </li><li> SDK ile canlı video görüntüleme işlemi uygulamak. </li><li> Mikroskop uygun çeviri ve pullanma ile kamera referans sistemine koordinat sistemi dönüştürmek. </li><li> Yaklaşık 40 msn (Şekil 3) düzenli aralıklarla canlı video edilen görüntü üzerinde kamera koordinatları ve bindirme olarak ilgili özellikleri çizin. </li></ol></li><li> Kontrol Amplifikatörler. <ol><li> Arayüzünden amplifikatör ayarlarını denetlemek için amplifikatör yazılımını kullanın. </li></ol></li><li> Coosiloskoplarını NTROL. <ol><li> Seri bağlantı noktalarını kullanarak PC'ye bağlayın osiloskoplarını. </li><li> Gerilim-kelepçe de yama kelepçe prosedürünün farklı adımları için osiloskop ölçeği, kavrama ve zamansal çözünürlük belirleyin (örneğin elektrot banyo, mühür oluşumu, tam hücreli konfigürasyonunda) ve akım-kelepçe. </li><li> Amplifikatör komutları arayüzünden her yayımlandığında uygun osiloskop ayarı komutları gönderebilirsiniz. </li></ol></li><li> Kontrol pipet basıncı. <ol><li> Şekil 4'e göre bir basınç kontrol sistemi bir araya getirin. <ol><li> Uygun şekilde her elektronik komponent temini için bir 12 V / 5 V güç kaynağı kullanın. </li><li> Pozitif basınç tampon maddesi (100 mi kabı) için bir membran pompasının çıkışını. </li><li> Negatif basınç tamponu (100 mi kabı) için bir membran pompasının girişi takın. </li><li> Pressu olarak, bir basınç sensörüne pipet tutucusu boru geçkontrol sistemi ve ana basınç bölmesine bağlayan bir pnömatik vana yeniden. </li><li> Ana basınç bölmesine bağlı bir valf için basınç tampon her bağlayın. </li><li> Ana basınç bölmesi ve atmosfer arasında bir valf bağlayın. </li><li> Ana basınç bölmesine bir basınç sensörü bağlayın. </li><li> Her tampon bir basınç sensörü bağlayın. </li><li> Bir veri toplama kuruluna basınç kontrol sistemi bağlayın. </li><li> Bir analog giriş için her basınç sensörü bağlayın. </li><li> Dijital çıkış için her valfini bağlayın. </li></ol></li><li> Membran pompalara bağlayan olanlar dışındaki tüm vanaların açılması ve ölçülen basıncı çıkarılarak tüm sensörlerden ofset atmosferik basınç çıkarın. </li><li> Basıncı kontrolü uygulamak <ol><li> Arayüzünde her pipet için pozitif basınçlı kontrolünü etkinleştirmek veya de-etkinleştirmek için bir denetim tanımlayın. </li><li> Pipet için bir pozitif basınç en az tanımlamayaklaşık 70 mbar'lık s. </li><li> Aktif basınç kontrol altında pipet basınç ayarlanan eşiğin altına düştüğünde periyodik olarak (her 0.5 sn) algılar. </li><li> Eşiği geçtikten sonra pipetler basınç eşiğinin üstünde olana kadar kısa süreli (20 msn) sırasında söz pipet doğru ana basınç bölmesi ve bu bölme için pozitif basınçlı tampon açın. Diğer tüm vanalarını kapatın. </li><li> Ilgi bir hücreye doğru son yaklaşma başlatılan gibi başka basınç kontrolü de etkinleştirebilirsiniz. </li></ol></li><li> Mühür oluşumu için negatif basınç uygulayın <ol><li> Tüm vanaları kapatın ve deneyci basılı bir düğmeye tutarak gerektirir süre için söz konusu pipet doğru ana basınç bölmesi ve bu bölmeye yönelik negatif basınç tampon vanasını açın. </li></ol></li></ol></li><li> Bir insan arabirim aygıt üzerine komutları merkezde. <ol><li> Bir ticari olarak temin edilebilir Kablosuz A geçPC'ye ss gamepad. </li><li> Joystick durumu okunmasını uygulamak. Örneğin, readouts her 5 msn'den gerçekleştirmek için C / C + + için DirectX kütüphaneleri kullanabilirsiniz. </li><li> Düğmeler son kez adım beri, basılı serbest veya basılı tutuldu algılamak için önceki durumu ile şimdiki durumunu karşılaştırın. </li><li> Gamepad her düğmenin fonksiyonları atayın. Bu eşleme bir örneği Şekil 5'te gösterilmektedir. </li></ol></li></ol> 2. Patch-kelepçe Prosedürü <ol><li> Ilgi bölgenin beyin dilimleri hazırlayın. </li><li> Mikroskop yer değiştirme aralığının merkezinde ilgi bölgesi ile, ilgi konusu bir beyin dilim yerleştirin. </li><li> Hücre Seçim <ol><li> Mikroskop ile tarayarak ilgi hücreleri belirlemek. Koordinat sistemi mikroskop göre hücrelerin konumunu kaydedin doğru bir ilgili hücrenin üstüne canlı video ekranında fare tıklaması. </li> Görüntülerde yerleştirilecektir hücre konumundaki bir işaretleyici katacak grafik arayüzü küresel bir bakış ve yazılım için seçilen hücrelerin yanı sıra mikropipetler gösterecektir. Ayrıca hücrenin bir görüntü dosyası 'Hücre #. Jpg' İleride referans olması için yakalanır. </ol></li></ol><li> Pipetler hücrelerin Attribution <ol><li> Ilgi hücreleri seçtikten sonra, her hücre kaydetmek hangi pipet atayın. Grafik arayüzü ayarlanmış olmalıdır atama kontrolleri sağlar. Checkbox 'Show Final Pozisyonlar' seçerek son yapılandırma önizlemesini gözünüzde canlandırın. </li><li> Nihai pozisyon önizleme istenen veya 'Tümünü Seç' onay kutusunu olduğu için her pipet seçin. Gerekirse daha iyi görselleştirme için geçerli konum ekranı devre dışı