Plazma tıp - sıvı hücreleri bir üretilen iş yaklaşımı temel araştırma

Bu çok kuyulu dizi tahlillerinin genel amacı, soğuk fiziksel plazmanın oksidanlar üzerindeki etkilerini, in vitro biyolojik tepkilere, optik emisyon spektroskopisi, sıvı analizi ve hücresel aktivite, mikroskopi ve akış sitometrisi tahlillerini kullanarak daha iyi anlamaktır. Bu yöntem, plazma tıbbı alanında, özellikle immünojenik kanser hücresi ölümünün indüksiyonu için önemli olan plazma türevi direktif türleri ile ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, yarı otomatik yaklaşımıdır.

Araştırmanın hızını ve verimliliğini artırmak için 96 kuyu plakası kullanır. Bu tekniğin etkileri, dermatoloji veya onkoloji gibi gelecekteki plazma tedavilerine kadar uzanır. Ve biyolojik tepkilerle ilgili olan plazmadan türetilmiş direktif türlerini tanımlamak için araçlar sağladıkları için.

Prosedürü göstermek, laboratuvarımızdan bir teknisyen olan Felix Niessner olacaktır. Plazma türlerinin izlenmesi için, bir optik emisyon spektrofotometresinin önüne, tüy eksenine dik olarak bir atmosferik plazma jeti yerleştirin ve her bir gaz durumunun fotoemisyonunu ve dalga boyunu dakikada iki standart litre besleme gazı akışında kaydetmek için özel yazılımı kullanın. Plazma ile muamele edilmiş süper oksit analizi için, uygun ilgili tedavi süreleri ve kuyu pozisyonları ile XYZ tablosu için nihai bir protokol oluşturun.

Daha sonra, 100 mikrolitre taze hazırlanmış ana karışımı, üç kopya halinde şeffaf, düz tabanlı 96 oyuklu bir plakanın kuyucuklarına ekleyin ve 550 nanometrede absorbansı ölçmek için bir mikro plaka okuyucu kullanın. Plazma işleminin hücre metabolik tepkileri üzerindeki etkilerini analiz etmek için, laminer bir akış başlığında, düz tabanlı 96 oyuklu bir plakada, oyuk başına 100 mikrolitre tam takviye edilmiş hücre kültürü ortamında ilgilenilen dört hücreye bir kez 10 kez tohumlayın ve gece boyunca inkübe edin. Bir hücre kültürü inkübatöründe gece boyunca kültürden sonra, deneysel analize göre kuyucukları yalnızca plazma veya gazla tedavi etmek için XYZ tablosunu kullanın ve hücreleri 20 saat daha inkübatöre geri döndürün.

İkinci inkübasyonun sonunda, hücrelere 500 mikromolar Resazurin ile takviye edilmiş 25 mikrolitre taze hücre kültürü ortamı ve ayrıca sadece üç arka plan kontrol Resazurin kuyucuğuna ekleyin. Üç saatlik bir inkübasyon için hücreleri inkübatöre geri koyun. Ardından, bir mikro plaka okuyucuda floresanı ölçün.

Plazma ile muamele edilen hücrelerin görüntülenmesi için, floresanı okuduktan sonra, süpernatantları, mililitre propidyum iyodür başına bir mikrogram ile desteklenmiş 100 mikrolitre taze hücre kültürü ortamı ile değiştirin. Plakayı motorlu bir mikroskop sahnesine yerleştirin ve hücreleri görüntülemek için 20x objektifi seçin. Ardından, her bir kuyucukta görüntülenen tüm görüş alanlarının dijital faz kontrast görüntülerindeki toplam sitozolik alanı belirlemek için uygun kantitatif görüntü analiz yazılımını kullanın.

Plazma ile muamele edilen hücrelerin akış sitometrik analizi için, görüntülemeden sonra, hücreleri her bir kuyucukta iki kez 200 mikrolitre PBS ile yıkayın, yıkama başına kalsiyum ve magnezyum ile yıkayın, ardından mililitre başına 15 anagram anti-fare kalretikülin monoklonal antikoru, 50 mikrolitre PBS'de artı kuyucuk başına kalsiyum ve magnezyum. Hücre kültürü inkübatöründe 15 dakika sonra, hücreleri 200 mikrolitre tam hücre kültürü ortamı ile iki kez yıkayın ve 37 santigrat derecede 20 dakika boyunca her bir oyuğa 100 mikrolitre hücre ayırma çözeltisi ekleyin. Hücreler ayrıldığında, plakayı akış sitometresine yükleyin ve genellikle canlı hücrelerle ilişkili olan ileri ve yan saçılma popülasyonunda en az 1.000 olay elde edin.

Ardından, ilgilenilen popülasyonu belirlemek ve kalretikülin ekspresyonunun ortalama floresan yoğunluğunu belirlemek için uygun akış sitometrisi analiz yazılımını kullanın. Optik emisyon spektroskopisi, farklı besleme gazı koşullarında reaktif plazma bileşenlerine bağlı farklı tepe noktalarını takip etmek için kullanılabilir. Sıvıların plazma muamelesi için, önce argon gazı ve argon plazmasının neden olduğu buharlaşma belirlenir ve plazma aynı zamanda sıcaklık üzerinde de etki gösterdiğinden, koşullar farklı buharlaşma sonuçları verir.

Hidroksil radikalleri için optik emisyon spektroskopisi sonuçlarına benzer şekilde, hidrojen peroksit birikimi oksijen veya nitrojen katkısı ile önemli ölçüde azalır, ancak nemlendirilmiş besleme gazı ile artar. Ayrıca, besleme gazına nitrojen ilavesi, argon plazma ile muamele edilmiş sıvılara kıyasla önemli ölçüde daha yüksek nitrat konsantrasyonlarına yol açar. Çoğu süper oksit, kuru argon gazı koşulları altında, nemlendirilmiş argon oksijen plazmasının varlığı dışında, oksijen ve/veya nitrojen katkıları ile süper oksit oluşumunu önemli ölçüde söndürür.

Resazurin ve plazma ile muamele edilen hücrelerin floresan yoğunlukları, hücre kültürlerinin süpernatantlarında görsel olarak gözlenen fiziksel değişikliklere benzer ve uzun süreli plazma tedavisinin sitotoksik etkilerini doğrular. Plazma işlemine daha kısa süre maruz kalmaya yanıt olarak, miren melanom hücreleri üzerinde kalretikülin lekelenmesinin genel olarak yukarı regülasyonu ile, özellikle nemlendirilmiş besleme gazı koşulları altında, plazma muamelesi numune kuyucuklarında toplam hücre alanında bir azalma da gözlenir. Düzgün bir şekilde yapılırsa, mitoplex hücresel tahliller ve okuma sadece birkaç saat içinde tamamlanabilir.

Bu prosedürü takiben, bağışıklık hücreleri ile ko-kültür veya hücre kültürü süpernatantlarının analizi gibi başka yöntemler de gerçekleştirilebilir. Bu, barajların, sito istemcilerinin veya redux proteinlerinin salınmasının yanı sıra plazma ile tedavi edilen melanom hücrelerinin bağışıklık tarafından tanınması hakkında ek soruların yanıtlanmasına yardımcı olur. Geliştirildikten sonra, bu teknik, örneğin 3D tümör sferoidleri ile melanom döngüleri hakkında daha fazla araştırmanın yolunu açtı.

Bu videoyu izledikten sonra, plazma gazı fazından reaktif moleküller ve sıvılar üzerinden, melanom hücrelerindeki biyolojik tepkilere kadar plazma tıbbında temel araştırmaların nasıl yapılacağını iyi anlamış olmalısınız.