Plazma tıp - sıvı hücreleri bir üretilen iş yaklaşımı temel araştırma
17 Kasım 2017
Bir yüksek-den geçerek soğuk fiziksel plazma tedavi protokolü sıvılar ve hücre gösterilir. Farklı besleme gaz besteleri için plazma ateşleme, plazma 's emisyon spectra ve sıvılar ve hücresel hareketlilik daha sonraki analiz plazma tedaviden sonra ölçme kurma içerir.
Bu çok kuyulu dizi tahlillerinin genel amacı, soğuk fiziksel plazmanın oksidanlar üzerindeki etkilerini, in vitro biyolojik tepkilere, optik emisyon spektroskopisi, sıvı analizi ve hücresel aktivite, mikroskopi ve akış sitometrisi tahlillerini kullanarak daha iyi anlamaktır. Bu yöntem, plazma tıbbı alanında, özellikle immünojenik kanser hücresi ölümünün indüksiyonu için önemli olan plazma türevi direktif türleri ile ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, yarı otomatik yaklaşımıdır.
Araştırmanın hızını ve verimliliğini artırmak için 96 kuyu plakası kullanır. Bu tekniğin etkileri, dermatoloji veya onkoloji gibi gelecekteki plazma tedavilerine kadar uzanır. Ve biyolojik tepkilerle ilgili olan plazmadan türetilmiş direktif türlerini tanımlamak için araçlar sağladıkları için.
Prosedürü göstermek, laboratuvarımızdan bir teknisyen olan Felix Niessner olacaktır. Plazma türlerinin izlenmesi için, bir optik emisyon spektrofotometresinin önüne, tüy eksenine dik olarak bir atmosferik plazma jeti yerleştirin ve her bir gaz durumunun fotoemisyonunu ve dalga boyunu dakikada iki standart litre besleme gazı akışında kaydetmek için özel yazılımı kullanın. Plazma ile muamele edilmiş süper oksit analizi için, uygun ilgili tedavi süreleri ve kuyu pozisyonları ile XYZ tablosu için nihai bir protokol oluşturun.
Daha sonra, 100 mikrolitre taze hazırlanmış ana karışımı, üç kopya halinde şeffaf, düz tabanlı 96 oyuklu bir plakanın kuyucuklarına ekleyin ve 550 nanometrede absorbansı ölçmek için bir mikro plaka okuyucu kullanın. Plazma işleminin hücre metabolik tepkileri üzerindeki etkilerini analiz etmek için, laminer bir akış başlığında, düz tabanlı 96 oyuklu bir plakada, oyuk başına 100 mikrolitre tam takviye edilmiş hücre kültürü ortamında ilgilenilen dört hücreye bir kez 10 kez tohumlayın ve gece boyunca inkübe edin. Bir hücre kültürü inkübatöründe gece boyunca kültürden sonra, deneysel analize göre kuyucukları yalnızca plazma veya gazla tedavi etmek için XYZ tablosunu kullanın ve hücreleri 20 saat daha inkübatöre geri döndürün.
İkinci inkübasyonun sonunda, hücrelere 500 mikromolar Resazurin ile takviye edilmiş 25 mikrolitre taze hücre kültürü ortamı ve ayrıca sadece üç arka plan kontrol Resazurin kuyucuğuna ekleyin. Üç saatlik bir inkübasyon için hücreleri inkübatöre geri koyun. Ardından, bir mikro plaka okuyucuda floresanı ölçün.
Plazma ile muamele edilen hücrelerin görüntülenmesi için, floresanı okuduktan sonra, süpernatantları, mililitre propidyum iyodür başına bir mikrogram ile desteklenmiş 100 mikrolitre taze hücre kültürü ortamı ile değiştirin. Plakayı motorlu bir mikroskop sahnesine yerleştirin ve hücreleri görüntülemek için 20x objektifi seçin. Ardından, her bir kuyucukta görüntülenen tüm görüş alanlarının dijital faz kontrast görüntülerindeki toplam sitozolik alanı belirlemek için uygun kantitatif görüntü analiz yazılımını kullanın.
Plazma ile muamele edilen hücrelerin akış sitometrik analizi için, görüntülemeden sonra, hücreleri her bir kuyucukta iki kez 200 mikrolitre PBS ile yıkayın, yıkama başına kalsiyum ve magnezyum ile yıkayın, ardından mililitre başına 15 anagram anti-fare kalretikülin monoklonal antikoru, 50 mikrolitre PBS'de artı kuyucuk başına kalsiyum ve magnezyum. Hücre kültürü inkübatöründe 15 dakika sonra, hücreleri 200 mikrolitre tam hücre kültürü ortamı ile iki kez yıkayın ve 37 santigrat derecede 20 dakika boyunca her bir oyuğa 100 mikrolitre hücre ayırma çözeltisi ekleyin. Hücreler ayrıldığında, plakayı akış sitometresine yükleyin ve genellikle canlı hücrelerle ilişkili olan ileri ve yan saçılma popülasyonunda en az 1.000 olay elde edin.
