Name: Çift iplikçikli RNAların tek iplikçikli RNAların tarafından üzerinde fingerprinting ve seçici tanınması, kimyasal olarak peptit nükleik asitler modifiye (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Öğrenin, kimyasal olarak modifiye edilmiş peptit nükleik asitler kullanarak çift iplikçikli RNA moleküler tanıma yöntemlerini. Bu protokoller RNA kimyasal biyolojisi alanında yapı hedefleme çalışmalarına katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu eser Singapur Bakanlığı Eğitim (MOE) Tier 1 (RGT3/13 ve RG42/15-G.C.) ve MOE Tier 2 (MOE2013-T2-2-024 ve MOE2015-T2-1-028'e G.C.) tarafından desteklenmiştir.

Rapor burada çalışmaları temel bir patent başvurusu (PAT/179/14/15/PCT) şikayetçi oldu.

RNA çift yönlü bağlama PNA reaksiyonlar (örneğin, 10-mers) orta ölçekli moleküllerdir ve böylece elektroforetik hareketlilik shift bağlama üzerine ile karşılaştırılabilir veya biraz daha büyük bir boyut için RNA'ların gösterebilir (örneğin, 50-mer veya daha küçük). Bir RNA PNA önemli ölçüde daha büyük ise, PNA titrasyon RNA içine bir sınırlı jel hareketlilik kayma nedeniyle çalışmayabilir. Böylece, büyük RNA sigara denaturing sayfa deneyleri için kesilebilir. Fluorophore etiketli PNA içine büyük bir RNA'ın titrasyon Tripleks oluşumu bir sigara denaturing özel jel tarafından ortasında jel40yüklü örnek ile izlenmesi için izin verir.
Tarafından sigara denaturing sayfası RNA'ın sürekli bir toplam konsantrasyon ile titrasyon deneme için genellikle 1 µM etiketlenmemiş bir RNA konsantrasyonu verimli sonrası ücretsiz RNA ve Tripleks bantları etidyum bromür tarafından boyama için kullanıyoruz. 0.2 µM düşük bir RNA konsantrasyonu da RNA yapı31bağlı yeterli olabilir. Etiketlenmemiş RNA konsantrasyonu (0.2 µM) belirler doğru ölçülebilir Kd değerler hakkında 0.2 µM veya daha büyük olması gerekir. Diğer boyama boya boyama verimliliği artırmak için kullanılabilir. Alternatif olarak, bizim yayınlanmamış veri boya-RNA'ların etiketli Cy3 sigara denaturing sayfa deneylerde sıkı bağlama olayları ölçmek için kullanılabilir öneririz.
2-aminopurine sadece orta floresan nedeniyle gerçeğini, 2-aminopurine floresan titrasyon da bağlama için Kapat veya 0.2 µM31üstüne Kd değerleri ile ölçülmesi için sınırlıdır. RNA veya PNA bağlama floresan sinyallerini53,54, değişimler sonuçlanırsa solution'ı Floresans titrasyon, bir nispeten sıkı bağlama miktarının için nispeten parlak boya ile etiketli 55.
RNA yapıları dsRNA bağlama PNAs tarafından hedefleme stratejisi RNA'ların sınırlı sayıda için test edilmiştir. Bu farklı ard arda geliş ve baz çifti besteleri ile dsRNAs için bağlama özellikleri değişebilir olasıdır. TFPNAs tasarımı için bir çift yönlü pürin zengini iplikçik birini her zaman. Nasıl üst üste Q· anlamak için önemlidir C-G üç katına bir Tripleks kararlılığını etkileyebilir. Daha geniş sıra bağımlı çalışmalar açıkça TFPNAs sıra bağımlı bağlama özelliklerini anlamak için ihtiyaç vardır.
TFPNAs bağlama benzeşme daha da artan uzunluğu ve/veya daha da üsler ve omurgalarına56,57 TFPNAs değiştirme tarafından gelişmiş olabilir. Ancak, sürekli bir çift yönlü bölge kez 10'dan fazla ardışık baz çifti kesinti olmadan sigara-Watson-Crick yapılar tarafından oluşabilir değil. Bir sigara-Watson-Crick yapıları dsRNA bölgeler için bitişik tanınması için küçük moleküller ile TFPNAs eşlenik. Prensip olarak, bir TFPNA-küçük molekül eşlenik bağlama benzeşme ve özgüllük bir TFPNA ya da küçük molekül yalnız göre gelişmiş bekleniyor. Ancak, konjugasyon58,59,60,61,62,63,64 için bağlayıcı kimyasal ve fiziksel özellikleri optimize edilmiş olması gerekir.
TFPNAs seçmeli olarak dsRNAs için ssRNAs ve dsDNAs bağlayabilirsiniz aslında çok yararlı kimyasal sonda ve RNA yapısal dinamikleri ve etkileşimleri ile düzenlenmesi yoluyla potansiyel terapötik ligandlar olarak TFPNAs geliştirmek mümkün olduğunu göstermektedir proteinler ve metabolitleri. Hücresel TFPNAs alımını hücre Penetran moieties küçük moleküller, peptidler ve nano tanecikleri gibi ile fiil veya lipozomlar5,6 gibi supramolecular yapıları ile complexation üzerinden kolaylaştırılmış olacak ,12,17,25,31,41,65,66. Daha fazla TFPNAs functionalization fluorophores ve radioisotopes gibi bioimaging etiketlerle algılama, görüntüleme ve canlı organizmalar işlevsel RNA yapıların hedefleme kolaylaştırabilir.

