Çift iplikçikli RNA'ların tek iplikçikli RNA'ların tarafından üzerinde fingerprinting ve seçici tanınması, kimyasal olarak peptit nükleik asitler modifiye

Bu yöntem makalesinin genel amacı, laboratuvarımız tarafından kimyasal olarak modifiye edilmiş peptid nükleik asitlerin çift sarmallı RNA'ları moleküler düzeyde tanımasını incelemek için kullanılan ayrıntılı protokolleri tanıtmaktır. Bu yöntem, RNA kimyasal biyolojisi alanında RNA yapılarının tespiti ve hedeflenmesi gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, tasarım ilkelerinin herhangi bir RNA dupleks yapısının hedeflenmesinde uygulanabilir olmasıdır.

Prosedürü, laboratuvarımdan araştırma görevlisi Desiree Toh uygulamalı olarak gösterecektir. Bu prosedüre başlamak için, önceden hazırlanmış RNA PNA örneklerine dört µL %35'lik gliserol çözeltisi ekleyin ve nazikçe karıştırın. Bir mikropipet ve jel yükleme uçları kullanarak, hava kabarcığı oluşmamasına dikkat ederek her bir örnekten 20 µL'yi önceden hazırlanmış poliakrilamid jele dikkatlice yükleyin.

Jeli 250 volt sabit voltajda beş saat boyunca çalıştırın. Beş saat sonra güç kaynağını kapatın ve cam plakayı jel standından çıkarın. Ardından jel sızdırmazlık bandını çıkarın ve cam plakayı sökün.

Jeli cam plakadan nazikçe çıkarın ve 350 mililitre deiyonize su ile doldurulmuş bir kaba yerleştirin. Kaba dikkatlice 35 mikrolitre etidyum bromür ekleyin ve düşük hızda 30 dakika boyunca platform çalkalayıcıya yerleştirin. Etidyum bromür çözeltisini bertaraf ettikten sonra, jeli 1,5 ila iki litre distile su ile durulayın.

Ardından jeli, 532 nanometrelik yeşil lazerli bir görüntüleme cihazı ve 610 nanometreye ayarlanmış emisyon filtresi kullanarak tarayın. Jel bant yoğunluklarını ücretsiz bir yazılım kullanarak nicelleştirin. Uygun miktardaki 2-aminopurin işaretli çift zincirli RNA'yı temiz bir 1.5 mililitrelik tüpe aktarın.

Ardından, RNA çözeltilerini bir vakumlu konsantratör kullanarak konsantre edin. Sonrasında, önceden hazırlanmış ana stoktan farklı konsantrasyonlar için uygun hacimlerdeki hedef PNA'yı ayrı 1,5 mililitrelik tüplere aktarın. PNA çözeltilerini vakumlu konsantratör kullanarak konsantre edin.

Kurutulmuş RNA içeren tüpe 975 µL inkübasyon tamponu ekleyin ve tüm RNA'nın çözündüğünden emin olmak için iyice karıştırın. RNA çözeltisini kısa süreliğine santrifüj ettikten sonra, tüpü 10 dakika boyunca önceden ısıtılmış bir ısıtıcı bloğa yerleştirerek tavlama işlemine tabi tutun. İşlem tamamlandığında, ısıtıcı bloğu kapatın ve örneğin oda sıcaklığına soğumasını bekleyin.

Kurutulmuş PNA içeren tüplerin her birine 75 µL RNA ekleyin ve iyice karıştırın. Numunelerin oda sıcaklığında en az bir saat bekletilmesinin ardından, bunları 4 °C'de gece boyunca inkübe edin. Şimdi, 2-aminopürin işaretli tek zincirli RNA'nın uygun miktarlarını ayrı 1,5 mL'lik tüplere aktarın.

Çeşitli konsantrasyonlar için hedeflenen PNA'nın uygun hacimlerini, ana stoktan tek zincirli RNA içeren ilgili tüplere aktarın. Numuneleri kuruttuktan sonra, her bir tüpe 75 µL inkübasyon tamponu ekleyin ve iyice karıştırın. Her bir tüpü 10 dakika boyunca önceden ısıtılmış bir ısı bloğuna yerleştirerek numunelere tavlama işlemi uygulayın.

