Serebral İskemiye Karşı Asitik Sonrası Sonrasyonun Sinir Korumasını Çalıştırmak için Deney Modelleri

Orta serebral arter oklüzyon modelinde kortiko striatal kesit modelinde asidoz tedavisinin genel amacı, asidik son koşullandırmanın serebral iskemiye karşı nöroprotektif etkisini incelemektir. Bu yöntem, asidoz sonrası koşullandırmanın iskemik beyin hasarını nasıl koruyabileceğine dair temel soruları yanıtlamaya ve inme tedavisi için yeni stratejiler geliştirmeye yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, asidoz sonrası koşullandırmanın nöroproteksiyonunu incelemek için yaygın olarak bulunan deney modellerini kullanabilmektir.

Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olan Yarong Zheng olacak. Beynini ince bir spatula ile kafası kesilmiş bir farenin kafatasından çıkararak ve yüzde beş karbondioksit ve% 95 oksijen ile dengelenmiş buz gibi soğuk normal ACSF içeren bir behere dikkatlice bırakarak başlayın. Vibraton plakasına iki şerit halinde kriyopresipitat yapıştırıcısı sürün.

Beyni desteklemek için bıçaktan en uzak tutkal şeridine yüzde üç agarozdan bir parça koyun. Sonra beyni filtre kağıdına aktarmak için forseps kullanın. Ön direği ve beyinciği bir bıçakla kesin.

Beyin dokusunu, beyin agaroza yaslanacak şekilde serbest tutkal şeridi üzerine dikey olarak yerleştirin. Beyni daldırmak için kesme haznesine buz gibi soğuk ACSF ekleyin ve buz tutucu alanına buz ekleyin. ACSF'yi rezervuarda yüzde beş karbondioksit ve% 95 oksijen ile kabarcıklı tutun.

Vibratonu 400 mikronluk kesitleri kesecek şekilde ayarladıktan ve beyni kesme bıçağına göre doğru şekilde konumlandırdıktan sonra, otomatik kesimi başlatmak için başlat-durdur düğmesine basın. Beş beyin dilimini tek tek aktarmak için kesik uçlu bir Pasteur pipeti kullanın ve bunları yüzde beş karbondioksit ve% 95 oksijen ile köpürtülmüş buz gibi soğuk normal ACSF'de doku tutucuya yerleştirin. Oda sıcaklığında 30 dakika sonra, sinaptik fonksiyonu geri kazanmak için beyin dilimlerini on dakika boyunca 37 santigrat derecede bir su banyosuna yerleştirin.

Glikozsuz ACSF ve asidik ACSF'yi 37 santigrat derece su banyosuna yerleştirin ve çözeltileri sırasıyla yüzde beş karbondioksit ve% 95 nitrojen ve% 20 karbondioksit ve% 80 oksijen ile 30 dakika boyunca köpürtün. Beş beyin diliminden dördünü önceden ısıtılmış 37 santigrat derece, glikozsuz ACSF'ye dikkatlice aktarın ve 15 dakika inkübe edin. Asidik ön koşullandırma için zaman penceresini incelemek için, bir dilimi doğrudan glikoz içermeyen ACSF'den asidik ACSF'ye aktarın ve diğer üç dilimi reperfüzyon için normal ACSF'ye aktarın.

Üç dakika sonra asidik ACSF'deki dilimi normal ACSF'ye aktarın. Daha sonra normal ACSF'de beş dakika sonra, normal ACSF'den dilimlerden birini asidik ACSF'deki doku tutucuya üç dakika boyunca aktarın. Reperfüzyondan 15 dakika sonra aynı şekilde başka bir dilim daha aktarın.

Glikoz içermeyen ACSF'ye yerleştirilen ancak asidik ACSF'ye yerleştirilmeyen kalan dilim, oksijen glikoz yoksunluğu grubu olarak ayarlanır. Dilimleri ACSF'den TTC çözeltisi içeren 24 oyuklu bir plakanın kuyucuklarına aktarın. Çözeltideki dilimi gerin.

Daha sonra sığ bir su banyosunda 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Daha sonra dilimleri folyo ile kaplı temiz, tartılmış, 1,5 mililitrelik santrifüj tüplerine aktarın ve dilimlerin kuru ağırlığını ölçün. Tartıldıktan sonra, tüplere 10'a bir hacim / ağırlık oranında bire bir etanol ve dimetil sülfoksit çözeltisi ekleyerek Formazan'ı çıkarın.