RNA'ların önemli biyolojik ve yönetmelikte RNA'lar rolleri keşifler ve kataliz farklı biyolojik süreçlerin1,2,3son gelişmeler nedeniyle tedavi hedefleri olarak ortaya çıkıyor. Geleneksel olarak, antianlamlı lifler ile Watson-Crick çift yönlü oluşumu3,4,5,6,7,8, ssRNAs bağlamak için kullanılmaktadır 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27. son zamanlarda, tripleks oluşturmayan peptit nükleik asitler (TFPNAs) dsRNAs (şekil 1)3,28,29Hoogsteen hidrojen üzerinden bağlamak için tasarlanmıştır. dsRNA bölgeler pre-mRNA'ların ve mRNA'ların, ön veya PRI-miRNAs3ve birçok diğer kodlamayan RNA'ların1,26,27de dahil olmak üzere geleneksel Antisens hedefli RNA'lar çoğunda bulunur. DsRNAs TFPNAs kullanarak üçlü sarmal oluşumu ile hedefleme onun yapısı özgüllüğü nedeniyle avantajlı olabilir ve dysregulated hastalıkları, örneğin olan RNA'ların, normal işlevleri geri yükleme kullanmak için büyük potansiyel olduğunu.
Son Yayınlanan İş Rozners vd.ve bize3,28,29,30,31,32,33, 34,35,36,37,38,39,40,41, bildirilen çabaları artırma değiştirilmiş TFPNAs dsRNAs gelişmiş benzeşimli doğru seçmeli bağlama. Biz thio-pseudoisocytosine (L) monomer30 ve guanidin-modified 5-metil sitozin (S) monomer31dahil olmak üzere sentez yöntemleri için mantıklı bir şekilde tasarlanmış PNA monomer (Şekil 2) geliştirdik. Çeşitli Biyokimya ve biyofizik karakterizasyon yöntemleri, nispeten kısa PNAs (6-10 artıkları) L ve Q artıkları birleşmeyle Watson-Crick G-C ve C-G baz çifti, geliştirilmiş tanıma sırasıyla, dsRNAs içinde göstermek göstermiştir. Ayrıca, değiştirilmemiş PNAs için karşılaştırıldığında, L ve Q kalıntılar içeren PNAs daha seçici bağlama dsRNA doğru ssRNA ve dsDNA üzerinde göster. Q Base guanidin işlevselliği42 PNAs HeLa hücreleri31girmenizi sağlar.
Bizim laboratuvar PNAs manuel Boc-kimya tarafından sentez (Boc veya t- Boc duruyor tert-butyloxycarbony için (bkz: Şekil 2) katı fazlı peptid sentez yöntemi4. PNA monomer Boc grup korumak emin olarak ile sentezi Boc grup sterically fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) Amin grubu, PNA monomer kaplin sırasında yararlı olabilir korumak ile karşılaştırıldığında daha az hantal olduğu gibi uygun sağlam destek. Boc grup asit değişken ve kolayca sağlam destek 20-%50 trifluoroacetic asit (TFA) diklorometan (DCM) tarafından Filistin Ulusal Yönetimi sentezi sırasında kaldırılabilir. Bir otomatik peptid synthesizer PNA reaksiyonlar sentezlemek için istihdam edilebilir; Ancak, PNA monomer 3 5 kat fazla bir otomatik peptid synthesizer için gereklidir. El ile sentezi önemli ölçüde daha az PNA monomer (2-3-kat fazlası), kolayca Kaiser test43tarafından izlenen her MANŞONLA gerektirir. Ayrıca, birçok otomatik synthesizer Boc kaldırma adımı sırasında Boc strateji sentez aşındırıcı TFA kullanımı nedeniyle ile uyumlu değildir.
Moleküler ağırlık karakterizasyonu MALDI-TOF tarafından takip ters fazlı yüksek performanslı sıvı Kromatografi (RP-HPLC) tarafından Filistin Ulusal Yönetimi reaksiyonlar saflaştırılmış (şekil 3 ve 4)30, 31. biz Tripleks oluşumu izlemek için ücretsiz RNA dubleks oluşturur ve Filistin Ulusal Yönetimi bağlı triplexes kez nedeniyle aslında bu farklı geçiş oranları (şekil 5)30,31 göstermek sayfa denaturing istihdam . Verimli boyama sonrası, RNA çift yönlü ve PNA· için de elde edilebilir hiçbir etiketleme gereklidir RNA2 Tripleks bantları. Örnek nispeten az miktarda sigara denaturing sayfa deneyler için gereklidir. Ancak, yükleme (kuluçka) arabelleği ve çalışan arabellekleri (pH 8.3), 8.3 nispeten yüksek pH önemli ölçüde bir Tripleks istikrarsızlaştırmak çünkü kinetically istikrarlı triplexes için sınırlı olmak ölçümler sonucunda aynı olmayabilir.
2-Aminopurine olan bir izomer adenin (6-aminopurine); 2-aminopurine floresan yoğunluğu (yaklaşık 370 emisyon zirve ile nm) yerel yapısal çevre değişiklikleri duyarlıdır ve Tripleks oluşumu ile 2-aminopurine kalıntı izleme bağlama Makinası (PNA dahil için uygundur Şekil 6) 31. Floresans emisyon görünür aralığında gösteren birçok diğer boyalar farklı olarak, 2-aminopurine-etiketli RNA Oda ışık fotoğraf beyazlatma olmadan maruz kalabilirler. Sayfa deneme içinde çalışan bir tampon pH 8.3 kez gereklidir, aksine 2-aminopurine göre Floresans titrasyon bağlama ölçümü belirtilen bir pH bir çözüm sağlar ve böylece ölçüm ve nispeten zayıf tespiti izin verebilir ve Kinetically kararsız denge bağlama.
UV Absorbans algılanan termal erime deneyler dubleks (Şekil 7)31 ve tri termal istikrarı ölçümü izinPLEX30,32,44,45. Bağlı olarak uzunluğu ve sıra kompozisyon, triplexes erime veya açık bir geçiş gösterilmeyebilir. Isıtma ve soğutma eğrileri üst üste gelirse termodinamik parametreler temin edilebilir. Doğru termodinamik parametreler izotermal titrasyon Kalorimetre (ITC)32tarafından elde edilebilir; Ancak, nispeten büyük miktarda örnekleri ITC için genellikle gereklidir.