Ardından, ilgilenilen popülasyonu belirlemek ve kalretikülin ekspresyonunun ortalama floresan yoğunluğunu belirlemek için uygun akış sitometrisi analiz yazılımını kullanın. Optik emisyon spektroskopisi, farklı besleme gazı koşullarında reaktif plazma bileşenlerine bağlı farklı tepe noktalarını takip etmek için kullanılabilir. Sıvıların plazma muamelesi için, önce argon gazı ve argon plazmasının neden olduğu buharlaşma belirlenir ve plazma aynı zamanda sıcaklık üzerinde de etki gösterdiğinden, koşullar farklı buharlaşma sonuçları verir.
Hidroksil radikalleri için optik emisyon spektroskopisi sonuçlarına benzer şekilde, hidrojen peroksit birikimi oksijen veya nitrojen katkısı ile önemli ölçüde azalır, ancak nemlendirilmiş besleme gazı ile artar. Ayrıca, besleme gazına nitrojen ilavesi, argon plazma ile muamele edilmiş sıvılara kıyasla önemli ölçüde daha yüksek nitrat konsantrasyonlarına yol açar. Çoğu süper oksit, kuru argon gazı koşulları altında, nemlendirilmiş argon oksijen plazmasının varlığı dışında, oksijen ve/veya nitrojen katkıları ile süper oksit oluşumunu önemli ölçüde söndürür.
Resazurin ve plazma ile muamele edilen hücrelerin floresan yoğunlukları, hücre kültürlerinin süpernatantlarında görsel olarak gözlenen fiziksel değişikliklere benzer ve uzun süreli plazma tedavisinin sitotoksik etkilerini doğrular. Plazma işlemine daha kısa süre maruz kalmaya yanıt olarak, miren melanom hücreleri üzerinde kalretikülin lekelenmesinin genel olarak yukarı regülasyonu ile, özellikle nemlendirilmiş besleme gazı koşulları altında, plazma muamelesi numune kuyucuklarında toplam hücre alanında bir azalma da gözlenir. Düzgün bir şekilde yapılırsa, mitoplex hücresel tahliller ve okuma sadece birkaç saat içinde tamamlanabilir.
Bu prosedürü takiben, bağışıklık hücreleri ile ko-kültür veya hücre kültürü süpernatantlarının analizi gibi başka yöntemler de gerçekleştirilebilir. Bu, barajların, sito istemcilerinin veya redux proteinlerinin salınmasının yanı sıra plazma ile tedavi edilen melanom hücrelerinin bağışıklık tarafından tanınması hakkında ek soruların yanıtlanmasına yardımcı olur. Geliştirildikten sonra, bu teknik, örneğin 3D tümör sferoidleri ile melanom döngüleri hakkında daha fazla araştırmanın yolunu açtı.
Bu videoyu izledikten sonra, plazma gazı fazından reaktif moleküller ve sıvılar üzerinden, melanom hücrelerindeki biyolojik tepkilere kadar plazma tıbbında temel araştırmaların nasıl yapılacağını iyi anlamış olmalısınız.
Genel Bakış
Bu makale, sıvıların ve hücrelerin soğuk fiziksel plazma ile tedavisi için yüksek verimli bir protokol sunmakta ve plazmanın in vitro biyolojik yanıtlar üzerindeki etkilerine odaklanmaktadır. Çalışma, işlem sonrası hücresel aktiviteyi analiz etmek için optik emisyon spektroskopisi ve çeşitli analizler kullanmaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Plazma tıbbı
- Hücresel biyoloji
- Biyokimyasal analiz
Arka Plan
- Soğuk fiziksel plazmanın, özellikle kanser tedavisi olmak üzere tıp alanında potansiyel uygulama alanları bulunmaktadır.
- Plazma kaynaklı türlerin anlaşılması, immünojenik hücre ölümünü tetiklemek açısından kritik öneme sahiptir.
- Çalışma, plazma tedavi protokollerinin verimliliğini artırmayı amaçlamaktadır.
- Önceki araştırmalar, plazmanın farklı biyolojik sistemler üzerinde değişken etkiler gösterdiğini ortaya koymuştur.
Çalışmanın Amacı
- Soğuk fiziksel plazmanın oksidantlar ve biyolojik yanıtlar üzerindeki etkilerini araştırmak.
- Verimliliği artırmak amacıyla çok kuyucuklu plakalar kullanan yarı otomatik bir yaklaşım geliştirmek.
- Biyolojik yanıtlarla ilgili plazma kaynaklı türleri tanımlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Plazma türlerini izlemek için optik emisyon spektroskopisi.
- Hücresel yanıtların yüksek verimli analizi için 96 kuyucuklu plakalar.
- Hücre canlılığını ve immünojenik belirteçleri değerlendirmek için akış sitometrisi.
- Tedavi sonrası metabolik aktiviteyi değerlendirmek için floresan ölçümleri.
Ana Sonuçlar
- Plazma işlemi, süperoksit üretimini ve hücre canlılığını önemli ölçüde etkiler.
- Farklı besleme gazı bileşimleri, plazma kaynaklı türlerde farklı sonuçlar verir.
- Floresan yoğunluğu, işlem görmüş hücrelerde gözlemlenen sitotoksik etkilerle korelasyon gösterir.
