İnsan yağ dokusu mikrovasküler işlevini kullanarak Videomicroscopy değerlendirilmesi

Bu videomikroskopi tekniğinin genel amacı, izole edilmiş mikrovasküllerin farmakolojik ve fizyolojik uyarılara verdiği yanıtları inceleyerek, insanlarda vasküler disfonksiyona katkıda bulunan patofizyoloji ve moleküler mekanizmalar hakkında bilgi sağlamaktır. Bu yöntem, sistemik hastalıklarla ilişkilendirilen yağ dokusu içerisindeki lokal mikrovaskülatür disfonksiyonuna katkıda bulunan moleküler mekanizmaları anlamak için faydalıdır. Bu tekniğin temel avantajları, kan damarlarının insan vücudundan çıkarıldıktan sonra bir süre daha fonksiyonel kalması ve fizyolojik özelliklerinin kolayca incelenebilmesidir.

Bu deneysel yaklaşımın klinik önemi, hastalık durumlarında farklı şekilde değişen yolakları tanımlamamıza ve potansiyel olarak yeni terapötik hedefler keşfetmemize olanak tanımasıdır. Bir doku diseksiyon mikroskobu altında, yağ örneği içindeki küçük arteriyellerin çevresindeki yağ ve bağ dokusunu dikkatlice temizlemek için mikro makas ve mikro pens kullanın. Arteriyelleri venüllerden ayırt etmek esastır.

Arteryoller tipik olarak daha küçük çaplıdır, daha yüksek tona sahiptir ve venüllerden daha güçlü tepki verirler. Arteriyol izole edildikten sonra, dalları bağlamak için naylon veya ipek süturlar kullanın. Ardından, tüpü taze Krebs solüsyonu ile yavaşça doldurmak için 10 mililitrelik bir şırınga kullanın.

Ardından, basınç rezervuarlarına ve oda içindeki cam kapiler pipetlere kauçuk tüpler takın. Sonra, diseke edilmiş arteri organ odasına taşıyın ve damarı cam kapiler pipetlere kanüle edin. Arterin her iki ucunu naylon sütürlerle pipetlere dikkatlice sabitleyin.

Kap sabitlendikten sonra, Krebs tamponu odadan yavaşça uzaklaştırın ve odaya iki mililitre taze Krebs çözeltisi ekleyin. Ardından, organ odasını video kamera ile donatılmış ters bir mikroskobun tablasına sabitleyin. Kenar tespit yazılımını bir kilohertz örnekleme hızında çalıştırın.

Geriye kalan basınçlı tüpü, Krebs çözeltisiyle doldurulmuş ikinci basınç rezervuarına bağlayın ve ardından basınç rezervuarlarını basınç dönüştürücüye bağlayın. Tüm tüpler bağlandığında, ısıtma bloğunu 37 °C'ye ayarlayın. Daha sonra, izole edilmiş kan damarının lümeni içerisinde uygun deneysel basınca ulaşmak için basınç kontrol ünitesini kullanarak intralüminal basıncı her beş dakikada bir beş mmHg kademeli olarak artırın.

Basınç 60 mmHg seviyesine ulaştığında, kabın 20 ila 30 dakika boyunca dengelenmesine izin verin ve dinlenme halindeki adipoz arterin çapını kaydedin. Dengelenme süresinin sonunda, damar çapı uygun şekilde daralana kadar her beş dakikada bir banyoya doğrudan bir µL endothelin 1 ekleyerek kan damarını dinlenme bazal çapının yaklaşık %55'ine kadar önceden daraltın. Akışla indüklenen endotel bağımlı vazodilatasyon için, arterin intralüminal boşluğuna, ortalama 60 mmHg intralüminal basıncı değiştirmeden damar boyunca bir basınç farkı oluşturulabilecek şekilde, eşit ve zıt yönlerde sürekli akış indükleyin.

Üç ila beş dakika sonra akış aracılı dilatasyonu ölçün. Basınç gradyanındaki her bir artışı, maksimum 100 centimeter of water seviyesine ulaşana kadar her beş ila altı dakikada bir 10 centimeter of water şeklinde artırın. Akış aracılı damar dilatasyonunu değerlendirdikten sonra, akış indüksiyonunu durdurmak için basınç rezervuarlarını aynı yüksekliğe geri getirin.

Ardından, askıdaki arteri rahatsız etmeden, hazne solüsyonunu hemen ancak dikkatli bir şekilde taze Krebs solüsyonu ile değiştirin ve damarın 20 ila 30 dakika boyunca bazal çapına dönmeye başlamasına izin verin. Arter dinlenme halindeki bazal çapına döndüğünde, kolin aracılı hafif endotel bağımlı vazodilatasyon değerlendirilebilir. Bu işlem, daha önce gösterildiği gibi, damarın öncelikle endotelin 1 ile dinlenme çapının yaklaşık %55'ine daraltılmasıyla başlar.

Ön daralma sağlandıktan sonra, banyoya doğrudan artan dozlarda iki mikrolitre asetilkolin ekleyin. Her dozun uygulanmasından beş dakika sonra arter çapındaki değişikliği kaydedin. Asetilkolin doz yanıtı tamamlandığında, papaverin ve endotelyumdan bağımsız vazodilatörü sırasıyla doğrudan banyoya uygulayarak endotelyumdan bağımsız vazodilatasyonu ve damar canlılığını değerlendirin.

İnsan obezitesinde, artan akış ve kayma stresine veya asetilkoline karşı endotelyuma bağımlı vazodilatasyon yanıtları, viseral adipöz arterlerde subkutan adipöz arterlere kıyasla önemli ölçüde azalmıştır. Bununla birlikte, papaverine yanıtındaki endotelyumdan bağımsız vazodilatasyon her iki adipöz doku arasında farklılık göstermemektedir; bu durum, viseral bölgelerdeki vasküler disfonksiyonun, özellikle hastalığın erken evrelerinde, büyük ölçüde endotelyum düzeyindeki disfonksiyondan kaynaklandığını göstermektedir. Bu teknikte uzmanlaşıldığında, prosedür uygun şekilde yürütülürse üç ila beş saat içinde tamamlanabilir.

Bu prosedürü uygularken, kan damarlarında meydana gelecek küçük hasarların bile sonuçları saptırabileceği göz önünde bulundurularak, acele etmemek ve titiz davranmak önemlidir. Bu prosedürün ardından, belirli genlerin insan hastalıklarındaki vazomotor fonksiyon üzerindeki etkisine dair ek soruları yanıtlamak için kan damarlarının siRNA transfeksiyonu gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, yağ dokusu biyolojisi ve mikrosirkülasyon alanındaki araştırmacıların, insan obezitesinde yağ dokusu mikroçevresinin yerel vasküler sağlık üzerindeki etkisini keşfetmelerine ön ayak olmuştur.

Bu videoyu izledikten sonra, yaşayan deneklerden alınan ve invaziv olmayan görüntüleme yöntemleriyle tekrarlanamayan bir süreç olan, insan kan damarlarının bütün halindeki segmentlerinin patofizyolojisinin doğrudan nasıl inceleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.