<table><tbody><tr><td>Moleküler elekler, 4A, 1-2 mm çaplı peletler&nbsp;</td><td>Alfa Aesar</td><td>87956</td><td></td></tr><tr><td>4-Metilbenzhidrilamin hidroklorür (MBHA&Yuml; HCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>532444</td><td></td></tr><tr><td>N,N-diizopropilaminlamin (DIPEA)</td><td>Alfa Aesar</td><td>A11801</td><td></td></tr><tr><td>(Benzotriazol-1-il-oksi)tripirolidinosfonyum heksaflorofosfat (PyBOP)</td><td>Alfa Aesar</td><td>B25251</td><td></td></tr><tr><td>Asetik anhidrit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320102</td><td></td></tr><tr><td>Kaiser Test Kiti&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60017</td><td></td></tr><tr><td>Trifloroasetik asit (TFA)</td> <td>Alfa Aesar</td><td>L06374</td><td></td></tr><tr><td>Modifiye edilmemiş PNA monomerleri</td><td>ASM Research Chemicals GmbH</td><td>5004007, 5004008, 5004009, 5004010</td><td></td></tr><tr><td>Boc-Lys(Z)-OH / Fmoc-Lys(Boc)-OH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B8389 / 47624</td><td></td></tr><tr><td>Tiyoanisol</td><td>Alfa Aesar</td><td>A14846</td><td></td></tr><tr><td>1,2-Ethanedithiol</td><td>Alfa Aesar</td><td>L12865</td><td></td></tr><tr><td>Triflorometansülfonik asit</td><td>Alfa Aesar</td><td>A10173</td><td></td></tr><tr><td>LiChrosper&reg; 100 RP-18 uç kapaklı (5 & mikro; m) LiChroCART&reg; 250-4</td><td>Merck Millipore</td><td>150838</td><td></td></tr><tr><td>RNA Oligos&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Özelleştirilmiş&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-siyano-4-hidroksisinnamik asit (CHCA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>39468</td><td></td></tr><tr><td>Etilendiamintetraasetik asit (EDTA)</td> <td>Alfa Aesar</td><td>J15694</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>17-737E</td><td></td></tr><tr><td>Akrilamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8887</td><td></td></tr><tr><td>N'-metilenbisakrilamid</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td></td><td></td>146072</tr><tr><td>Amonyum persülfat (APS)</td> <td>Bio-rad</td><td>161-0700</td><td></td></tr><tr><td>Tetrametiletilendiamin (TEMED)</td> <td>Bio-rad</td><td>161-0800</td><td></td></tr><tr><td>10X Tris-Borat-EDTA (TBE) Tamponu, pH 8.3</td><td>1. Baz</td><td>BUF-3010-10X1L</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol&nbsp;</td><td>Promega&nbsp;</td><td>H5433</td><td></td></tr><tr><td>Etidyum bromür (10 mg/mL)</td><td>Bio-rad&nbsp;</td><td>161-0433</td><td></td></tr><tr><td>Yüksek Hassasiyetli Hücre (Kuvars Suprasil, 200-2500 nm)</td><td>Hellma Analytics&nbsp;</td><td>105.250-QS</td><td></td></tr></tbody></table>

Çift iplikçikli rna'ların tek iplikçikli rna'ların tarafından üzerinde fingerprinting ve seçici tanınması, kimyasal olarak peptit nükleik asitler modifiye

Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

RNA'ların önemli biyolojik ve tedavi hedefleri ortaya çıkıyor. Böylece, büyük bir potansiyel kimyasal sonda ve RNA sıralama ve yapı tanınması için tedavi ligandlar geliştirmede olmasıdır. Peptit nükleik asit (reaksiyonlar son zamanlarda geliştirilen RNA dubleks bir fingerprinting şekilde anlayacağı şekilde PNA) kimyasal olarak değiştirilmiş. PNAs kimyasal olarak tarafsız bir peptid gibi omurga ile stabildir. PNAs nispeten kolayca el ile Boc-kimya katı fazlı peptid sentez yöntemi tarafından sentez. PNAs ters fazlı HPLC, matris yardımlı lazer desorpsiyon/iyonlaşma-tarafından uçuş süresi (MALDI-TOF) molekül ağırlığı karakterizasyonu tarafından takip tarafından saf. Sigara denaturing polyacrylamide Jel Elektroforez (sayfa) tekniği Tripleks oluşumu görüntüleme Haritayı farklı geçiş oranları çünkü dikkatle tasarlanmış ücretsiz RNA çift yönlü oluşturur ve Filistin Ulusal Yönetimi triplexes kez bağlı kolaylaştırır. Etidyum bromür yazı boyama ile sigara denaturing sayfa kez bağlama benzeşim ve Filistin Ulusal Yönetimi reaksiyonlar özelliklerine karakterize bir kolay ve bilgilendirici tekniktir. Genellikle, birden çok RNA saç tokaları veya dubleks tek baz çifti mutasyonlar ile PNA bağlama özellikleri, benzeşim ve özelliklerine bağlama gibi karakterize etmek için kullanılabilir. 2-Aminopurine olan bir izomer adenin (6-aminopurine); 2-aminopurine floresan yoğunluğu yerel yapısal çevre değişiklikleri duyarlıdır ve Tripleks oluşumu ile yakın PNA bağlama bölgesi dahil 2-aminopurine kalıntı izleme için uygundur. 2-Aminopurine floresan titrasyon hedeflenen çift iplikçikli RNA'ların (dsRNAs) doğru değiştirilmiş PNAs bağlama selectivity üzerinde tek iplikçikli RNA'ların (ssRNAs) onaylamak için de kullanılabilir. PNA-RNA Dubleks ve PNA· termal istikrarı ölçümü UV Absorbans algılanan termal erime deneyler izin RNA2 triplexes. Burada, biz bir sentez tanımlamak ve birleşmeyle PNA reaksiyonlar arıtma artıkları değiştiren ve RNA dubleks değiştirilmiş PNAs tarafından tanınması karakterizasyonu için Biyokimya ve biyofizik yöntemleri açıklanmaktadır.

