Koku Meşfatının Olfaktör Duyusal Akson Moleküler Kimlik Kodlarının Görselleştirilmesi İçin Dörtlü İmmün Sulanması

Bu immünohistokimyasal boyama yönteminin genel amacı, koku alma duyusuna sahip duyusal nöronların akson uçlarındaki akson sıralama moleküllerinin kombine ekspresyonunu görselleştirmektir. Bu yöntem; akson yönlendirmesi, sinaps oluşumları ve koku alma duyusuna sahip duyusal nöronların rejenerasyonu gibi koku alma gelişim alanıındaki temel süreçlerin karakterize edilmesine yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, bilim insanlarının kesitler arasında varyasyon oluşmasına izin vermeden, olfaktör bulbdaki akson sıralama moleküllerinin ekspresyon modellerini karşılaştırmasına ve analiz etmesine olanak tanımasıdır.

Gömme adımı, koku dokusu örneğinin kalıptaki konumunun ve açısının kelimelerle tarif edilmesinin zor olması nedeniyle öğrenilmesi güçtür; bu nedenle bu yöntemin görsel gösterimi kritiktir. %4 paraformaldehit ile intrakardiyak perfüzyon yoluyla fikse edilmiş, bir ila iki haftalık fare kafaları ile başlayın. Üst ve alt dişler arasındaki boşluğa bir makas ucu yerleştirin ve alt çene kemiğini çıkarmak için yatay olarak kesin.

Ardından, olfaktör bulb ve olfaktör epitelyumu içeren koku dokusunu bırakacak şekilde fazla dokuyu pens ve makasla kesin. Burun boşluğundaki havayı çıkarmak için koku dokusunu PBS içine daldırın, ardından beynin arka kısmını çıkarmak için dikey bir kesi yapın ve koku dokusunu, kesilen uç aşağı bakacak şekilde bir gömme kalıbının tabanına yerleştirin. Kalıbı optimal kesme sıcaklığı bileşiği (OCT) ile doldurun ve ardından sıvı azota daldırın.

Doku ve OCT tamamen dondurulduktan sonra, dokuyu kriyostatta 20 °C'de bir saat boyunca dengeleyin. Şimdi kriyostatla olfaktör bulbun seri parasajital kesitlerini alın ve bunları MAS kaplı cam lamlara yapıştırarak toplayın. Yapıştırma işleminden sonra lamları bir saç kurutma makinesiyle hemen kurutun.

Kurutulmuş lamları oda sıcaklığında beş dakika boyunca PBS ile yıkayarak immün boyamaya başlayın. Lamları oda sıcaklığında bir saat boyunca %5'lik bloklama çözeltisi ile inkübe ederek spesifik olmayan bağlanma bölgelerini bloke edin. Ardından her bir lama, %1'lik bloklama çözeltisi içinde seyreltilmiş primer antikor kokteylinden 400 microliters ekleyin.

Slaytlara oda sıcaklığında gece boyunca inkübasyon yapın. Ertesi gün, primer antikor solüsyonunu dökün ve slaytları oda sıcaklığında beşer dakikalık üç yıkama ile PBST ile yıkayın. Ardından her bir slayta 400 mikrolitre sekonder antikor ve PBS kokteyli ekleyin.

Işıktan koruyun ve oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. İnkübasyonun ardından solüsyonu dökün ve lamları oda sıcaklığında, her biri beş dakika sürecek şekilde PBS ile üç kez daha yıkayın. Son olarak, her lama iki damla kapatma medyumu uygulayıp lamelini yerleştirerek ve hava kabarcıklarını gidererek lamları kapatın.

Her bir florofor için uygun filtreyi kullanarak floresan mikroskobu ile floresan görüntüler elde edin. Görüntüde doygunluk oluşmadan floresan sinyallerini almak için pozlama süresini ayarlayın. Glomerüler yapıyı GLUT2'nin immunofloresan sinyalleri ile tanımlayın.

Glomeruli içindeki akson sıralama moleküllerinin boyama yoğunluklarını ölçmek için Image J kullanın. Bu görüntü, VGLUT2'ye karşı antikorlarla immünoboya uygulanmış, Kirrel2 kırmızı, Semaphorin 7A yeşil ve OLPC mavi olarak gösterilen, iki haftalık bir fareye ait parasagittal olfaktör bulb kesitini göstermektedir. Birleştirilmiş görüntü, glomerüler ayrışmada yer alan akson sıralama moleküllerinin konumdan bağımsız bir mozaik örüntüde eksprese edildiğini kanıtlamaktadır.

Her bir glomerulus, presinaptik belirteç VGLUT2'nin floresan sinyalleri ile tanımlanmıştır. Glomerüler yapılar kesikli çizgilerle çevrelenmiştir. Akson sıralama moleküllerinin sinyal yoğunlukları her bir glomerulusta ölçülmüştür.

Burada görüldüğü üzere, akson sıralama molekülleri her bir glomerulde farklı şekilde eksprese edilmektedir. Örneğin, glomerulus 3 yüksek seviyelerde OLPC, orta seviyelerde Semaphorin 7A ve daha düşük seviyelerde Kirrel2 içerir ve bu fark, boyama yoğunluğu ölçülerek nicelleştirilebilir. Öte yandan glomerulus 4, yüksek seviyelerde OLPC ve daha düşük seviyelerde Kirrel2 ve Semaphorin 7A içerir.

Tekrar belirtmek gerekirse, bu fark boyama yoğunluğu ölçülerek nicelleştirilebilir. Bu prosedürü uygularken, normalde önerilen PFA ile sabitleme sonrası işlemin ve sükroz çözeltisi ile işlemin atlanması gerektiğini unutmamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, tek bir olfaktor bulb kesitine nasıl daha fazla glomerulus yerleştirileceği ve diğer beyin bölgelerine de uygulanabilecek şekilde çoklu antikorlarla nasıl yüksek kaliteli immünboyama yapılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

Umudunuzu kaybetmeyin, bu yöntem gelecekteki deneylerinizde başarılı olmanıza yardımcı olacaktır.