Koku Meşfatının Olfaktör Duyusal Akson Moleküler Kimlik Kodlarının Görselleştirilmesi İçin Dörtlü İmmün Sulanması
June 5th, 2017
Koku duyu nöronları, uygun sinirsel devreleri oluşturmak için çok çeşitli akson sıralama moleküllerini ifade eder. Bu protokol, olfaktör duyu nöronlarının akson ucunda akson sıralama moleküllerinin kombinatoryal ifadelerini görselleştirmek için bir immünohistokimyasal boyama yöntemi tarif eder.
Bu immünohistokimyasal boyama yönteminin genel amacı, koku alma duyu nöronlarının akson terminallerinde akson sıralama moleküllerinin birleşik ekspresyonunu görselleştirmektir. Bu yöntem, akson rehberliği, sinaps oluşumları ve koku alma duyu nöronlarının yenilenmesi gibi koku alma gelişimi alanındaki temel süreçleri karakterize etmeye yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, bilim adamlarının, bölümler arasındaki varyasyonu sürdürmeden koku soğancığındaki akson sıralama moleküllerinin ekspresyon modellerini karşılaştırmasına ve analiz etmesine izin vermesidir.
Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi çok önemlidir, çünkü gömme adımının öğrenilmesi zordur, çünkü koku alma dokuları örneğinin kalıptaki konumunu ve açısını kelimelerle tanımlamak zordur. % 4 paraformaldehitin intrakardiyak perfüzyonu ile sabitlenmiş bir ila iki haftalık farelerin kafaları ile başlayın. Üst ve alt dişler arasındaki boşluğa bir makas bıçağı yerleştirin ve alt çene kemiğini çıkarmak için yatay olarak kesin.
Ardından, koku soğanı ve koku alma epiteli de dahil olmak üzere koku alma dokusunu bırakmak için fazla dokuyu forseps ve makasla kesin. Burun boşluğundaki havayı çıkarmak için koku alma dokusunu PBS'ye daldırın, ardından beynin arka kısmını çıkarmak için dikey bir kesi yapın ve koku dokusunu, kesilen ucu aşağı bakacak şekilde bir gömme kalıbının altına yerleştirin. Kalıbı optimum kesme sıcaklığı bileşiği ile doldurun ve ardından sıvı nitrojene batırın.
Doku ve OCT tamamen donduktan sonra, kriyostattaki dokuyu bir saat boyunca 20 santigrat derecede dengeleyin. Şimdi kriyostat ile koku soğancığının seri parasaggital kesitlerini yapın ve bunları MAS kaplı cam slaytlara yapıştırarak toplayın. Yapıştırdıktan sonra slaytları hemen bir fön makinesi ile kurulayın.
Kurutulmuş slaytları oda sıcaklığında beş dakika boyunca PBS ile yıkayarak immün boyamaya başlayın. Slaytları oda sıcaklığında% 5 blokaj çözeltisi ile bir saat inkübe ederek spesifik olmayan bağlanma bölgelerini bloke edin. Daha sonra, her slayta% 1 bloke edici çözelti içinde seyreltilmiş 400 mikrolitre bir birincil antikor kokteyli ekleyin.
Slaytları gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Ertesi gün, birincil antikor çözeltisini atın ve slaytları PBST ile her biri oda sıcaklığında beş dakika boyunca üç kez yıkayın. Daha sonra her slayta 400 mikrolitre ikincil antikor ve PBS kokteyli ekleyin.
Işıktan koruyun ve oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. İnkübasyonun ardından, çözeltiyi atın ve slaytları oda sıcaklığında PBS ile her biri beş dakika boyunca üç kez yıkayın. Son olarak, her kızağa iki damla montaj ortamı uygulayarak, örtü kızağını yerleştirerek ve hava kabarcıklarını çıkararak kapak kızaklarını kızaklara monte edin.
Her florofor için uygun filtreyi kullanarak floresan mikroskobu ile floresan görüntüler elde edin. Doygunluk olmadan görüntünün floresan sinyallerini elde etmek için pozlama süresini ayarlayın. Glomerüler yapıyı GLUT2'nin immünofloresan sinyalleri ile tanımlayın.
Glomerüller içindeki akson sıralama moleküllerinin boyama yoğunluklarını ölçmek için resim J'yi kullanın. Bu görüntü, VGLUT2'ye karşı antikorlarla boyanmış iki haftalık bir fareden alınan parasaggital koku soğanı bölümünü, Kirrel2'yi kırmızı renkle göstererek, Semaforin 7A'yı yeşil renkle ve OLPC'yi mavi renkle göstermektedir. Birleştirilmiş görüntü, glomerüler ayrışmada yer alan akson sıralama moleküllerinin konumdan bağımsız bir mozaik desende ifade edildiğini göstermektedir.
Her glomerulus, presinaptik belirteç VGLUT2'nin floresan sinyalleri ile tanımlanır. Glomerüler yapılar kesikli çizgilerle çevrilidir. Akson sıralama moleküllerinin sinyal yoğunlukları her glomerulusta ölçüldü.
Burada görüldüğü gibi, akson sıralama molekülleri her glomerulusta farklı şekilde ifade edilir. Örneğin, glomerulus 3, yüksek OLPC seviyelerine, orta Semaforin 7A seviyelerine ve daha düşük Kirrel2 seviyelerine sahiptir ve bu fark, boyama yoğunluğunun ölçülmesiyle ölçülebilir. Glomerulus 4 ise yüksek OLPC seviyelerine ve daha düşük Kirrel2 ve Semaphorin 7A seviyelerine sahiptir.