- Daha kısa plazma maruziyet süreleri, melanoma hücrelerinde kalretikulin ekspresyonunu artırabilir.
Sonuçlar
- Geliştirilen protokol, plazmanın hücreler üzerindeki etkilerinin hızlı bir şekilde değerlendirilmesine olanak tanır.
- Bulgular, plazmanın kanser terapisindeki rolunun anlaşılmasına katkıda bulunur.
- Gelecekteki araştırmalar, ko-kültür sistemlerini ve plazma işlemine tabi tutulmuş hücrelere karşı immün yanıtları inceleyebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Endüstriyel Uygunluğu
Bu yüksek verimli plazma tıp protokolü, reaktif türlerin hücresel yanıtlar üzerindeki etkilerinin sistematik olarak değerlendirilmesine olanak tanıyarak onkoloji ve dermatoloji süreçlerindeki hedef doğrulamasını destekler. Sıvı faz analizini tek bir iş akışında hücresel deneylerle entegre ederek, plazma tabanlı terapötik mekanizmalar için öngörü güvenini artırır. Yarı otomatik 96 kuyucuklu plaka yaklaşımı, erken keşif aşamaları için deney tekrarlanabilirliğini ve ölçeklenebilirliğini geliştirir.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Plazma türevli reaktif türlerin, melanoma hücrelerindeki immünojenik hücre ölümü yolaklarının modülatörleri olarak incelenmesini sağlar.
- Operasyonel Değer: Hedef etkileşimi için optimal reaktif tür profillerini belirlemek amacıyla birden fazla besleme gazı koşulunun paralel olarak test edilmesine olanak tanır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Aynı işlem görmüş hücre popülasyonundan metabolik aktivite, kalretikulin ekspresyonu ve sitotoksik etkilerin kantitatif okumalarını sağlar.
- Operasyonel Değer: Yüksek yoğunluklu formatlarda kuyucuklar arası tutarlı maruziyet için XYZ-tablo konumlandırması aracılığıyla plazma işlemi uygulamasını standartlaştırır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Plazma işlemi parametrelerini, kanser modellerinde immün tanıma ile ilgili biyobelirteç ekspresyonuyla (örneğin kalretikulin) ilişkilendirir.
- Operasyonel Değer: In vivo çalışmalar öncesinde mekanistik risk azaltma için farklı maruziyet süreleri ve gaz bileşimleri genelinde doz-yanıt profillemesini destekler.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Yöntem, plazma karakterizasyonunu (gaz/sıvı fazı) hücresel sonuçlarla ilişkilendirerek, immünomodülatör kanser tedavileri için erken keşiften preklinik geçiş iş akışlarına uyum sağlar.
- Keşif Biyolojisi: Plazma kaynaklı redoks düzenlemesi ve immünojenik hücre ölümü mekanizmaları hakkındaki hipotezleri test eder.
- Tarama: Standartlaştırılmış plazma işlemine tabi kuyucuklardan tekrarlanabilir, çok parametreli analiz okumaları sağlar.
- Analitik: Çok boyutlu yanıt profilleme için optik emisyonlar, floresans, görüntüleme ve akış sitometrisi üzerinden korele veri setleri oluşturur.
- Translasyonel Araştırma: Plazma maruziyet koşullarını, immünojenik potansiyelin bir biyobelirteci olan kalretikulin yükselmesiyle ilişkilendirir.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Çeşitli hücre tipleri ve terapötik bağlamlarda plazma parametrelerini taramak için yeniden kullanılabilir bir platform kurar.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Plazma tarafından üretilen türleri belirli hücresel yolaklarla ilişkilendirerek mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Otomatik plaka işleme ve ardışık analiz yürütme sayesinde işlem kapasitesini artırır ve değişkenliği azaltır.
- Stratejik Değer: İmmünojenik hücre ölümü indüksiyonuna dair erken kanıtlar sunarak karar verme süreçlerini (go/no-go) bilgilendirir.
- Portföy Etkisi: Biyobelirteç ve canlılık sonuçlarına dayanarak plazma formülasyonlarının riske göre ayarlanmış önceliklendirmesini destekler.
Uygulama Hususları
- Plazma fiziği, hücre kültürü ve çok modlu analiz entegrasyonu (spektroskopi, mikroskopi, akış sitometrisi) konularında uzmanlık gerektirir.
- Atmosfer basınçlı plazma jetlerine, XYZ konumlandırma sistemlerine ve 96 kuyucuklu formatlarla uyumlu plak okuyuculara erişime bağlıdır.
- Tekrarlanabilir sonuçlar için plazma uygulama süresinin, gaz karışımının ve analiz sıralamasının ekipler arası standart hale getirilmesini gerektirir.
- Protokollerin, tek tabakalı melanoma kültürlerinin ötesindeki farklı hücre hatlarına veya 3D modellerine aktarılması durumunda adaptasyon değerlendirmelerini içerir.
- Plazma uygulamasının sıvı hacimleri üzerindeki buharlaşma etkileri ve son noktaya özgü analiz optimizasyonu ihtiyacı gibi pratik sınırlamaları kapsar.