bırakın. </li></ol></li><li> Pipetler hazırlayın <ol><li> (- Birçok pipetler kullanılır ise, 8 MQ genellikle en iyi 6) wi pipetler doldurunhücre içi bir çözüm inci ve onların sahipleri onları yük. Kendi fiksasyonlarında headstages yerleştirin ama pipet ile banyo dokunmamak için ileri kaydırın yok. </li><li> Pozitif basınç denetimini etkinleştirmek ve ipuçları temiz kalmasını sağlamak için tüm pipetler seçin. Yavaşça bir yerde her headstage kaydırın. </li></ol></li><li> Pipet ipuçları bulma <ol><li> 3 mm 'A' tuşuna basılı tutarken düğmeye R2 basarak dilim üzerinde odak merkezi bir konuma mikroskop yerleştirin. Düğmesi L2 basarak önceki deney saklanan olarak düğme A tutarken her manipülatör için gelen konumunu kullanın Not: Çoğu durumda bunu gözlemlemek için yeterli olmalıdır Bu noktada görünümünde bir pipet farklı bir gölge ya da Pipet ekseni boyunca küçük bir hareketi ya da olmalıdır. Pipet formda bir miktar farklardan telafisi için el ile yapılması gerekir. </li><li> Odak haline pipet getir. (Hala [0, 0 2000] pozisyonda olmalıdır) mikroskop hareket ettirmeden görüntü ekranın merkezi kırmızı nokta üzerinde ucunu yerleştirin. </li><li> Pipet her pipet ucu bulunduktan sonra düğmesini C. tutarken düğmeye Z basarak ekranın merkezinde bulunan yazılım bilgilendirin, geriye o pipet göndermek böylece düğme A tutarken, tek bir düğmeye basarak L1 bulunabilir aşağıdaki </li></ol></li><li> Hücreleri yaklaşırken <ol><li> Tüm pipet uçları lokalize edilmiş ve her pipet bir hücreye atfedilen sonra, otomatik olarak kendi hücrelerine yakın pipetler yerleştirin. Sadece bir hücre grubunun merkezinde sağ tıklatın ve açılır menüde seçeneği 'Küme' seçiniz. , Görünür şu anda konumlandırmak istediğiniz tüm pipetler seçin ve 'tüm işaretli pipetler git' tıklayın olacak kümesi seçenekleri penceresinde. Ilgi hücreleri her küme için bu işlemi tekrarlayın. </li><li> Peel ile son yaklaşım rform. Hücrelere göreli pipetler konumu farklı belirtilen ancak genellikle 200 um uzakta doku dışında pipetin ucu tutmak için yeterli olan dikey yönde, pipet ve yukarıda 200 um, en ekseninde hücreden basitçe edilebilir . Pipet konumlandırma bitene kadar bekleyin ve düğme C tutarak düğme R1 basarak bir pipet doğru mikroskop hareket </li><li> Video görüntüsüne herhangi bir yerde bahşiş mikroskop odaklanarak ve düğme C'yi bir kare ızgara tutarken B düğmesine basarak her pipet konumunu yeniden kalibre kısaca pipet tespit konumunu belirten görünmelidir. Pozisyonu doğru değilse düğmesini C. tutarken, video görüntü ve düğmesine basın Z merkezi nokta üzerinde ucu yerleştirin </li></ol></li><li> Hücreye bağlı yapılandırma kurulması <ol><li> Geçerli pipet ilgi hücre doğru olduğunu teyitişaretlenir. Aksi merkezi kırmızı nokta ile ilgi hücre maç için mikroskop taşıyın. Mark pipet uzakta onun atanan hücreden 200 mikron konumlandırmak için C düğmesine tutarken düğmesi C. düğmesine basın L2 tutarken düğmeye Y basarak hücre, mikroskop otomatik olarak ilgili konuma hareket edecektir. </li><li> O kırmızı noktayı eşleşecek şekilde pipet konumunu ayarlayın. Düğmesi X'i tutarak düğme R1 basarak ofset pipet ayarlayın </li><li> Yavaş yavaş atfedilen hücreye pipet yaklaşım düğmesine X'i tutarken düğmeye L1 basarak testi darbesi etkinleştirin. </li><li> Hücre zarı yüzeyi üzerinde bir çukur oluşumunun gözlenmesi üzerine uygulanan basınç hücre ulaşmak için izin düğme Z tutarken düğmesine basarak Y negatif basınç kısa bir darbe uygulamak. Yaklaşık-65mV bir tutma potansiyeli düğme X tutarken düğmeye L2 basarak bu noktada kurulmuş olmalıdır </li></ol></li><li> Tüm hücre konfigürasyonunun<ol><li> Bir Giga-mühür, her bir hücre için oluşturulduktan sonra, negatif basınç uygulanarak zarlar kopmasına başlatın. </li></ol></li><li> Kayıtları gerçekleştirin <ol><li> Kayıtları gerçekleştirmek için stimülasyon / toplama sistemi kullanın. Bir seferde darbeleri veya bir tek hücre üzerindeki bakliyat trenler uygulayın ve kaydedilen hücreler arasında bağlantı haritasına kalan hücrelerin yanıtları gözlemlemek. </li></ol></li><li> Pipetler gerileyeceği <ol><li> Kayıtlar bittikten sonra, Tablo radyo düğmesini sağ tıklayarak dokudan yavaş yavaş çekilmeye pipetler. Pipetler kendi eksenleri boyunca kısa bir mesafe çekilmeye var 'gerileyeceği-&gt; Pipetler 500 um' seçeneğini seçin. (Bazı pozitif basınç uygulayarak ipuçları temizleyerek yardımcı olabilir) hücrelerin potansiyeli sürüklenme gözlemlemek. </li><li> Tüm yolu geri pipetler çekilmeye, 'Hızlı' olarak konumlandırma hızını ayarlamak ve aynı işlemi tekrarlayın, ancak 'tüm' seçeneğini seçin. Kullanılan kaldırmayavaşça headstages dışarı kayar ve sahiplerinden pipetler sökerek pipetler. Bu büyük ölçüde pipet ucu pozisyonu ile etkileşebilir beri yuvalarına sahipleri büküm önlemek için yararlıdır. </li></ol></li>