Yine, bu fark lekelenme yoğunluğu ölçülerek ölçülebilir. Bu prosedürü denerken, PFA ile fiksasyon sonrası ve normalde önerilen sükroz çözeltisi ile tedaviyi atlamayı unutmamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, tek koku soğanı bölümüne nasıl daha fazla glomerül yerleştirileceğini ve diğer beyin bölgelerine uygulanabilecek çoklu antikorlarla yüksek kaliteli immün boyamanın nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız.
Umut etmeyi unutmayın, bu yöntem gelecekteki deneylerinizde başarılı olmanıza yardımcı olacaktır.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu protokol, koku alma duyu nöronlarının akson sonlarındaki akson-sıralama moleküllerinin ekspresyonunu görselleştirmek için bir immühistokimyasal boyama yöntemini tasvir etmektedir. Bu teknik, akson yönlendirme ve sinaps oluşumu gibi koku alma gelişim süreçlerini anlamak için çok önemlidir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Koku alma gelişimi
- İmmünhistokimyasal boyama
Arka Plan
- Koku alma duyu nöronları koku alma duyusunda kilit rol oynar.
- Akson-sıralama molekülleri uygun sinir devrelerinin kurulması için gereklidir.
- Bunların ekspresyon paternlerini anlamak koku alma sistemi işlevleri hakkında bilgi sağlayabilir.
- Bu ekspresyonları görselleştirmek koku alma duyu nöronlarındaki rejenerasyon süreçlerinin incelenmesine yardımcı olabilir.
Çalışmanın Amacı
- Akson-sıralama moleküllerinin birleşik ekspresyonunu görselleştirmek.
- Koku alma gelişiminde kilit süreçleri karakterize etmek.
- Koku soğancığındaki ekspresyon paternlerinin karşılaştırılmasını kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- İmmünhistokimyasal boyama tekniği.
- Bir ila iki haftalık fare başlarının kullanılması.
- Fiksasyon için %4 paraformaldehit ile intrakardiyak perfüzyon.
- Koku alma dokusu örneklerinin gömülmes ve kesilmesi.
Ana Sonuçlar
- Akson-sıralama molekülü ekspresyonlarının başarılı görselleştirilmesi.
- Kesit varyasyonu olmadan ekspresyon paternlerini analiz etme yeteneğinin gösterilmesi.
- Koku alma dokularının gömülmesine yönelik açık bir yöntemin sağlanması.
- Tekniği öğrenmek için görsel gösterimlerin öneminin vurgulanması.
Sonuçlar
- İmmünhistokimyasal yöntem koku alma duyu nöronlarının incelenmesi için etkilidir.
- Akson-sıralama moleküllerinin anlaşılması koku alma sistemi gelişimi hakkında bilgiyi artırabilir.
- Bu teknik koku alma rejenerasyonu konusunda gelecekteki araştırmalar için değerli bir araç olabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This method enables precise molecular mapping of axon-sorting molecules in the olfactory bulb, supporting target validation in neurodevelopmental research. By allowing quantitative comparison of protein expression patterns across glomeruli without section-to-section variability, it enhances predictive confidence in mechanistic studies of neural circuit formation. The approach provides a scalable, reproducible platform for de-risking hypotheses related to axon guidance and synaptic specificity in preclinical discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of molecular identity codes at axon termini to clarify target engagement mechanisms in olfactory sensory neuron development.
- Operational Value: Supports functional target validation by correlating axon-sorting molecule expression with glomerular organization patterns.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by establishing standardized immunostaining protocols for multiplex protein detection.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through consistent glomerular definition using VGLUT2 as a presynaptic marker.
- Strategic Value: Highlights screening readiness via quantitative intensity measurements that enable reliable comparison of molecular expression across experimental conditions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Discusses disease relevance by linking axon-sorting molecule codes to neural circuit formation processes applicable to neurodegenerative models.
- Operational Value: Describes continuity from discovery through preclinical validation by enabling longitudinal analysis of axonal regeneration and reinnervation patterns.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification by providing molecular resolution of axon guidance mechanisms critical for neurotherapeutic development.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing of OR-specific axon guidance through combinatorial molecular code visualization at axon termini.
- Screening: Describes assay readiness through standardized section collection and immunostaining that minimizes technical variation across samples.
- Analytics: Highlights quantitative readouts from ImageJ-based intensity measurements that enable statistical comparison of axon-sorting molecule expression across glomeruli.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity by enabling analysis of olfactory regeneration processes relevant to injury models.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability for multiplex protein profiling in other brain regions beyond the olfactory system.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through direct visualization of molecular determinants of axonal segregation.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability achieved via consistent tissue embedding and sectioning protocols.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in neural pathway models.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization through quantitative biomarker-like readouts of axon-sorting molecule co-expression patterns.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in immunohistochemistry, cryosectioning, and fluorescent microscopy.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs including cryostat, fluorescence microscope, and image analysis software.
- Cross-team standardization requirements for antibody validation and staining protocol consistency.
- Adaptation considerations across model systems, particularly for tissues with different embedding properties.
- Practical limitations include the technical challenge of tissue orientation in embedding molds, which requires hands-on training to master.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
5:42
Conclusion
4:26
Results: Quantification of Axon-sorting Molecules in the Olfactory Bulb
1:11
Preparation of Parasagittal Olfactory Bulb Sections
2:33
Day 1: Quadruple Immunostaining of Olfactory Bulb Slices
3:07
Day 2: Quadruple Immunostaining of Olfactory Bulb Slices
3:56
The Use of Fluorescence Intensity Measurements
