Kemirgenler gelen akut Hipokampal Dilimleri kullanarak Synaptic Etiketleme / yakalama ve Çapraz yakalama İncelenmesi

Bu prosedürün genel amacı, kemirgenlerden Q hipokampal dilimleri kullanarak CA one parametal nöronlarında sinaptik etiketleme, yakalama ve çapraz etiketleme gibi uzun vadeli plastisiteyi ve ilişkisel süreçlerini incelemektir. Bu, önce beynin diseke edilmesi ve hipokampusun soğuk oksijenli yapay beyin omurilik sıvısına hızlı bir şekilde izole edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, manuel bir doku dilimleyici kullanarak akut hipokampal dilimler hazırlamak ve bunları bir arayüz odasında inkübe etmektir.

Daha sonra, iki uyarıcı elektrot ve iki kayıt elektrodu, iki sinaptik girişten gelen alan EPSP ve popülasyon spike yanıtlarını kaydetmek için CA'nın bir bölgesine yerleştirilir. Son adım, belirli bir zaman penceresi içinde bir kez sinaptik girdide geçici bir plastisite formu ve başka bir girdide kalıcı bir plastisite formu indüklemektir. Sonuç olarak, her iki girdiden gelen alan EPSP yanıtları, sinaptik etiketleme yakalama ve çapraz yakalama mekanizmalarını araştırmak için uzun süreler boyunca kaydedilir.

Sinaptik etiketleme ve yakalama, kısa süreli belleğin belirli bir zaman dilimi içinde uzun süreli belleğe nasıl dönüştüğüne dair kavramsal bir temel sağlar. Bu yöntemin görsel gösterimi, deneysel adımların öğrenilmesi zor olduğu için kritik öneme sahiptir, çünkü bunlar çoklu sinaptik girdilerden stimülasyon ve kayıt içerir. Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan pala ve maima Sharma yüksek lisans öğrencileri Mahesh Shira olacak.

Bu prosedüre başlamak için bir BOS hazırlayın ve %95 oksijen ve %5 karbondioksit ile köpürtün. Arayüz haznesinin tabanını, kapasitesinin yaklaşık% 70'ine kadar damıtılmış su ile doldurun. Ardından sıcaklık kontrol cihazını 32 santigrat dereceye getirin.

Daha sonra, dakikada bir mililitrelik bir akış hızında A BOS'a geçmeden önce, giriş borusundan yüksek bir akış hızında damıtılmış su akıtarak üst hazneyi 10 ila 15 dakika yıkayın. Ardından, dilimler için bir dinlenme yüzeyi sağlamak için üst hazneye bir ağ yerleştirin. Karbojeni başlatın, alt hazne giriş borusunu sürekli olarak karbojen olan A BOS'a daldırın.

A BOS'un karbojenle doyurulması ve üst hazneyi doldurması için 20 dakika bekleyin. Bu adımda, kağıt mendil doğrayıcıya bir tıraş bıçağı takın ve kesici kenarın eşit şekilde hizalandığından emin olun. Bıçağın sıkıca sabitlendiğinden emin olmak için küçük bir filtre kağıdı doğrayarak test edin.

Ardından kayar sürmeli mikrometreyi başlangıç konumuna getirin. Şimdi ötenazi yapılmış bir farenin kafasını alın ve bir iris makası kullanarak, beyin sapını çıkarmak için arka kafatasından bir kesik yapın. Daha sonra kafatasının sağ tarafında küçük bir kesi ve solda daha uzun bir kesi yapın.

Kafatasını, sol taraftan başlayıp kafatasının sağ tarafına giden bir kemik UR ile dikkatlice çıkarın. Korteksi ve onu kaplayan ince dura tabakasını ortaya çıkarmak için, durayı ince bir spatula ile dikkatlice çıkarın ve ardından kemikli ön plakaları çıkarın. Daha sonra, özellikle korteks ve beyincik arasındaki kavşakta kalan durayı bir spatulanın düz ucuyla çıkarın ve basıncı yukarı doğru tutarak beyne zarar vermekten kaçının.