<ol><li>Perin, R., Berger, T. K., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synaptic+organizing+principle+for+cortical+neuronal+groups%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A synaptic organizing principle for cortical neuronal groups.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 5419-5424 (2011).</li>
<li>Berger, T. K., Silberberg, G., Perin, R., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brief+Bursts+Self-Inhibit+and+Correlate+the+Pyramidal+Network%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Brief Bursts Self-Inhibit and Correlate the Pyramidal Network.</a> PLoS Biol. 8, e1000473(2010).</li>
<li>Fino, E., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dense+inhibitory+connectivity+in+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Dense inhibitory connectivity in neocortex.</a> Neuron. 69, 1188-1203 (2011).</li>
<li>Packer, A. M., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dense%2C+Unspecific+Connectivity+of+Neocortical+Parvalbumin-Positive+Interneurons%3A+A+Canonical+Microcircuit+for+Inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dense, Unspecific Connectivity of Neocortical Parvalbumin-Positive Interneurons: A Canonical Microcircuit for Inhibition.</a> J. Neurosci. 31, 13260-13271 (2011).</li>
<li>Berger, T. K., Perin, R., Silberberg, G., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequency-dependent+disynaptic+inhibition+in+the+pyramidal+network%3A+a+ubiquitous+pathway+in+the+developing+rat+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Frequency-dependent disynaptic inhibition in the pyramidal network: a ubiquitous pathway in the developing rat neocortex.</a> J. Physiol. 587, 5411-5425 (2009).</li>
<li>Kodandaramaiah, S. B., Franzesi, G. T., Chow, B. Y., Boyden, E. S., Forest, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+whole-cell+patch-clamp+electrophysiology+of+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated whole-cell patch-clamp electrophysiology of neurons in vivo.</a> Nat. Methods. 9, 585-587 (2012).</li>
<li>Anastassiou, C. A., Perin, R., Markram, H., Koch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ephaptic+coupling+of+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ephaptic coupling of cortical neurons.</a> Nat. Neurosci. 14, 217-223 (2011).</li>
<li>Prakash, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+optogenetic+toolbox+for+fast+inhibition%2C+excitation+and+bistable+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Two-photon optogenetic toolbox for fast inhibition, excitation and bistable modulation.</a> Nat. Methods. 9, 1171-1179 (2012).</li>
<li>Papagiakoumou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanless+two-photon+excitation+of+channelrhodopsin-2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Scanless two-photon excitation of channelrhodopsin-2.</a> Nat Methods. 7, 848-854 (2010).</li>
<li>Ko, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+specificity+of+local+synaptic+connections+in+neocortical+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional specificity of local synaptic connections in neocortical networks.</a> Nature. 473, 87-91 (2011).</li>
<li>Wickersham, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+Restriction+of+Transsynaptic+Tracing+from+Single%2C+Genetically+Targeted+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic Restriction of Transsynaptic Tracing from Single, Genetically Targeted Neurons.</a> Neuron. 53, 639-647 (2007).</li>
<li>Liang, C. W., Mohammadi, M., Santos, M. D., Tang, C. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterned+Photostimulation+with+Digital+Micromirror+Devices+to+Investigate+Dendritic+Integration+Across+Branch+Points%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Patterned Photostimulation with Digital Micromirror Devices to Investigate Dendritic Integration Across Branch Points.</a> J. Vis. Exp. (49), e2003(2011).</li>
<li>Nikolenko, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLM+Microscopy%3A+Scanless+Two-Photon+Imaging+and+Photostimulation+with+Spatial+Light+Modulators%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">SLM Microscopy: Scanless Two-Photon Imaging and Photostimulation with Spatial Light Modulators.</a> Front Neural Circuits. 2, (2008).</li>
</ol>