Numunelerin oda sıcaklığına soğumasına izin verdikten sonra, bunları dört derece Celsius'ta gece boyunca inkübe edin. Bunun ardından, her numuneden 70 µL'yi bir santimetrekarelik küvete aktarın. Küveti bir floresan spektrofotometreye yerleştirin ve emisyonu 330 ile 550 nanometre dalga boyu aralığında ölçün.

Ölçüm tamamlandığında, tamponu küvetten çıkarın. Küveti distile su ile durulayın ve nitrojen gazı ile kurulayın. Tüm örnekler için ölçümü tekrarladıktan sonra, floresans yoğunluğunu dalga boyuna karşı grafiğe dökün.

Uygun miktardaki tek zincirli RNA'yı ayrı 1,5 mililitrelik tüplere aktarın. Ardından, ana stoktan uygun hacimdeki hedef PNA'yı, tek zincirli RNA içeren ilgili tüplere aktarın. Örnekleri kuruttuktan sonra, her bir tüpe 130 mikrolitre inkübasyon tamponu ekleyin ve iyice karıştırın.

Her bir tüpü önceden ısıtılmış bir ısı bloğuna 10 dakika boyunca yerleştirerek her bir örneğe tavlama uygulayın. Örneklerin oda sıcaklığına soğumasını bekledikten sonra, onları dört santigrat derece sıcaklıkta gece boyunca inkübe edin. Şimdi, her bir örneğin 130 mikrolitresini, bir hücresi inkübasyon tamponu içeren sekiz mikrohücreli bir küvete aktarın.

Bir UV-Vis spektrofotometre kullanarak, her bir örneğin 260 nanometre dalga boyundaki absorbansını ölçün. Ölçümleri, 15'ten 95 santigrat dereceye yükselen ve ardından dakikada 0,5 santigrat derece rampa hızıyla 95'ten 15 santigrat dereceye düşen sıcaklıklarda gerçekleştirin. PNA oligomerleri, iki ters faz HPLC saflaştırmasının ardından elde edilmiştir.

PNA'ların kimliği MALDI/TOF analizi ile doğrulanabilir. Denatüre edilmemiş PAGE verileri, Q ve L modifiyeli PNA'nın yalnızca C-G çiftine sahip çift sarmallı RNA bölgesini tanıyabildiğini göstermektedir. Bu spesifik ve gelişmiş tanıma, T-A-U-L-G-C ve Q-C-G PNA RNA iki bazlı üçlü oluşumu aracılığıyla gerçekleşmektedir.

Bir 2-aminopürin floresan titrasyon çalışması, Q ve L modifiyeli bir PNA'nın hedeflenen çift sarmallı RNA'ya bağlandığını ancak tek sarmallı RNA'ya bağlanmadığını göstermiştir. Q kalıntıları içeren PNA'lar, Watson-Crick benzeri Q-G eşleşmesindeki sterik çakışma nedeniyle tek sarmallı RNA'ya bağlanmanın yokluğuna işaret eden termal erime geçişleri göstermemektedir. Modifiyesiz PNA P1 ile karşılaştırıldığında, L kalıntıları içeren P4 ve P5 PNA'lar, Watson-Crick benzeri L-G eşleşmesindeki sterik çakışma nedeniyle ilgili RNA-PNA dupleksleri için daha düşük bir erime sıcaklığı sergilemektedir.

UV absorbansı ile tespit edilen termal erime verileri, Q ve L kalıntıları içeren bir PNA'nın tek zincirli RNA'ya güçlü bir şekilde bağlanmadığını gösteren 2-aminopürin floresan titrasyon verileriyle tutarlıdır. Bir Q bazının dahil edilmesi, Watson-Crick benzeri bir Q-G çiftinin oluşumunda Q bazının daha belirgin bir sterik çakışmaya yol açması nedeniyle, bir L bazına göre daha fazla destabilize edicidir. Bir kez uzmanlaşıldığında, çeşitli deneyler düzgün şekilde yürütülürse bir hafta içinde tamamlanabilir.

Bu prosedürün ardından, çift zincirli RNA bağlayıcı PNA'lar kullanarak RNA yapılarının tespit edilip edilemeyeceği ve RNA fonksiyonlarının düzenlenip düzenlenemeyeceği gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla, hücrelerdeki RNA yapılarının proplanması ve hedeflenmesi gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, RNA biyolojisi ve hastalıkları alanındaki araştırmacıların RNA yapısını hedefleyen terapötik geliştirmeleri keşfetmelerinin önünü açmıştır.