Kemirgenler gelen akut Hipokampal Dilimleri kullanarak Synaptic Etiketleme / yakalama ve Çapraz yakalama İncelenmesi

Bu prosedürün genel amacı, kemirgenlerden elde edilen hippocampal kesitler kullanarak CA1 parametal nöronlarındaki uzun süreli plastisiteyi ve sinaptik etiketleme, yakalama ve çapraz etiketleme gibi ilişkisel süreçlerini incelemektir. Bu işlem, öncelikle beynin diseke edilmesi ve hipokampusun hızla soğuk, oksijenlendirilmiş yapay serebrospinal sıvı içerisine izole edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adımda, manuel bir doku dilimleyici kullanılarak akut hippocampal kesitler hazırlanır ve bunlar bir ara yüz odacığında inkübe edilir.

Sıradaki iki stimülasyon elektrodu ve iki kayıt elektrodu, iki sinaptik girdiden alan EPSP ve popülasyon spike yanıtlarını kaydetmek için CA1 bölgesine yerleştirilir. Son adım, belirli bir zaman penceresi içinde bir sinaptik girdide geçici bir plastisite formu ve diğer girdide kalıcı bir plastisite formu indüklemektir. Nihayetinde, sinaptik etiketleme yakalama ve çapraz yakalama mekanizmalarını araştırmak için her iki girdiden gelen alan EPSP yanıtları uzun süreler boyunca kaydedilir.

Sinaptik etiketleme ve yakalama, kısa süreli belleğin belirli bir zaman dilimi içerisinde nasıl uzun süreli belleğe dönüştüğüne dair kavramsal bir temel sağlar. Deneysel basamaklar, çoklu sinaptik girdilerden stimülasyon ve kayıt işlemlerini içerdiğinden öğrenilmesi zor olduğundan, bu yöntemin görsel olarak gösterimi kritik önem taşımaktadır. Prosedürü laboratuvarımdan lisansüstü öğrenciler Mahesh Shira, machete ve maima Sharma uygulamalı olarak göstereceklerdir.

Bu prosedüre başlamak için, A CSF hazırlayın ve bunu %95 oksijen ve %5 karbondioksit ile havalandırın. Arayüz odasının tabanını, kapasitesinin yaklaşık %70'ine kadar distile su ile doldurun. Ardından, 32 °C'ye ayarlanmış sıcaklık kontrol cihazını açın.

Ardından, A CSF'ye 1 mL/dk akış hızıyla geçmeden önce, giriş borusundan yüksek akış hızında distile su akıtarak üst hazneyi 10 ila 15 dakika boyunca yıkayın. Daha sonra, dilimler için bir dinlenme yüzeyi sağlamak amacıyla üst hazneye bir ağ yerleştirin. Alt hazneye karbogen vermeye başlayın ve giriş borusunu sürekli karbogenlenen A CSF içine daldırın.

A CSF'nin karbogenle doyurulması ve üst hazneyi doldurması için 20 dakika bekleyin. Bu adımda, doku kıyıcıya bir jilet takın ve keskin kenarın düzgün bir şekilde hizalandığından emin olun. Bıçağın sıkıca sabitlendiğini doğrulamak için küçük bir filtre kağıdını keserek test edin.

Ardından, kayar vernier mikrometresini başlangıç konumuna getirin. Şimdi ötanazi uygulanmış bir sıçanın kafasını temin edin ve bir iris makası kullanarak, beyin sapını çıkarmak için posterior kafatasından bir kesi yapın. Daha sonra kafatasının sağ tarafı boyunca küçük bir insizyon ve sol tarafına daha uzun bir insizyon yapın.

Kafatası sol taraftan başlayıp sağ tarafa doğru ilerleyerek bir kemik UR ile dikkatlice çıkarılır. Korteksi ve üzerini örten ince dura tabakasını açığa çıkarmak için dura ince bir spatula ile dikkatlice kaldırılır ve ardından frontal plakalar kemik Ro ile çıkarılır. Sonrasında, özellikle korteks ile serebellum arasındaki bağlantı bölgesinde kalan dura, bir spatulanın düz ucuyla temizlenir ve basınç yukarıya doğru uygulanarak beynin zarar görmesi önlenir.