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Bir acil soru genellikle biz anlatılan prosedürün başarı oranı ile ilgili ortaya çıkar. Yüksek başarı oranları için hazırlık esastır. Pipetler kaydedilen hücreleri canlılar için yeterli ipucu açıklıklar olmalıdır. Tıkanmış pipetler önlemek için hücre içi çözelti filtre de önemlidir. Son derece temiz, taze çekilmiş pipetler başka bir şartı vardır. Bir binom dağılımı bu konularda nihai verimini nasıl etkilediğini anlamak için kullanılabilecek basit modeldir. Bu% 80 veya görsel geribildirim ile bireysel nöronlar kayıt için...

Mikrometre hassasiyet ile birden fazla site kayıt ve teşvik kapasitesi deneysel nöronal sistemlerinin daha iyi anlaşılmasını sağlamak için son derece yararlıdır. Bu amaçla birçok teknik geliştirilmiştir ama hiçbiri submillivolt çözünürlük eşik altı aktivitesi ve bireysel postsinaptik potansiyeller çalışmak için gerekli olan patch-clamp tekniği ile elde izin verir. Burada aynı zamanda bir kayıt ve nöronal bağlantı çalışma için yeterli hassasiyetle tek tek hücrelerin bir çok sayıda uyarıcı hedefleyen bir on iki elektrot bilgisayar destekli patch-clamp sisteminin geliştirilmesi kapsar. Diğer birçok uygulama böyle bir sistem için tasarlanmış olsa da, bu nöron grubu içinde mümkün bağlantılarının sayısı, söz konusu durum nöron sayısının karesi ile orantılı olarak büyür verilen sinaptik bağlantı çalışmaya özellikle de çok uygundur. Bu nedenle, üç elektrotlu bir sistem sağlar test ederkenkadar altı bağlantılarının oluşumu ve en sık oniki nöronların kayıt, tek tek kadar kayıt 132 bağlantıların oluşumunu test ve sık sık (Şekil 1) bir düzineden fazla gözlemlemeye olanak sağlar. Bağlantıların onlarca gözlem anda mümkün küçük ağların organizasyonu analiz ve aksi halde 1 problanabilir edilemez ağ yapısının istatistiksel özelliklerini anlaması için yapar. Ayrıca, çok sayıda hücrelerin kesin uyarılması da postsinaptik hücreleri 2 işe kantifizasyonunu.