Ters fazlı HPLC PNA reaksiyonlar arıtma sağlar. Biz saf PNA reaksiyonlar HPLC arıtma (şekil 3) iki tur ile elde edebilirsiniz. PNAs kimliğini MALDI-TOF analiz (şekil 4) tarafından onaylanabilir.
Sigara denaturing sayfa bağlama benzeşim ve Filistin Ulusal Yönetimi reaksiyonlar özelliklerine karakterize için kolay ve bilgilendirici bir tekniktir. Biz genellikle birden fazla RNA saç tokaları veya dubleks tek baz çifti mutasyonlar ile bağlama özellikleri (şekil 5) tanımlamak için kullanın. Şekil 5 ' te gösterilen sigara denaturing sayfa veri açıkça Q - ve L-modified PNA dsRNA bölge C-G çift (şekil 5B, alt paneli) ile tanıyabilir (topşekil 5B, C-G çift olmadan tek değil ama tavsiye ederim paneli). Bu özel ve gelişmiş tanıma T· olduğunu A-U, L· G-C ve Q· C-G PNA· RNA2 temel üçlü (şekil 1A, C, D) oluşumu. Tek veya birden fazla mutasyon ile çeşitli PNAs değiştirilmiş bir Filistin Gelişmiş bağlama özelliklerini göstermek için de kullanılabilir. Biz 2 mM Mg2 + kuluçka arabellekte ekleme bağlama etkilemez göstermiştir önemli ölçüde31.
Hedeflenen dsRNA bölgesi (şekil 6A, 6 C, 6 D) ama değil ssRNA (şekil 6B, 6E, 6F) Q ve L modifiye PNA bağlar 2-aminopurine floresan titrasyon tarafından göstermiştir. PNA P3 0,8 ± 0,1 µM Kd değeri 2 aminopurine etiketli dsRNA bağlar. 370 Floresans yoğunlukta nm 2 aminopurine etiketli ssRNA için PNA P3 bağlama ssRNA için eksikliği gösteren çeşitli P3 konsantrasyon ile nispeten sabit kalır.
PNAs Q artıkları (P2 ve P3) gösteri yok termal geçişler (Şekil 7), ssRNA için hiçbir bağlama düşündüren erime içeren. Bu Q-G çift gibi Watson-Crick mevcut steric çatışma kaynaklanmaktadır. Değiştirilmemiş PNA P1 için karşılaştırıldığında, PNAs P4 ve P5 içeren L artıkları ama hiçbir Q artıkları modifiye, gösteri için karşılık gelen RNA-PNA dubleks L-G çift gibi Watson-Crick mevcut steric çatışma nedeniyle erime sıcaklıkları azalmıştır. UV Absorbans algılanan termal erime veri de Q ve L kalıntılar içeren bir PNA ssRNA için kayda değer bağlanmaz göstermek 2-aminopurine floresan titrasyon veri ile tutarlı (şekil 6B, 6E, 6F). Watson-Crick-gibi L-G çift (şekil 1E göre bir Watson-Crick-gibi Q-G çift (şekil 1F) oluşumunda daha önemli bir steric çatışma bir Q Bankası olduğu gibi bir Q Bankası birleştiren bir L Bankası daha fazla destabilizing ).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig1v2.jpg"> 
Resim 1 : Kimyasal yapıları istikrarlı temel üçlü ve kararsız baz çifti yapıların. (A-D) Binbaşı-oluk PNA· RNA2 temel üç katına, T· A-U (A), C+· G-C (B), L· G-C (C) ve Q· C-G (D). (E, F) Kararsız Watson-Crick PNA-RNA baz çifti L-G (E) ve Q-G (F) gibi. R harfi RNA şeker-fosfat omurgası temsil eder. Hidrojen bağları siyah Kesikli çizgilerle gösterilir. Rakam tekrar başvuru31oluşturulur. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig2v2.jpg"> 
Resim 2 : PNA monomerleri kimyasal yapılarının. Dört PNA monomer (T, C, L ve Q) gösterilir. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig3.jpg"> 
Şekil 3 : Kimyasal yapısı PNA oligomer ve RP-HPLC tarafından arıtma. (A)P3 PNA sırasının kimyasal yapısı. (B, C) RP-HPLC veri ham PNA P3, (B) ve yeniden saf PNA P3 (C). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig4.jpg"> 
Şekil 4 : Arıtılmış PNA P3 MALDI-TOF spektrum. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig5.jpg"> 
Şekil 5 : RNA saç tokası ve Filistin Ulusal Yönetimi dizileri ve bağlama karakterizasyonu tarafından sayfası olmayan denaturing. (A) RNA tokalar (rHP1 ve rHP2), PNA P3 ve bir PNA· RNA2 Tripleks PNA P3 ve rHP2 arasında kurdu. (B) sayfa (% 12) sigara denaturing rHP1 ve Filistin Ulusal Yönetimi P3 rHP2 bağlama için sonuçlar. Kuluçka arabellek 200 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 20 mM HEPES, pH 7.5 olur. Yüklenen RNA tokalar (rHP1 ve rHP2) 20 µL 1 µM altındadır. PNA konsantrasyonları Lanes soldan sağa vardır 0, 0,2, 0,4, 1, 1.6, 2, 4, 10, 16, 20, 28, ve 50 µM. PNA P3 değil bağlamak için rHP1 (üst panel) ama rHP2 için bağlar (alt paneli). (C) Kd belirlenmesi P3 bağlama için rHP2 için. Tripleks oluşumu (Y) kısmını PNA konsantrasyon karşı çizildi. Başvuru31adapte bir rakamdır. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig6.jpg"> 
Şekil 6 : Floresan titrasyon çalışma PNA P3 bağlamaRNA'ların 2 aminopurine etiketli için. 2-aminopurine kalıntı RNA dizisi '2' olarak belirlenmiştir. Kuluçka arabellek 200 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 20 mM HEPES, pH 7.5 olur. (A) bir PNA· RNA2 Tripleks P3 ve 2 aminopurine etiketli dsRNA (dsRNA2-2AP) arasında kurdu. (B) A varsayımsal PNA-RNA dubleks P3 ve 2 aminopurine etiketli ssRNA (ssRNA2-2AP) arasında kurdu. (C, E) Floresans emisyon spectra RNA çift yönlü (1 µM) 2 aminopurine etiketli ve ssRNA (1 µM), sırasıyla, P3 konsantrasyon pH 7.5 ile çeşitli. Yaklaşık 475 zirvesinde nm olduğunu L Bankası PNA'zayıf Floresans emisyon nedeniyle. (D, F) K d belirlenmesi dayanarak 2-aminopurine floresan yoğunluğu araziler üzerinde (, 370 nm) RNA Dubleks ve ssRNA, sırasıyla, PNA P3 konsantrasyon karşı. Başvuru31adapte bir rakamdır. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig7.jpg"> 
Şekil 7 : RNA-PNA dubleks için sonuçlar erime termal. Kuluçka arabellek 200 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 20 mM NaH2PO4, pH 7.5 olur. Tüm örneklerini tek iplikçikli RNA (ssRNA1) ve Filistin Ulusal Yönetimi 130 µL.(a)tek iplikçikli RNA (ssRNA1) içinde PNAs (P1, P2, P3, P4 ve P5) ve Filistin Ulusal Yönetimi P3 ve ssRNA1 paralel yönde arasında oluşturulmuş bir varsayımsal PNA-RNA dubleks 5 mikron içerir. Steric çatışma Watson-Crick Q-G ve M-G çift gibi için endikedir. (B) erime Eğriler için farklı PNAs ssRNA1 için bağlama. Erime sıcaklıkları geçişler erime ile Eğriler için gösterilir. Başvuru31adapte bir rakamdır.