24 saat boyunca ışıktan uzakta kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, etanol dimetil sülfoksit çözeltisini tüplerden 96 oyuklu bir plakaya aktarın ve bir plaka okuyucu kullanarak 490 nanometrede absorbansı ölçün. İlk olarak, ayak parmağı sıkıştırma refleksinin yokluğunda uygun anesteziyi onaylayın.

Daha sonra kafatasına bağlı LDF probu ile anestezi uygulanmış fareyi sırtüstü pozisyonda yerleştirin ve steril pamuk iplikleri kullanarak sabitleyin. Boynun traşlı cildini %75 etil alkol ile dezenfekte edin. Daha sonra boyunda peri medyan cilt kesisi yaptıktan sonra, kan damarlarını ortaya çıkarmak için yumuşak dokuları forseps ile inceleyin.

Maruz kalan dokulara nemli kalmaları için bir damla salin ekleyin. Daha sonra, ortak karotis arteri çevreleyen dokudan ve vagus sinirinden ayırmak için oftalmik forseps kullanın. Vagus sinirine zarar vermemeye dikkat edin.

Ortak karotis arterin distal ucuna bir mikro damar klempi yerleştirin. Ve proksimal uçta 6-0 ipek dikişlerle ölü bir düğüm atın. Daha sonra geçici bir dikiş olarak kelepçeye proksimalde gevşek bir düğüm bağlayın.

Ardından, iki düğüm arasında ölü düğüme mümkün olduğunca yakın küçük bir uzunlamasına kesi yapmak için mikro oftalmik makas kullanın. Şimdi 12 milimetrelik, ucu körelmiş bir monofilamenti insizyondan arter lümenine yerleştirin ve birkaç milimetre ilerletin. Monofilamentin ucunun etrafındaki gevşek düğümü sıkın ve ardından kelepçeyi çıkarın.

Ardından, LDF yazılımı kan akışında keskin bir düşüş gösterene kadar filamenti iç karotis artere ilerletmek için oftalmik forseps kullanın. Oklüzyonun başlangıç zamanını kaydedin. Daha sonra LDF probunu kesin ve fareyi bir saatlik oklüzyon süresi boyunca 30 santigrat derece inkübatöre koyun.

Oklüzyonun başlamasından 55 dakika sonra hayvanı izofluran ile uyuşturun ve hayvanı daha önce olduğu gibi konumlandırın. Ardından boyun kesisini açın ve ortak karotis arteri yeniden ortaya çıkarın. Oklüzyon döneminden sonra, reperfüzyon elde etmek için filamenti nazikçe çıkarmak için oftalmik forseps kullanın.

Daha sonra düğümü sıkarak geçici dikişi kalıcı hale getirin. Asidoz tedavisi için, burun konisi tarafından solunan gazı beş dakika boyunca %20 karbondioksit, %20 oksijen ve %60 nitrojen ile değiştirin. Kesi kesintili bir cerrahi dikişle kapatıldıktan sonra, fare bilincini geri kazanana kadar fareyi 30 derece ısıtılmış bir kafese yerleştirin.

Bu histogram, bu videoda gösterildiği gibi oksijen glikoz yoksunluğu ve asidik son koşullandırmadan sonra kortikal dilimler üzerinde gerçekleştirilen TTC testinin sonuçlarını göstermektedir. Tedaviye oksijen glukoz yoksunluğundan hemen veya beş dakika sonra başlanırsa üç dakikalık asidoz tedavisi nöroprotektifti, ancak dilimler 15 dakika boyunca yeniden perfüze edildiyse değildi. Fareler 60 dakikalık orta serebral arter tıkanıklığına tabi tutuldu ve reperfüzyondan beş, 50 veya 100 dakika sonra beş dakika boyunca% 20 karbondioksit solunarak tedavi edildi.

Enfarktüs hacmi, siyah noktalı çizgilerle gösterildiği gibi reperfüzyondan 24 saat sonra iki, üç, beş trifeniltetrazolyum hidroklorür boyaması ile ölçüldü. Bu histogram, her koşul için enfarktüs hacmi yüzdesini gösterir. Asidik son koşullandırmadan kaynaklanan nöroproteksiyon, başlangıç zamanı reperfüzyondan 50 dakika sonrasına ertelendiğinde bile sağlamdı.

Ancak 100. dakikada başlanan asidoz tedavisi iskemik hasara engel olmadı. Videoyu izledikten sonra, beyin dilimlerinin OGD modelinde ve farelerin MSO modelinde asidoz sonrası koşullandırmanın nöroproteksiyonunun nasıl çalışılacağını iyi anlamış olmalısınız. Prosedürleri denerken, koruyucu etkilerin çoğaltılması için asidozun uzamasının ve süresinin çok önemli olduğunu hatırlamak önemlidir.