<table><tbody><tr><td>Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td>40X Daldırma Objektif</td></tr><tr><td>Manipülatörleri</td><td>Luigs Neumann</td><td>SM-5</td><td>Seri protokol kullanılan</td></tr><tr><td>Amplifikatörler</td><td>Axon Instruments</td><td>MultiClamp 700B</td><td>SDK kullanılan</td></tr><tr><td>Camera</td><td>Till Photonics</td><td>VS 55</td><td>BNC analog çıkış</td></tr><tr><td>Framegrabber</td><td>Veri Çevirisi</td><td>DT3120</td><td>SDK kullanılan</td></tr><tr><td>Osiloskoplar</td><td>Tektronix</td><td>TDS 2014</td><td>Seri iletişim</td></tr><tr><td>Veri toplama</td><td>InstruTECH</td><td>ITC 1600</td><td></td></tr><tr><td>Veri toplama</td><td>Ulusal Aletler</td><td>PCI-6221</td><td>Kullanılan kitaplık (.dll)</td></tr><tr><td>Basınç valfi</td><td>SMC</td><td>SMC070C-6BG-32</td><td></td></tr><tr><td>Basınç sensörü</td><td>Honeywell</td><td>24PCDFA6G</td><td></td></tr><tr><td>Membran pompa</td><td>Schego</td><td>Optimal</td><td></td></tr></tbody></table>

bilgisayar destekli Çoklu elektrot patch-kelepçe sistemi

A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System

Patch-klemp tekniği bireysel nöronlar ya da subselüler bölmelerden elektriksel aktivite kayıt için en köklü yöntemi bugün. Bununla birlikte, kararlı kayıtları elde, hatta tek tek hücrelerden, önemli ölçüde karmaşık bir zaman alıcı bir işlem kalır. Verimli bilgi ekranı ile birlikte birçok adımdan Otomasyon ölçüde daha yüksek güvenilirliği ile kayıtların büyük bir dizi performans ve daha az sürede experimentalists yardımcı olabilir. Büyük ölçekli kayıtları elde etmek için biz en verimli yaklaşım tamamen sürecini otomatik hale ancak deneysel adımları basitleştirmek ve verimli deneycinin deneyim ve görsel geribildirim birleştiren ise insan hatası olasılığını azaltmak değil varmıştır. Akılda bu hedefleri ile biz tek bir arayüzde bir çok elektrot patch-kelepçe deneyde, bir Commerc için gerekli tüm kontrolleri merkezde bilgisayar destekli bir sistem geliştirdiially mevcut kablosuz gamepad, bilgisayar ekranında deney ile ilgili bilgiler ve rehberlik ipuçları göstermeleridir. Burada bize kayıt yapılandırmasını elde etmek için gerekli olan zamanı azaltır ve büyük ölçüde başarılı bir şekilde eş zamanlı olarak nöronların sayıda kayıt şansını artırmak için izin sisteminin farklı bileşenleri tarif eder.

