Tek kanallı bir hücre-bağlı Patch-clamp kayıt

Bu prosedürün genel amacı, tek bir iyon kanalından geçen elektrik akımını ölçmektir. Bu, üzerinde çalışılması kolay ve deneysel hedeflere elverişli olan hücrelerde ilgilenilen iyon kanalını ifade eden ilk heterolog ile gerçekleştirilir. İkinci adım, hücre zarı üzerinde stabil bir sızdırmazlık elde etmek için ateşle parlatılmış bir pipet kullanmaktır.

Daha sonra, deneyci yamada bulunan kanal sayısını belirlemelidir ve eğer tek kanal kayıt akımı ise, son adım verileri işlemek ve analiz etmektir. Sonuç olarak, tek iyon kanallarından gelen akımın kaydedilmesi, bu zar proteinlerinin etki ettiği biyofiziksel özellikleri araştırmak için kullanılır, bu da nöronal ve diğer uyarılabilir hücrelerin nasıl iletişim kurduğunun temelini oluşturur. Birden fazla aktif iyon kanalı aracılığıyla akımları ölçmenize izin veren yöntemlerin aksine, bu yaklaşımın avantajı, akımları tek bir iyon kanalı aracılığıyla ölçmenin, belirli bir kanala özgü çok çeşitli tepki modellerini görselleştirmenize ve ayırmanıza izin vermesidir.

Bu yöntem, fizyolojik ve terapötik modülatörlerin nöronlar arasındaki iletişimi etkilemesi gibi sinirbilim alanındaki temel soruları yanıtlamak için kullanılabilir. Genel olarak, bu tekniğe yeni olan kişiler, yalnızca tek bir iyon kanalı içeren düşük gürültülü kayıtlar elde etmek zor olduğu için mücadele edeceklerdir. Bu yöntemi ilk kez denediğinizde, birinin bunu yaptığını görmek gerçekten yararlıdır çünkü gerçekten kararlı bir mühür elde etmek için, bu yöntemdeki en önemli şey olan, hücreye belirli bir açıyla nazikçe yaklaşmanız gerekir ve en önemlisi, transfeksiyona hazırlanmak için ısrarcı olmanız gerekir.

HEK 2 93 hücreleri, steril bir tüpte %50 ila 60 oranında birleşecek şekilde bir gün önceden 35 milimetrelik tabaklara kaplanır. Transfeksiyon karışımını hazırlayın. İlgilenilen her CDNA'dan bir mikrogram, 315 mikrolitre çift damıtılmış su ve 350 mikrolitre 42 milimolar yığın ekleyin.

Son olarak, çökeltiyi oluşturmak için damla damla 35 mikrolitre kalsiyum klorür ekleyin. Tüpü beş saniye boyunca girdaplayın ve dört tabağın her birine 175 mikrolitre transfeksiyon süspansiyonu ekleyin. Bir gün önce kaplandı.

Hücreleri iki saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. İnkübasyonun ardından, ortamı çıkarın ve PBS ile yıkayın. Daha sonra, bir MDA reseptörü aracılı eksitotoksisiteyi önlemek için iki milimolar magnezyum klorür ile desteklenmiş iki mililitre büyüme ortamı ekleyin.

Önce dikey bir çektirme kullanarak çocuk silikat camdan iki simetrik kayıt pipeti çekin. Daha sonra, uygun çap ve direnci elde etmek için yangınla parlatma işlemi gereklidir. Ardından, QUB veri toplama yazılımını açarak ve toplama penceresini seçerek kayıt için ayarlayın.

Düzen altında. Yeni verilere tıklayarak yeni bir QUB veri dosyası açın ve kullanılacak deneysel parametreleri girin. Genlik ölçeklendirmesini pico amp başına 0.1 volta ayarlayın veri dosyasına sağ tıklayarak, özellikleri seçerek ve veri sekmesine tıklayarak.

Ortamı kalsiyum ve magnezyum içeren iki mililitre PBS ile değiştirdikten sonra, hücre kabını mikroskop aşamasına monte edin. Hücrelerin sağlıklı olduğunu ve tek katmanlı bir şekilde yemeğe iyi bir şekilde bağlı olduğunu değerlendirmek için faz kontrast mikroskobu kullanarak hücresel alana odaklanın. Transfeksiyonun başarılı olduğunu doğrulamak için floresan algılamaya geçin.

