İnsan yağ dokusu mikrovasküler işlevini kullanarak Videomicroscopy değerlendirilmesi

Bu videomikroskopi tekniğinin genel amacı, farmakolojik ve fizyolojik uyaranlara yanıt olarak izole edilmiş mikrodamarların fonksiyonel özelliklerini incelemek ve insanlarda vasküler disfonksiyona katkıda bulunan patofizyoloji ve moleküler mekanizmalar hakkında bilgi sağlamaktır. Bu yöntem, sistemik hastalıklarla bağlantılı olan yağ içindeki lokal mikrovaskülatürün işlev bozukluğuna katkıda bulunan moleküler mekanizmaları anlamak için yararlıdır. Bu tekniğin temel avantajları, kan damarlarının insan vücudundan bir süre alındıktan sonra işlevsel kalması ve fizyolojik özellikleri açısından kolayca incelenebilmesidir.

Bu deneysel yaklaşımın klinik önemi, hastalık koşullarında farklı şekilde değiştirilen yolları tanımlamamıza ve potansiyel olarak yeni terapötik hedefleri keşfetmemize izin vermesidir. Doku diseksiyon mikroskobu altında, yağ numunesi içindeki küçük arterlerden çevredeki yağ ve bağ dokusunu dikkatlice çıkarmak için mikromakas ve mikroforseps kullanın. Arterleri venüllerden ayırt etmek önemlidir.

Arterler tipik olarak çap olarak daha küçüktür, daha büyük bir ton gösterir ve venüllerden daha sağlam yanıt verir. Arter izole edildiğinde, herhangi bir dalı bağlamak için naylon veya ipek dikişler kullanın. Ardından, boruyu yavaşça taze Krebs çözeltisi ile doldurmak için 10 mililitrelik bir şırınga kullanın.

Ardından, hazne içindeki basınç rezervuarlarına ve cam kılcal pipetlere kauçuk tüpler takın. Daha sonra, diseke edilmiş arterili organ odasına taşıyın ve damarı cam kılcal pipetlerin üzerine kanüle edin. Arterin her iki ucunu da naylon dikişlerle pipetlere dikkatlice sabitleyin.

Kap sabitlendikten sonra, Krebs tamponunu hazneden yavaşça çıkarın ve hazneye iki mililitre taze Krebs çözeltisi ekleyin. Daha sonra, organ odasını bir video kamera ile donatılmış ters çevrilmiş bir mikroskop sahnesine takın. Kenar algılama yazılımını bir kilohertz örnekleme hızında açın.

Kalan basınçlı boruyu ikinci Krebs çözeltisi dolu basınç rezervuarına bağlayın ve ardından basınç rezervuarlarını basınç dönüştürücüsüne bağlayın. Tüm borular bağlandığında, ısıtma bloğunu 37 santigrat dereceye ayarlayın. Daha sonra, izole edilmiş kan damarının lümeni içinde uygun deneysel basıncı elde etmek için intraluminal basıncı her beş dakikada bir kademeli olarak beş mililitre cıvaya çıkarmak için basınç kontrol ünitesini kullanın.

Basınç 60 mililitre cıvaya ulaştığında damarın 20 ila 30 dakika dengelenmesine izin verin ve istirahatte adipoz arterin çapını kaydedin. Dengeleme süresinin sonunda, damar çapı uygun şekilde daralana kadar her beş dakikada bir banyoya doğrudan bir mikrolitre endotelin 1 ekleyerek kan damarını dinlenme taban çizgisi çapının yaklaşık% 55'ine kadar önceden daraltın. Akışa bağlı endotelyal bağımlı vazodilatasyon için, arteriyelin intraluminal boşluğuna eşit ve zıt yönlerde sürekli akışı indükleyin, böylece 60 milimetre cıvanın ortalama intraluminal basıncını değiştirmeden damar boyunca bir basınç farkı geliştirilebilir.

Üç ila beş dakika sonra, akış aracılı genişlemeyi ölçün. Her basınç gradyanı artışını, her beş ila altı dakikada bir 10 santimetre su değişimi ile maksimum 100 santimetre suya kadar artırın. Akış aracılı kap genişlemesini değerlendirdikten sonra, akış indüksiyonunu durdurmak için basınç rezervuarlarını aynı yüksekliğe getirin.

Sonra hemen, ancak askıya alınmış arterili rahatsız etmeden hazne çözeltisini taze Krebs çözeltisi ile dikkatlice değiştirin ve damarın 20 ila 30 dakika boyunca taban çizgisi çapına dönmeye başlamasına izin verin. Arteriyel dinlenme taban çizgisi çapına geri döndüğünde, ince bir kolin aracılı endotelyal bağımlı vazodilatasyon değerlendirilebilir. Bu, daha önce gösterildiği gibi, damarın endotelin 1 ile dinlenme çapının yaklaşık% 55'ine kadar önceden daraltılmasıyla başlar.

Ön daralma sağlandıktan sonra, doğrudan banyoya iki mikrolitre artan dozda asetilkolin ekleyin. Her dozun uygulanmasından beş dakika sonra arteriyel çaptaki değişikliği kaydedin. Asetilkolin doz yanıtının tamamlanmasının ardından, papaverin ve endotel bağımsız vazodilatörün doğrudan banyoya sıralı olarak uygulanmasıyla endotelden bağımsız vazodilatasyonu ve damar canlılığını değerlendirin.

Artan akışa ve saf strese veya asetilkoline endotel bağımlı vazodilatasyon yanıtları, insan obezitesinde viseral ve subkutan adipoz arterlerde önemli ölçüde körelir. Bununla birlikte, papaverine yanıt olarak endotelden bağımsız vazodilatasyon, iki dipoz arasında farklı şekilde değiştirilmez, bu da viseral alanlardaki vasküler disfonksiyonun büyük ölçüde, en azından hastalığın erken evrelerinde, endotel seviyesindeki disfonksiyonun bir sonucu olduğunu düşündürür. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa üç ila beş saat içinde tamamlanabilir.

Bu prosedürü denerken, zaman ayırmayı ve gayretli olmayı unutmamak önemlidir, çünkü kan damarlarındaki küçük hasarlar bile sonuçları çarpıtabilir. Bu prosedürü takiben, insan hastalığında belirli genlerin vazomotor fonksiyon üzerindeki etkisi hakkında ek soruları yanıtlamak için kan damarlarının siRNA transfeksiyonu gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Geliştirildikten sonra, bu teknik, yağ dokusu mikroçevresinin insan obezitesinde lokal vasküler sağlık üzerindeki etkisini araştırmak için yağ dokusu biyolojisi ve mikrosirkülasyon alanındaki araştırmacıların yolunu açtı.

Bu videoyu izledikten sonra, non-invaziv görüntüleme ile tekrarlanamayan bir süreç olan, canlı deneklerden çıkarılan insan kan damarlarının tüm bozulmamış bölümlerinin patofizyolojisini doğrudan nasıl araştıracağınızı iyi anlamalısınız.