Yukarıda tarif edilen yöntemler izlenerek neredeyse eş zamanlı olarak nöronların en çok patch-kenetlenir ve böylece iki katına kadar, aynı anda en fazla on iki nöron bütün hücre kayıt performans başardı. Sıçanların somatosensory korteks tabaka V kaydedilen piramidal nöronlar arasındaki doğrudan sinaptik bağlantıların ağların örnekleri, Şekil 6'da gösterilmiştir. , Belirli bir hücre tipi için somatik arası mesafenin bir fonksiyonu olarak bağlantı olasılığı profillerinin belir...

Multi-elektrot patch-kelepçe kayıtları karmaşık bir görev oluşturmaktadır. Burada, deneysel adım birçok otomatik olarak, performans ve kayıtların sayısı kaliteyi iyileştirmek yol açan sürecini hızlandırmak için nasıl mümkün olduğunu gösterir.

Bilgisayar destekli Çoklu elektrot Patch-kelepçe Sistemi

The patch-clamp technique is today the most  well-established method for recording electrical activity from individual  neurons or their subcellular ...

Bu prosedürün genel amacı, tüm hücre modunda 12 hücreye kadar yama kelepçesi kayıtlarını gerçekleştirmektir. Bu, önce ilgilenilen her hücrenin konumunu işaretleyerek ve her hücreye bir pipet atayarak gerçekleştirilir. İkinci adım, her pipetin ucunu bulmak ve pipetleri otomatik olarak atanmış hücrelerinin yanına taşımaktır.Ardından, her hücreye her seferinde bir pipetle yaklaşın. Hücre zarı ile sıkı contalar oluşturmak için son adım, hücrelerin zarını yırtmak ve tüm hücre kayıtlarını yapmaktır. Sonuç olarak, bilgisayar destekli çok elektrotlu yama kelepçe kaydı, küçük nöronal devrelerin ağ özelliklerini yüksek çözünürlükte göstermek için kullanılır.Bu tekniğin manuel yama kelepçesi gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, bir ağda gözlemlenebilen bağlantı sayısının, kaydedilen nöron sayısının karesiyle artmasıdır. Bu tekniğin görsel olarak gösterilmesi önemlidir, çünkü yama kelepçesi adımlarının karmaşıklık ve gerçekleştirilmeleri gereken hız nedeniyle öğrenilmesi zor olabilir. Bu prosedüre, mikroskobun yer değiştirme aralığının merkezine ilgilenilen bölge ile bir beyin dilimi yerleştirerek başlayın.Ardından, ilgilenilen hücreleri tanımlayın. Ardından, mikroskop koordinat sistemine

a-computer-assisted-multi-electrode-patch-clamp-system

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu Xenopus laevis oosit kelepçe kayıt yama için bir giriş olarak tasarlanmıştır. Vitellin membran, bir gigaohm mühür (gigaseal) oluşumu ve dış topoloji yama isteğe bağlı dönüşüm kapsar.

Xenopus Oosit ifade İyon Kanalları Patch Kelepçe Kaydı

BK kanalları İyonik akım yama klemp teknikleri kullanılarak kaydedildi. BK kanalları ifade edilmiştir.

İyon Kanalları incelenmesi için yama Kelepçe ve Perfüzyon Teknikleri cinsinden ifade edilir Xenopus Oosit

Bu protokol, zebra balığı embriyolarında Mauthner nöronlarının ve diğer retikülospinal hücrelerin elektriksel özelliklerini incelemek için bir yöntem olan tam hücre yama kelepçesi elektrofizyolojisi adı verilen bir tekniği tanımlar.