Biz iletişim kuralları için bir sentez raporu ve peptit nükleik asit (PNA) reaksiyonlar birleşmeyle arıtma artıkları değiştirilebilir. RNA dubleks değiştirilmiş PNAs tarafından tanınması karakterizasyonu için Biyokimya ve biyofizik yöntemleri açıklanmıştır.

Çift iplikçikli RNA'ların tek iplikçikli RNA'ların tarafından üzerinde fingerprinting ve seçici tanınması, kimyasal olarak peptit nükleik asitler modifiye

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

Bu yöntem makalesinin genel amacı, laboratuvarımız tarafından kimyasal olarak modifiye edilmiş peptid nükleik asitlerin çift sarmallı RNA'ları moleküler düzeyde tanımasını incelemek için kullanılan ayrıntılı protokolleri tanıtmaktır. Bu yöntem, RNA kimyasal biyolojisi alanında RNA yapılarının tespiti ve hedeflenmesi gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, tasarım ilkelerinin herhangi bir RNA dupleks yapısının hedeflenmesinde uygulanabilir olmasıdır.Prosedürü, laboratuvarımdan araştırma görevlisi Desiree Toh uygulamalı olarak gösterecektir. Bu prosedüre başlamak için, önceden hazırlanmış RNA PNA örneklerine dört µL %35'lik gliserol çözeltisi ekleyin ve nazikçe karıştırın. Bir mikropipet ve jel yükleme uçları kullanarak, hava kabarcığı oluşmamasına dikkat ederek her bir örnekten 20 µL'yi önceden hazırlanmış poliakrilamid jele dikkatlice yükleyin.Jeli 250 volt sabit voltajda beş saat boyunca çalıştırın. Beş saat sonra güç kaynağını kapatın ve cam plakayı jel standından çıkarın. Ardından jel sızdırmazlık bandını çıkarın ve cam plakayı sökün.Jeli cam plakadan nazikçe çıkarın ve 350 mililitre deiyonize su ile doldurulmuş bir kaba yerleştirin. Kaba dikkatlice 35 mikrolitre etidyum bromür ekleyin ve düşük hızda 30 dakika boyunca platform çalkalayıcıya yerleştirin. Etidyum bromür çözeltisini bertaraf ettikten sonra, jeli 1,5 ila iki litre distile su ile durulayın.Ardından jeli, 532 nanometrelik yeşil lazerli bir görüntüleme cihazı ve 610 nanometreye ayarlanmış emisyon filtresi kullanarak tarayın. Jel bant yoğunluklarını ücretsiz bir yazılım kullanarak nicelleştirin. Uygun miktardaki 2-aminopurin işaretli çift zincirli RNA'yı temiz bir 1.5 mililitrelik tüpe aktarın.Ardından, RNA çözeltilerini bir vakumlu konsantratör kullanarak konsantre edin. Sonrasında, önceden hazırlanmış ana stoktan farklı konsantrasyonlar için uygun hacimlerdeki hedef PNA'yı ayrı 1,5 mililitrelik tüplere aktarın. PNA çözeltilerini vakumlu konsantratör kullanarak konsantre edin.Kurutulmuş RNA içeren tüpe 975 µL inkübasyon tamponu ekleyin ve tüm RNA'nın çözündüğünden emin olmak için iyice karıştırın. RNA çözeltisini kısa süreliğine santrifüj ettikten sonra, tüpü 10 dakika boyunca önceden ısıtılmış bir ısıtıcı bloğa yerleştirerek tavlama işlemine tabi tutun. İşlem tamamlandığında, ısıtıcı bloğu kapatın ve örneğin oda sıcaklığına soğumasını bekleyin.Kurutulmuş PNA içeren tüplerin her birine 75 µL RNA ekleyin ve iyice karıştırın. Numunelerin oda sıcaklığında en az bir saat bekletilmesinin ardından, bunları 4 °C'de gece boyunca inkübe edin. Şimdi, 2-aminopürin işaretli tek zincirli RNA'nın uygun miktarlarını ayrı 1,5 mL'lik tüplere aktarın.Çeşitli konsantrasyonlar için hedeflenen PNA'nın uygun hacimlerini, ana stoktan tek zincirli RNA içeren ilgili tüplere aktarın. Numuneleri kuruttuktan sonra, her bir tüpe 75 µL inkübasyon tamponu ekleyin ve iyice karıştırın. Her bir tüpü 10 dakika boyunca önceden ısıtılmış bir ısı bloğuna yerleştirerek numunelere tavlama işlemi uygulayın.Numunelerin oda sıcaklığına soğumasına izin verdikten sonra, bunları dört derece Celsius'ta gece boyunca inkübe edin. Bunun ardından, her numuneden 70 µL'yi bir santimetrekarelik küvete aktarın. Küveti bir floresan spektrofotometreye yerleştirin ve emisyonu 330 ile 550 nanometre dalga boyu aralığında ölçün.