Ardından, tek kanallı kayıt için parametreleri ayarlayın. Modu voltaj kelepçesine ayarlayın ve voltaj tutma komutuyla voltajı artı 100 milivolta uygulayın. Kapalı konumda, floresan ve genel görünüme göre sızdırmazlık testi düğmesini seçin.

Faz kontrastı altında hücrenin tabağa iyi bir şekilde bağlandığını, hücre yüzeyinin büyük bir bölümünün yama için açıkta olduğunu ve aksi takdirde sağlıklı göründüğünü doğrulamak için bir hücre seçin. Yeni parlatılmış bir pipeti NMDA reseptörleri ve hücreye bağlı deneyler için uygun bir solüsyonla doldurun ve hava kabarcıklarını çıkarmak için hafifçe vurun. Kayıt pipetini amplifikatör kafası aşamasına sabitleyin ve banyo solüsyonunun pipete girmesini önlemek için gümüş telin pipet solüsyonuna daldırıldığından emin olun.

Yaklaşma sırasında, hafifçe pozitif basınç uygulamak için pipet tutucuya bağlı küçük bir plastik şırınga kullanın. Ardından, pipeti banyoya yönlendirmek için mikro manipülatörü kullanın. Elektrik devresini kapatarak, doğrudan yama için seçilen hücrenin üzerine yerleştirin.

Banyoya girerken osiloskopa dikkat edin. Borunun mikroskopta görsel olarak konumunu izlerken pipet direnci optimum aralıkta olmalı ve osiloskopta elektriksel olarak dirençli olmalıdır. Pipet hücreye hafifçe çarpana kadar yaklaşıma küçük artışlarla devam edin.

Test sinyali, artan direnci belirtmek için biraz azalacaktır. Bir sızdırmazlık oluşturmak için, şırıngayı alın ve yanal borudan hafifçe negatif basınç uygulayın. Şırıngayı çekerek, piston contası oluşumu, osiloskop üzerindeki test sinyali dalga formunun tamamen düzleşmesi ile gösterilir.

Amplifikatör üzerinde. Harici komut geçişini mühür testinden kapalı konuma getirin. Voltaj tutma komutunu kapalıdan pozitife getirin ve kazancı 10 x'ten 100 x'e yükseltin.

Kanal aktivitesi için osiloskopu gözlemleyin, eğer varsa, daha önce düz olan taban çizgisinden kare aşağı doğru sapmalar olarak görüntülenecektir. Osiloskopta kanal etkinliği görüntüleniyorsa, oynat düğmesine ve ardından kayıt düğmesine basarak QUB'da daha önce açılmış dijital dosyaya veri almaya başlayın. Veri almayı durdurmak için, QUB'daki durdur düğmesine basın ve QDF dosyasını kaydedin, tamamen düzleşmeyen bir sinyal veya gürültülü ve kararsız hale gelen bir taban çizgisi, zayıf bir sızdırmazlığı gösterebilir.

Bu durumda, pipeti çıkarın ve atın ve yeterli bir sızdırmazlık elde edilene kadar devam eden adımları yeni bir pipetle tekrarlayın. Veri analizi işlemine başlamak için, kaydedilen veri dosyasını QUB'da açın ve ön arayüzdeki mevcut izlemeyi inceleyin. Düzen altında.

fc etiketli kutunun işaretini kaldırarak kaydedilen izlemeyi tam bant genişliğinde görüntülemek için dijital filtreyi çıkarın. Düzensizlikleri ve artefaktları tespit etmek için izi görsel olarak tarayın Kısa. Akım artışları, aynı iletkenlik sınıfının bitişik bir temiz bölgesi vurgulanarak düzeltilebilir.

Sağ tıklayıp önce silme arabelleğini ayarla'yı seçerek, tek tek örnek noktaları görünene kadar ani artışı yakınlaştırın. Yalnızca bu bölgeyi vurgulayarak değiştirilecek bölgeyi seçin. Tüm kaydın taban çizgisini düzeltmek için sağ tıklayın ve sil'i seçin.

Temelin kararlı olduğu kaydın erken bir bölümünü seçerek sıfır geçerli taban çizgisini tanımlayın. Sağ tıklamayı vurgulayın ve taban çizgisini ayarla'yı seçin. Temel kılavuz göründüğünde, görsel inceleme ile temel seviyeyi doğru bir şekilde temsil ettiğini onaylayın.