Spatulayı kullanarak, 11 numaralı bir neşter kullanarak hipokampusu izole etmek için soğuk ve karbonatlı bir BOS ile doldurulmuş bir alüminyum soğutma bloğu üzerindeki bir Petri kabına beyni nazikçe alın, beyinciği çıkarmak için düz bir kesim yapın ve beynin ön kısmının dörtte birini çıkarmak için başka bir kesim yapın. Ardından orta hat boyunca sığ bir sagital kesim yapın. Orta çizgiden başlayarak.

Dorsal hipokampusu ortaya çıkarmak için korteksi orak ölçekleyici ile dikkatlice çıkarın. Bundan sonra, hipokampusun üzerindeki korteks tabakasını çıkarın. Hipokampal komissür için küçük bir kesim yapın.

Hipokampusu, yuvarlanma hareketlerini kullanarak sırt ucundan başlayarak orak ölçekleyici ile nazikçe çıkarın. Daha sonra, orak ölçekleyicinin kavisli ucunu kullanarak izole edilmiş hipokampus etrafındaki tüm korteks ve bağ dokularını çıkarın. Hipokampal dokuyu dilimlemek için, manuel dilimleyicinin dilimleme aşamasına BOS ile ıslatılmış 30 milimetre watman filtre kağıdından bir parça yerleştirin.

Hipokampal dokuyu filtre kağıdına aktarın. Orak kaplamanın düz ucunu kullanarak, hipokampusu dilimleyicinin bıçağına göre uygun bir yönde hizalamak için filtre kağıdını hareket ettirin, böylece hipokampus fia'ya yaklaşık 70 derecelik bir açıyla dilimlenir. Ardından, hipokampal dokuyu çevreleyen fazla çözeltiyi kurulayın.

Katlanmış bir filtre kağıdı ile hipokampusu enine dilimleyin ve dilim morfolojisinin net olmadığı hipokampusun en uç noktasından dokuyu atın. Daha sonra kalan dokuyu her dilimleme turundan sonra sürmeli mikrometreyi ayarlayarak 400 mikron kalınlığında dilimler halinde dilimleyin. Her kesimden sonra, yumuşak kıllı bir fırça kullanarak dilimi bıçaktan nazikçe soğuk karbonatlı A BOS ile doldurulmuş küçük bir behere aktarın.

Ardından dilimleri temiz bir plastik geçmiş pipet kullanarak dilim haznesindeki fileye nazikçe aktarın. Geniş bir uçla, dilimlerin konumunu, elektrot konumunu ve kayıt kontrolünü kolaylaştıracak şekilde dikkatlice ayarlayın ve dilimlerin bir BOS tabakası ile yeterince çevrelendiğinden, ancak tamamen suya batırılmadığından emin olun. Bundan sonra, odayı örtün ve dilimleri sinaptik etiketleme ve yakalama deneylerinde iki ila üç saat inkübe edin.

Mikroskop altında, iki uyarıcı elektrotu, Schaffer kollateral liflerini uyarmak için bir bölge olan CA'nın stratum radi atomundaki iki uyarıcı elektrotu konumlandırın ve elektrotu kaydederken, uyarıcı elektrotlar arasında ca'nın apikal dendritik bölgesine bir orta yol açın. F-E-P-S-P yanıtlarını kaydetmek için, stratum parid'e başka bir kayıt elektrodu yerleştirin. Nüfus artışını kaydetmek için DO katmanı.

Tüm elektrotlar dilime dokunduğunda, her iki girişte de uygun bir alan EPSP sinyalinin elde edilebilmesini sağlamak için bir test stimülasyonu sağlayın. Uygun bir F-E-P-S-P sinyali elde edildikten sonra, manipülatörlerin ince hareket düğmelerini kullanarak elektrotları dikkatlice yaklaşık 200 mikron daha indirin. Ardından dilimin toparlanması için 20 dakika bekleyin.