Ölçüm tamamlandığında, tamponu küvetten çıkarın. Küveti distile su ile durulayın ve nitrojen gazı ile kurulayın. Tüm örnekler için ölçümü tekrarladıktan sonra, floresans yoğunluğunu dalga boyuna karşı grafiğe dökün.Uygun miktardaki tek zincirli RNA'yı ayrı 1,5 mililitrelik tüplere aktarın. Ardından, ana stoktan uygun hacimdeki hedef PNA'yı, tek zincirli RNA içeren ilgili tüplere aktarın. Örnekleri kuruttuktan sonra, her bir tüpe 130 mikrolitre inkübasyon tamponu ekleyin ve iyice karıştırın.Her bir tüpü önceden ısıtılmış bir ısı bloğuna 10 dakika boyunca yerleştirerek her bir örneğe tavlama uygulayın. Örneklerin oda sıcaklığına soğumasını bekledikten sonra, onları dört santigrat derece sıcaklıkta gece boyunca inkübe edin. Şimdi, her bir örneğin 130 mikrolitresini, bir hücresi inkübasyon tamponu içeren sekiz mikrohücreli bir küvete aktarın.Bir UV-Vis spektrofotometre kullanarak, her bir örneğin 260 nanometre dalga boyundaki absorbansını ölçün. Ölçümleri, 15'ten 95 santigrat dereceye yükselen ve ardından dakikada 0,5 santigrat derece rampa hızıyla 95'ten 15 santigrat dereceye düşen sıcaklıklarda gerçekleştirin. PNA oligomerleri, iki ters faz HPLC saflaştırmasının ardından elde edilmiştir.PNA'ların kimliği MALDI/TOF analizi ile doğrulanabilir. Denatüre edilmemiş PAGE verileri, Q ve L modifiyeli PNA'nın yalnızca C-G çiftine sahip çift sarmallı RNA bölgesini tanıyabildiğini göstermektedir. Bu spesifik ve gelişmiş tanıma, T-A-U-L-G-C ve Q-C-G PNA RNA iki bazlı üçlü oluşumu aracılığıyla gerçekleşmektedir.Bir 2-aminopürin floresan titrasyon çalışması, Q ve L modifiyeli bir PNA'nın hedeflenen çift sarmallı RNA'ya bağlandığını ancak tek sarmallı RNA'ya bağlanmadığını göstermiştir. Q kalıntıları içeren PNA'lar, Watson-Crick benzeri Q-G eşleşmesindeki sterik çakışma nedeniyle tek sarmallı RNA'ya bağlanmanın yokluğuna işaret eden termal erime geçişleri göstermemektedir. Modifiyesiz PNA P1 ile karşılaştırıldığında, L kalıntıları içeren P4 ve P5 PNA'lar, Watson-Crick benzeri L-G eşleşmesindeki sterik çakışma nedeniyle ilgili RNA-PNA dupleksleri için daha düşük bir erime sıcaklığı sergilemektedir.UV absorbansı ile tespit edilen termal erime verileri, Q ve L kalıntıları içeren bir PNA'nın tek zincirli RNA'ya güçlü bir şekilde bağlanmadığını gösteren 2-aminopürin floresan titrasyon verileriyle tutarlıdır. Bir Q bazının dahil edilmesi, Watson-Crick benzeri bir Q-G çiftinin oluşumunda Q bazının daha belirgin bir sterik çakışmaya yol açması nedeniyle, bir L bazına göre daha fazla destabilize edicidir. Bir kez uzmanlaşıldığında, çeşitli deneyler düzgün şekilde yürütülürse bir hafta içinde tamamlanabilir.Bu prosedürün ardından, çift zincirli RNA bağlayıcı PNA'lar kullanarak RNA yapılarının tespit edilip edilemeyeceği ve RNA fonksiyonlarının düzenlenip düzenlenemeyeceği gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla, hücrelerdeki RNA yapılarının proplanması ve hedeflenmesi gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, RNA biyolojisi ve hastalıkları alanındaki araştırmacıların RNA yapısını hedefleyen terapötik geliştirmeleri keşfetmelerinin önünü açmıştır.

sequence-specific-selective-recognition-double-stranded-rnas-over

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Astar uzantısı (SHAPE) tarafından analiz yüksek verimli seçici 2 'hidroksil asilleme tek nükleotid çözünürlükte binlerce nükleotid birkaç yüz ile RNA'lar yapılarını belirlemek için bir teknoloji sondalama yeni kimyasal, ters transkripsiyon, kapiler elektroforez ve ikincil yapı tahmini yazılımı kullanır.

Yüksek verim SHAPE kullanarak RNA İkincil Yapısı Tahmin

RNA-protein etkileşimleri birçok hücresel sürecin merkezinde yer alır. Burada, spesifik RNA'yı izole etmek ve onunla ilişkili yeni proteinleri tanımlamak için in vivo bir yöntemi açıklıyoruz. Bu, RNA'ların hücrede nasıl düzenlendiğine yeni bir ışık tutabilir.