Spatula kullanarak beyni, soğuk ve karbonatlı A CSF ile doldurulmuş alüminyum bir soğutma bloğu üzerindeki Petri kabına nazikçe alın; hipokampusu izole etmek için 11 numara bistüri ile serebellumu çıkarmak için düz bir kesi ve beynin ön kısmının dörtte birini çıkarmak için başka bir kesi yapın. Ardından, orta hat boyunca sığ bir sagital kesi yapın. Orta hattan başlayarak.

Dorsal hipokampusu açığa çıkarmak için korteksi orak şeklinde skalpel (sickle scaler) ile dikkatlice kaldırın. Ardından, hipokampusun üzerindeki korteks tabakasını temizleyin. Hipokampal komissüre küçük bir kesi atın.

Siklet skaleri kullanarak, dorsal uçtan başlayarak yuvarlama hareketleriyle hipokampüsü nazikçe çıkarın. Ardından, izole edilen hipokampüs çevresindeki korteks ve bağ dokularını siklet scaler'in kavisli ucunu kullanarak temizleyin. Hipokampal dokuyu dilimlemek için, manuel dilimleyicinin dilimleme tablasına CSF ile ıslatılmış 30 milimetrelik bir watman filtre kağıdı parçası yerleştirin.

Hipokampal dokuyu filtre kağıdının üzerine aktarın. Orak bistürinin düz ucunu kullanarak, hipokampusun dilimleyicinin bıçağına göre uygun bir yönelimde hizalanması için filtre kağıdını hareket ettirin; böylece hipokampus, fia'ya yaklaşık 70 derecelik bir açıyla dilimlenmiş olur. Ardından, hipokampal dokuyu çevreleyen fazla çözeltiyi emdirerek temizleyin.

Katlanmış bir filtre kağıdı kullanarak hipokampusu transvers olarak dilimleyin ve dilim morfolojisinin net olmadığı hipokampusun uç kısımlarındaki dokuları atın. Ardından, her dilimleme turundan sonra verniyeli mikrometreyi ayarlayarak kalan dokuyu 400 micron kalınlığında dilimlere ayırın. Her kesimden sonra, dilimi yumuşak kıllı bir fırça yardımıyla bıçaktan nazikçe alarak soğuk karbonatlı A CSF ile dolu küçük bir behere aktarın.

Ardından, temiz bir plastik past pipet kullanarak kesitleri nazikçe kesit odasındaki ağın üzerine aktarın. Geniş bir uçla, elektrot yerleşimini ve kayıt kontrolünü kolaylaştıracak şekilde kesitlerin konumunu dikkatlice ayarlayarak, kesitlerin yeterince A CSF tabakasıyla çevrelendiğinden ancak tamamen batmadığından emin olun. Bundan sonra, odayı kapatın ve sinaptik işaretleme ve yakalama deneylerinde kesitleri iki ila üç saat boyunca inkübe edin.

Mikroskop altında, Schaffer kollateral liflerini uyarmak için iki uyarıcı elektrodu CA1 bölgesinin stratum radiatum tabakasına ve bir kayıt elektrodunu, uyarıcı elektrotların arasında orta noktada yer alan CA1'in apikal dendritik bölgesine yerleştirin. fEPSP yanıtlarını kaydetmek için, popülasyon spike kaydı yapmak amacıyla stratum pyramidale tabakasına başka bir kayıt elektrodu yerleştirin.

Tüm elektrotlar kesite temas ettiğinde, her iki girişte de uygun bir alan EPSP sinyalinin alınabildiğinden emin olmak için bir test stimülasyonu uygulayın. Uygun bir F-E-P-S-P sinyali elde edildiğinde, manipülatörlerin hassas hareket düğmelerini kullanarak elektrotları dikkatlice yaklaşık 200 mikron daha aşağı indirin. Ardından, kesitin toparlanması için 20 dakika bekleyin.