Bundan sonra, 20 mikroamperden 100 mikroampere kadar bir dizi akım yoğunluğunda EPSP alanının eğimini ölçerek giriş çıkış ilişkisini belirleyin. Daha sonra her giriş için, maksimum alan EPSP eğiminin %40'ını uyandıran stimülasyon yoğunluğunu deney boyunca sabit uyaranlar olarak ayarlayın. 15 ila 20 dakika sonra, bir girişte L-T-P-L-T-D indüksiyonundan en az 30 ila 60 dakika önce kararlı bir taban çizgisi kaydına başlayın, tek bir yüksek frekanslı stimülasyondan oluşan zayıf bir tetin protokolü kullanarak erken bir LTP'yi indükleyin.

Diğer giriş, erken LTP indüksiyonundan 30 dakika sonra taban çizgisini kaydetmeye devam ederken, 10 dakikalık bir intertansiyon aralığı ile tekrarlanan yüksek frekanslı stimülasyonu içeren güçlü bir tetin protokolü kullanarak giriş S'de geç bir LTP'yi indükleyin. Ardından, sinaptik etiketleme ve yakalama ile giriş S'deki erken LTP'nin geç LTP'ye dönüşümünü ortaya çıkarmak için genişletilmiş süreler boyunca alan EPSP yanıtlarını kaydedin. Benzer şekilde, bir çapraz yakalama deneyinde, önce erken bir LTP ve 30 dakika sonra bir girdiyi, 15 dakikalık bir süre boyunca 900 patlamadan oluşan güçlü bir düşük frekanslı stimülasyon protokolü kullanarak başka bir girişte geç LTD indüksiyonu ile indükleyin.

Ardından, çapraz yakalama ile S girişindeki erken LTP'nin geç LTP'ye dönüşümünü ortaya çıkarmak için alan EPSP yanıtlarını uzun süreler boyunca kaydedin. Bu gösterimde, iki bağımsız ancak örtüşen sinaptik girişi uyarmak için CA'nın bir bölgesinin stratum radi atomunda iki uyarıcı elektrot konumlandırılır. CA üzerine bir parametal nöron, iki hücre dışı kayıt elektrodu.

Apikal dendritik bölmeden F-E-P-S-P'yi kaydetmek için biri. Ve parametal hücre gövdelerinden somatik popülasyon artışını kaydetmek için bir diğeri, sırasıyla stratum, radi, atom ve stratum para'da bulunur. Bu şekil, sinaptik etiketleme ve yakalamayı incelemek için güçlü bir paradigmadan önceki haftayı göstermektedir.

Erken LTP'yi indüklemek için S bir'e zayıf tetin uygulanır, ardından geç LTP'yi indüklemek için 30 dakikada S iki'nin güçlü tetini uygulanır ve bu şekil, çapraz etiketlemeyi incelemek için güçlü paradigmadan önceki haftayı gösterir. Erken LTP, S bir'deki zayıf tetin tarafından indüklenir, ardından güçlü bir düşük frekanslı stimülasyon protokolü kullanılarak S iki'de geç LTD'nin indüksiyonu yapılır. S one'da 30 dakika sonra, erken LTP, altı saat süren geç LTP'ye dönüştürülür ve çapraz etiketleme ve yakalama gösterilir.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu diseksiyon ve dilim hazırlama tekniği üç ila beş dakika içinde çok hızlı bir şekilde gerçekleştirilebilir. Böylece, uzun süreli kayıtlar için dilimlerin canlılığı korunabilir. Bu yöntemi kullanarak, farklı farmakolojik ajanların sinaptik etiketleme ve yakalama süreçleri üzerindeki etkileri de test edilebilir.

Bu videoyu izledikten sonra, uzun süreli fonksiyonel plastisite deneylerinin nasıl yürütüleceğini ve sinaptik etiketleme ve yakalama süreçlerini iyi anlamış olmalısınız.