Rapid Metodoloji tarafından Roman RNA Bağlayıcı Proteinler İzolasyon

Biz RNA bağlanıcı proteinler tanımlamak ve kendi RNA bağlayıcı bölgeleri UV-aracılı photocrosslinking ve kütle spektrometresi kullanılarak canlı hücrelerdeki eşlemek için bir protokol tanımlamak.

Kütle spektrometresi tabanlı kimlik RNA-bağlama bölgelerinin için numune hazırlama

Bu RNA açılan yöntem uzun kodlamayan RNA (lncRNA) RNA hedeflerini belirleme sağlar. Ev yapımı, tasarlanmış Anti-anlamda DNA Oligonükleotid probları bu lncRNA uygun bir şekilde sabit doku veya hücre için belirli hibridizasyon dayanarak, verimli bir şekilde lncRNA ait tüm RNA hedefleri yakalama sağlar.

Uzun kodlamayan RNA, RNA hedefleri tanımlamak için RNA Pull-down yordamı

RNA virüsü çoğaltma sırasında üretilen çift iplikçikli RNA desen tanıma reseptörleri tarafından doğuştan gelen bağışıklık yanıtının ikna etmek için kabul edilebilir. Negatif anlamda RNA virüsleri için alt düzey dsRNA ve PRRs arasındaki etkileşimi belirsizdir. Arenavirus dsRNA ve tek tek hücreleri içinde PRR görselleştirmek için confocal mikroskopi yöntemi geliştirdik.

Çift iplikçikli RNA ve desen tanıma reseptörleri negatif anlamda RNA virüsü enfeksiyonu confocal görüntüleme

Dizi özgüllüğü gen regülasyonu için çok önemlidir. Belirli dizileri tanıyan düzenleyici proteinler gen regülasyonu için önemlidir. Bu tür proteinler için fonksiyonel bağlama alanlarının tanımlanması zorlu bir biyolojik sorundur. RNA bağlayıcı protein için bağlayıcı bir alanın tanımlanması için yinelemeli bir yaklaşım burada açıklanmıştır ve tüm RNA bağlayıcı proteinler için geçerlidir.

Düzenleyici RNA Bağlayıcı Proteinler için Bağlayıcı Siteleri Belirlemek için Sıra Alanını Keşfetmek

MALDI-TOF, oksitlenmiş RNA ve eksoribonükleaz Xrn-1 arasındaki reaktiviteden elde edilen fragmanları karakterize etmek için kullanıldı. Mevcut protokol, RNA ve / veya DNA içeren diğer işlemlere uygulanabilecek bir metodolojiyi açıklamaktadır.

MALDI-TOF Kütle Spektrometrisi Kullanılarak Enzimatik Bozunmadan Kaynaklanan RNA Fragmanlarının Tanımlanması

Oligonükleotid 5′-trifosfatlar, esansiyel biyolojik yollarda her yerde bulunan bileşenlerdir ve biyoteknoloji uygulamalarında artan kullanım görmüştür. Burada, standart otomatik sentez teknikleriyle hazırlanan oligonükleotidlerden başlayarak oligonükleotid 5′-trifosfatların rutin sentezi ve saflaştırılması için teknikleri açıklıyoruz.

Oligonükleotidlerin Kimyasal Trifosforilasyonu

Mevcut protokol, hedefleri tespit etmek için hızlı, 3 aşamalı, aptamer tabanlı üstel amplifikasyon testinin kullanımını göstermektedir. Numune hazırlama, sinyal amplifikasyonu ve renk gelişimi, kafein üzerinde teofilin varlığını tanımak için bu sistemi uygulamak için ele alınmıştır.

Aptamer tabanlı hedef tespiti, 3 aşamalı G-dörtlü izotermal üstel amplifikasyon reaksiyonu ile kolaylaştırılmıştır

DNAzyme tabanlı nanomakineler, nükleik asitlerin son derece seçici ve hassas tespiti için kullanılabilir. Bu makale, özgür yazılım kullanılarak 10-23 çekirdekli DNAzyme tabanlı nanomakinelerin tasarımı için ayrıntılı bir protokolü ve örnek olarak bir Epstein-Barr virüs parçasının tespitinde uygulanmasını açıklamaktadır.

DNAzyme 10-23 - Nükleik Asit Tanıma için Tabanlı Nanomakineler

Öğrenin, kimyasal olarak modifiye edilmiş peptit nükleik asitler kullanarak çift iplikçikli RNA moleküler tanıma yöntemlerini. Bu protokoller RNA kimyasal biyolojisi alanında yapı hedefleme çalışmalarına katkı sağlar.

Çift iplikçikli RNAların tek iplikçikli RNAların tarafından üzerinde fingerprinting ve seçici tanınması, kimyasal olarak peptit nükleik asitler modifiye (Video) | JoVE Journal

Çift iplikçikli RNA'ların tek iplikçikli RNA'ların tarafından üzerinde fingerprinting ve seçici tanınması, kimyasal olarak peptit nükleik asitler modifiye

Daha fazla video keşfet