Tüm Hücre Yama Kelepçesi Elektrofizyolojisi: Nöronların Elektriksel Özelliklerini İncelemek İçin Bir Yöntem

Bu video, amfoterisin-B aracılı delikli yama-klemp tekniği kullanılarak detrusor düz kas hücrelerindeki geçici reseptör potansiyeli melastatin tip 4 (TRPM4) iyon kanallarından gelen katyonik akımların karakterizasyonunu göstermektedir. Teknik, iyon kanallarının biyofiziksel ve farmakolojik özelliklerinin değerlendirilmesine yardımcı olur.

Amfoterisin-B Aracılı Delikli Yama-Klemp Analizi: Mesane Hücrelerinde İyonik Akımları İncelemek İçin Elektrofizyolojik Bir Teknik

Burada tarif edilen hücre-bağlı patch-clamp tekniği ile, bir iyon kanalının güncel kayıt uzun uzanır elde edilmesi için bir işlemdir. Bu yöntem, gerçek zamanlı olarak, gözlemlemek için izin veren, biyolojik sinyali altında yer open-close kanal konformasyonlarının desen. Bu veriler rahatsız biyolojik membranların kanal özellikleri hakkında bilgilendirmek.

Tek kanallı bir hücre-bağlı Patch-clamp kayıt

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden (hPSC-CM) türeyen kardiyomiyositlerin elektrofizyolojik karakterizasyonu, kardiyak hastalık modellemesi ve ilaç yanıtlarının belirlenmesi için çok önemlidir. Bu protokol, hPSC-CM'lerin çok elektrotlu diziler üzerinde ayrılması ve plakalanması, alan potansiyelinin ölçülmesi ve QT ve RR aralıklarının analiz edilmesi için gerekli olan bilgileri sağlar.

Çok Elektrodlu Diziler (ÇÇA&#39;lar) Kullanan İnsan Pluripotent Kök Hücresinden Türetilmiş Kardiyomiyositlerin (hPSC-CM&#39;ler) Elektrofizyolojik Analizi

Bu protokol, standart in vitro elektrofizyoloji ekipmanı için yakın zamanda geliştirilen bir sistemi kullanarak otomatik görüntü yönlendirmeli patch-clamp deneylerini nasıl yürüttüreceğinizi açıklamaktadır.

Beyin dilimlerinde nöronların çalışması için otomatik görüntü yönlendirmeli Yama Kelepçesi Uygulaması

Bu el yazması proton taşıma sistemlerinin etkinliğini ölçmek için proton-seçici elektrot ve yöntemleri sıkma yama uygulamaları açıklar. Bu yöntemleri teknikleri proton taşıma etkinlik, ılımlı duyarlılık, zaman çözünürlüğü ve yetersiz hücre içi ortam denetimi gibi çalışma için yaygın olarak kullanılan bazı sınırlamalarının üstesinden gelir.

Elektrofizyoloji ölçüm uygulanması elektro-tarafsız taşıyıcılar etkinlik çalışması için

Tek lifli kayıt, merkezi ve periferik sinir sistemleri için geçerli olan etkili bir elektrofizyolojik tekniktir. Bağlı siyatik sinir ile bozulmamış DRG hazırlanması ile birlikte, iletim yetmezliği mekanizması incelenir. Her iki protokol de periferik sinir sisteminin ağrı ile ilişkisini geliştirmek.

İletim Yetmezliği Mekanizmasını İncelemek Için Bağlı Siyatik Sinir ile In Vivo Tek Lifli Kayıt ve Bozulmamış Dorsal Kök Ganglion Kullanımı

İşte biz elektrofizyolojik kayıtlar için fare retina karanlık adapte dilim üretmek için bir prosedür açıklanmaktadır.

Patch Kelepçe bir Karanlık adapte Dilim Hazırlık Fare Retina Nöronlar Kayıtlar

Keşfedin bilgisayar destekli çoklu elektrot patch-kelepçe yöntemini, 12 nöronu aynı anda kaydederek sinir devrelerinin ağ özelliklerini yüksek çözünürlükle incelemek için. Bu teknik manuel yöntemlere göre verimliliği ve kayıt kalitesini önemli ölçüde artırır.

Bilgisayar destekli Çoklu elektrot Patch-kelepçe Sistemi

Daha fazla video keşfet