Bundan sonra, 20 microamps ile 100 microamps arasındaki akım yoğunlukları aralığında alan EPSP eğimini ölçerek girdi-çıktı ilişkisini belirleyin. Ardından, her bir girdi için, maksimum alan EPSP eğiminin %40'ını uyaran stimülasyon yoğunluğunu deney boyunca sabit uyaran olarak belirleyin. 15 ila 20 dakika sonra bazal kayıt almaya başlayın; bir girdide L-T-P-L-T-D indüksiyonundan önce en az 30 ila 60 dakikalık stabil bir bazal kayıt alın ve tek bir yüksek frekanslı stimülasyondan oluşan zayıf bir tetin protokolü kullanarak erken bir LTP indükleyin.

Diğer giriş, erken LTP indüksiyonundan 30 dakika sonra bazal kayda devam ederken; 10 dakikalık trenler arası aralıkla tekrarlanan yüksek frekanslı stimülasyon içeren güçlü bir tetin protokolü kullanarak, ikinci S girişinde geç bir LTP indükleyin. Ardından, sinaptik etiketleme ve yakalama yoluyla birinci S girişindeki erken LTP'nin geç LTP'ye dönüşümünü ortaya çıkarmak için alan EPSP yanıtlarını uzun süreli kaydedin. Benzer şekilde, bir çapraz yakalama deneyinde, önce bir girişte erken bir LTP indükleyin ve bunu 30 dakika sonra, 15 dakikalık süre boyunca 900 patlamadan oluşan güçlü bir düşük frekanslı stimülasyon protokolü kullanarak diğer bir girişte geç LTD indüksiyonu ile takip edin.

Ardından, çapraz yakalama ile giriş S birindeki erken LTP'nin geç LTP'ye dönüşümünü ortaya çıkarmak için alan EPSP yanıtlarını uzun süreler boyunca kaydedin. Bu gösterimde, iki bağımsız ancak örtüşen sinaptik girişi uyarmak için CA bir bölgesinin stratum radiatum tabakasına iki uyarıcı elektrot yerleştirilmiştir. CA bir piramidal nöronları üzerine ise iki hücre dışı kayıt elektrodu yerleştirilir.

Biri apikal dendritik kompartmandan F-E-P-S-P kaydetmek için, diğeri ise sırasıyla stratum radiatum ve stratum pyramidale'de yer alan piramidal hücre gövdelerinden somatik popülasyon spike'ı kaydetmek için kullanılır. Bu şekil, sinaptik etiketleme ve yakalamayı incelemek için kullanılan zayıf-öncesi-güçlü paradigmasını göstermektedir.

Erken LTP'yi indüklemek için S bir'e zayıf tetanik uyarı uygulanmış, ardından geç LTP'yi indüklemek için 30 dakika sonra S iki'ye güçlü tetanik uyarı verilmiştir ve bu şekil, çapraz etiketlemeyi (cross tagging) incelemek için güçlü paradigmadan önceki zayıf durumu göstermektedir. S bir'de zayıf tetanik uyarı ile erken LTP indüklenmiş, ardından güçlü düşük frekanslı stimülasyon protokolü kullanılarak S iki'de geç LTD indüklenmiştir. S bir'de 30 dakika sonra, erken LTP altı saat süren geç LTP'ye dönüşerek çapraz etiketleme ve yakalamayı (capture) göstermiştir.

Bu diseksiyon ve kesit hazırlama tekniği bir kez kavrandıktan sonra, üç ila beş dakika içinde çok hızlı bir şekilde gerçekleştirilebilir. Böylece, uzun süreli kayıtlar için kesitlerin canlılığı korunabilir. Bu yöntem kullanılarak, farklı farmakolojik ajanların sinaptik etiketleme ve yakalama süreçleri üzerindeki etkileri de test edilebilir.

Bu videoyu izledikten sonra, uzun süreli fonksiyonel plastisite deneylerinin nasıl yürütüleceği ile sinaptik etiketleme ve yakalama süreçleri hakkında kapsamlı bir anlayışa sahip olmalısınız.