Kayıtta, ham veri taban çizgisinin ayarlanan taban çizgisinden gözle görülür şekilde saptığı noktaları belirleyin. Sapma bölgesi içinde taban çizgisinin küçük bir bölümünü seçerek bunu düzeltin. Sağ tıklayın ve temel düğüm ekle komutunu seçin.

Kayıt, kolayca düzeltilemeyen aşırı gürültü veya yapaylıklar içeren ara sıra dönemler içerdiğinde, bu bölümler silinmelidir, ancak önce ardışık bölümlere ayrılması gerekir. Atılacak bölgeden hemen önce vurgulayın. Sağ tıklayın ve segmenti kes'i seçin.

Bunu takiben, atılacak bölümü vurgulayın, sağ tıklayın, seçin, silin ve kayıtları idealize etmek için enter tuşuna basın. Düzen altındaki MOD arayüzüne geçin. Veri görüntüleme panelinde, hem kapalı hem de açık olayları içeren kaydın küçük bir bölümünü seçin.

İmleci aşağıdaki yüksek çözünürlüklü panele getirin ve seçilen izlemenin içinde, taban çizgisini temsil eden temiz bir parçayı vurgulayın. İmleci aşağıdaki model paneline getirin, kapalı durumu temsil edecek siyah kareye sağ tıklayın ve yakala'yı seçin. Açık iletkenliği temsil eden özelliklerin bir kısmını vurgulayarak kanal açıklıkları için prosedürü tekrarlayın.

Model panelindeki kırmızı kareye sağ tıklayın ve yakala'yı seçin. Veri kaynağı altındaki SEL düğmesini seçerek kaydın seçili bölümü için idealleştirmeyi gerçekleştirin. Ardından, açılır paneldeki modelleme bölümünün altındaki idealleştirilmiş sekmeye sağ tıklayın.

Analiz için istenen parametrelerin doğru olduğunu doğrulayın ve ardından çalıştır'a tıklayın. Seçilen kısım için genlik histogramı ile birlikte idealleştirmenin sonucu, idealleştirmenin görsel olarak incelenmesine izin vermek için verilerle üst üste bindirilir. Gerekirse, en iyi sonuç için idealleştirme parametrelerini ayarlayın ve tekrarlayın, veri kaynağı altındaki dosya düğmesini seçerek tüm dosya için idealleştirmeyi gerçekleştirin.

Ardından idealize edilmiş sekmeye sağ tıklayın ve çalıştır'a tıklayın. Dosyanın tamamı için sonuçlar görüntülenir. Verilerle üst üste bindirilmiş, idealleştirilmiş izleme ile kaydedilen veriler arasındaki eşleşmeyi dikkatlice inceleyin.

Bazen, idealize edilmiş izlemeden çıkarılabilecek olaylar yanlış bir şekilde tanımlanır. False olayını seçin, sağ tıklayın ve IDL'ye katıl'ı seçin. Burada gösterilen, bir HEK 2 93 hücresindeki tek bir NMDA reseptöründen geçen sadece kalsiyum iyonu akımlarıdır.

Hücreye bağlı yama kelepçesi tekniğini kullanarak, veri idealizasyonu, bu hücredeki iki farklı iletkenlik sınıfına güzel bir şekilde uyan genlik histogramları üretir. HEK 2 93 hücrelerden ekli kayıt, bir Meno duyarlı kanal eksi 20 milimetre ile aktive edilir. Voltajın sürekli uygulanması sırasında yama pipetinden geçen cıva basıncı.

Kırmızı noktalı çizgi sıfır akım seviyesini gösterir. Doğal kanallardan alınan bu kayıtlar, bir sıçan embriyosunun prefrontal korteksinden ayrılan ve beş veya 27 gün boyunca kültürde tutulan bir nöronun somasından kaydedilen sürekli NMDA reseptör aktivitesini göstermektedir. Mastering yapıldıktan sonra, bu prosedür kaydın süresine bağlı olarak 30 dakika ila bir saat arasında yapılabilir.

Bu prosedürü takiben, bir kanalın geçit mekanizmasını belirlemek ve reaksiyon hızlarını tahmin etmek için kinetik analiz ve durum modelleme gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, bir iyon kanalı proteini aracılığıyla akımları nasıl kaydedeceğinizi ve analiz etmeye başlayacağınızı oldukça iyi anlamış olmalısınız.